Методические указания мук 2661-10

Скачать 0.78 Mb.

Название	Методические указания мук 2661-10
страница	7/8
Тип	Методические указания

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Методические указания

1 2 3 4 5 6 7 8

Взвесь яиц описторхов в воде предварительно охлаждают до 10-12 град. С (все последующие операции осуществляют при комнатной температуре 19-20 град. С). В центрифужную пробирку вносят 1 каплю взвеси, содержащую 100-150 яиц. Пробирку ставят в штатив на 5-10 мин. За это время все яйца успевают опуститься на дно. Затем полоской фильтровальной бумаги осторожно отсасывают излишек воды и в пробирку добавляют 2 капли специальной среды. Среду готовят на 0,005 М Трис-НС1 буфере: в буфер добавляют 12-13% раствор этанола и краситель (фуксин, сафранин, эозин, метиленовый синий и т.д.). Пробирку встряхивают, ее содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 10 мин., слегка покачивая. Затем на стекло добавляют еще 2 капли указанной среды и микроскопируют при 20-кратном увеличении.

За это время у жизнеспособных личинок открывается крышечка, и мирацидий активно выходит в указанную среду. Благодаря наличию в ней этанола, они через 2-5 мин. обездвиживаются и затем окрашиваются с помощью красителя. Их легко можно обнаружить при микроскопировании и произвести подсчет.
16. Методы экспериментального изучения сроков развития

и выживаемости возбудителей паразитозов

в окружающей среде
16.1. Выживаемость яиц гельминтов в различных условиях

окружающей среды
При изучении сроков развития и выживаемости яиц гельминтов требуется проведение специальных экспериментов с искусственной закладкой проб на различных объектах окружающей среды. Опыты необходимо проводить, с одной стороны, в условиях наиболее приближающихся к естественным, а с другой, при которых пробы с яйцами гельминтов сохранялись бы в окружающей среде и их легко было бы извлекать для исследования в любые сроки.

16.1.1. Почва как среда обитания возбудителей паразитозов. На поверхности почвы закладку яиц гельминтов проводят одним из следующих способов:

а) на предварительный фильтр наносят не менее 1000 яиц гельминтов и покрывают его другим таким же фильтром, края которых загибают конвертами, после чего их укладывают на полосы плотного мельничного газа и прошивают. Расстояние между соседними фильтрами должно быть не менее 10 см, чтобы при извлечении конца ленты и забора для исследования 1-2 фильтров не нарушать другие; мельничный газ с пробами укладывают на поверхность опытного участка, а затем отбирают пробы для исследования;

б) на поверхности участка в почву на глубину 2-3 см вдавливают кювет из металлической сетки так, чтобы края его были на 2-3 мм выше ее поверхности. Кювет засыпают исследуемой почвой и обсеменяют яйцами гельминтов (из расчета не менее 1000 на 1 кв. см). И в том, и в другом случае пробы для исследования отбирают: весной и осенью 1 раз в 10 суток, летом через каждые 3-5 суток, зимой 1 раз в месяц.

При изучении сроков выживаемости яиц гельминтов в почве на разных глубинах (5, 10, 20, 40, 60 см) закладку их целесообразно проводить в специальных пробах.

В опытах применяют яйца тех видов гельминтов, которые представляют наибольшую эпидемиологическую опасность в данной местности. Если нужно установить максимальные сроки выживаемости яиц гельминтов, целесообразно ставить опыты с яйцами аскарид. При этом могут быть использованы как яйца А. lumbricoides, так и А. suum, полученные из рогов матки аскариды, прилегающих к вагине не далее 1-1,5 см, а также из фекалий с высокой интенсивностью инвазии (не менее 2-3 яиц гельминтов в поле зрения).

Получение чистой взвеси яиц аскарид: порцию фекалий (объемом в столовую ложку) помещают в центрифужную пробирку объемом 150-250 мл (лучше в пробирку объемом 250 мл) и заливают водопроводной водой (30-120 мл), после чего смесь тщательно размешивают палочкой до образования гомогенной массы и центрифугируют в течение 2-3 мин. при скорости 800 об./мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют такую же порцию чистой воды; смесь снова размешивают и центрифугируют.

Промывание повторяют не менее 2-3 раз. Затем к осадку добавляют насыщенный раствор натрия хлорида (плотность 1,2), смесь размешивают, всплывшие крупные частицы снимают, а смесь центрифугируют 2-3 мин. и петлей с поверхности раствора снимают пленку. Эти операции повторяют до тех пор, пока в контрольной капле, взятой на предметное стекло, будут попадаться лишь единичные яйца гельминтов. Затем начинают второй этап - выделение яиц гельминтов из слабого раствора соли.

Содержимое сосудов отстаивают в течение 2-3 ч., после чего надосадочную жидкость сливают, а осадок фильтруют через 4-5 слоев марли или мелкоячеистую сетку на часовые стекла диаметром 10-15 см. Легкими круговыми движениями производят закручивание осадка к центру часового стекла, а оставшуюся по периферии жидкость отсасывают пастеровской пипеткой с резиновой грушей. На часовые стекла добавляют небольшое количество воды, смесь снова размешивают и закручивают к центру стекла: такую операцию повторяют до тех пор, пока на стекле не будет чистая взвесь яиц гельминтов. Контроль чистоты взвеси яиц гельминтов проводят под микроскопом. Полученную чистую взвесь переносят в стеклянные бюксы с крышкой, этикетируют и помещают на хранение в холодильник.

Приготовление тест-объектов. Для приготовления тест-объектов используют крупные алюминиевые или пластмассовые бигуди, применяемые для завивки волос. Такой каркас удобен тем, что со всех сторон доступен для почвенного воздуха, влаги, почвы; кроме того, он может долго пролежать в земле, а при выкапывании предохраняет пробу почвы от разрушения. Каркас взвешивают, заполняют исследуемой почвой и снова взвешивают, по разности полученных показателей определяют массу почвы.

Через отверстия в бигуди в почве делают несколько углублений (в разных местах), в которые вносят с помощью пипеток необходимое количество капель раствора с взвесью яиц гельминтов так, чтобы на 1 г почвы их приходилось не менее 1000. Среднее количество яиц гельминтов в одной капле определяют следующим образом: на предметное стекло наносят 5-10 капель хорошо перемешанной взвеси. Под микроскопом подсчитывают их количество в каждой капле, суммируют и делят на число капель.

Необходимое для внесения в тест-объект количество капель взвеси определяют по формуле:
n = (P1 - P0) x 1000/K, где
n - число капель суспензии из яиц гельминтов;

P0 - масса упаковки-контейнера без почвы;

P1 - масса упаковки с почвой;

K - среднее число яиц гельминтов в 1 капле;

1000 - содержание яиц гельминтов в 1 г почвы после обсеменения.
После внесения взвеси яиц гельминтов углубления в каркасе заполняют почвой. Тест-объект заворачивают в мельничный газ, после чего к нему прикрепляют проволоку длиной на 5-10 см больше глубины закладки их в почву. После помещения тест-объектов в почву на концах проволоки, выведенных наружу, устанавливают опознавательные знаки. Лучше всего пробы (тест-объекты) готовить в лаборатории и хранить до постановки опыта в холодильнике.

Для закладки тест-объектов на выбранных участках выкапывают ямы шириной 1,0-1,2 м. Длину их рассчитывают в каждом конкретном случае отдельно (в зависимости от количества испытуемых проб). На дно ям укладывают пробы (тест-объекты) на расстоянии 20-30 см друг от друга; ямы засыпают сначала той почвой, которая выбрасывалась последней при копке ям; на поверхности полученных грядок устанавливают опознавательные знаки.

Количество тест-объектов должно быть рассчитано на длительный период наблюдения (7-10 лет), выемку их для исследования производят в зависимости от климата, характера почв и глубины закладки - не реже 1 раза в месяц при исследовании тест-объектов с глубины до 20 см и не реже 1 раза в квартал при более глубоких закладках. Учитывая, что тест-объекты для исследования можно забирать (для средней полосы России) только с апреля по октябрь, т.е. в течение 7 месяцев, легко подсчитать число тест-объектов, необходимых для закладки на ту или иную глубину (на глубину 5, 10, 20 см в среднем 49-70 штук; на глубину 40 и 60 см - 21-30 штук).

По опознавательным знакам определяют места нахождения тест- объектов, выкапывают ямы размером 30x30 см так, чтобы между стенкой ямы и ближайшим тест-объектом был оставлен слой почвы не менее 10 см. Изъятые из почвы тест-объекты помещают в пакеты из бумаги или полиэтилена и доставляют в лабораторию для исследования. При определении стадии развития или признаков деформации в каждом опыте необходимо просматривать не менее 100-200 яиц гельминтов.

Для изучения сроков развития и выживаемости личинок анкилостомид и стронгилид в почве рекомендуется следующая методика: фекалии, содержащие яйца анкилостомид, смешивают с почвой в пластмассовых кюветах (на дне которых просверлены отверстия; последние помещают в почву экспериментальных участков на 7-10 дней и ведут ежедневно отбор проб обсемененной почвы для исследования по методу Бермана. Поиск проводят до тех пор, пока вылупившиеся из яиц личинки не достигнут инвазионной стадии, а затем погибнут.

16.1.2. Вода как среда обитания возбудителей паразитозов. Для изучения сроков выживаемости яиц гельминтов в воде несколько капель насыщенной взвеси их (не менее 1000) наносят пипеткой на планктонные фильтры, сложенные воронками. Для устойчивости воронки помещают в штатив из небольшой картонной крышки, в которой сделаны ячейки. После внесения яиц края воронок загибают и вместе с этикетками, указывающими даты и номера опытов, помещают по 2-3 экземпляра в стеклянные трубки. Наиболее удобными являются трубки длиной около 7 см, диаметром 2 см с небольшими раструбами, за которые с обеих сторон закрепляют сатин при завязывании отверстий трубок.

В металлическую сетку заворачивают по 3-4 трубки и на капроновом шнуре опускают в воду. Если пробы намечено поставить в местах с быстрым течением воды, для удержания проб на необходимой глубине к сетке подвешивают дополнительный груз. Серия из 3-4 трубок, связанных вместе, составляет 1 опыт. Часть трубок подвешивают у дна, остальные на различном расстоянии от него. Для просмотра берут по 1 трубке из каждого опыта. Подсчитывают не менее 200 яиц, смытых с фильтра на предметное стекло.

16.1.3. Твердые поверхности как среда обитания возбудителей паразитозов. Яйца гельминтов (не менее 1000) наносят непосредственно на исследуемые поверхности (в т.ч., овощей, плодов и пр.). Сроки их нахождения на поверхностях определяют временем роста последних. Опытные поверхности помечают, а через определенные временные интервалы смывы с них забирают на исследование, помещают на фильтр. С мягкой поверхности (овощи) пробу отбирают скальпелем на фильтр и помещают во влажную камеру для развития их в оптимальных лабораторных условиях.

Наблюдения показали, что яйца гельминтов на овощных поверхностях, не защищенных листьями, смываются дождем. Поэтому взвесь яиц гельминтов целесообразно помещать на фильтрах, которые с помощью ниток крепко фиксируют на поверхности овощей. Для исследования берут не менее 3 фильтров, в каждом из них просматривают не менее 200-300 яиц гельминтов, определяя их стадию развития или признаки деформации.
16.2. Выживаемость цист кишечных простейших в различных

условиях окружающей среды
16.2.1. Почва как среда обитания простейших. Для проведения экспериментальных исследований по изучению сроков выживаемости цист патогенных кишечных простейших следует использовать цисты лямблий. При наличии одинаковых микроклиматических условий в окружающей среде, цисты лямблий не отличаются по своей устойчивости от таковой цист дизентерийных амеб. Цисты лямблий выделяют из фекалий больных людей методом механического обогащения.

Для проведения опытов из взвеси цист лямблий готовят специальные тест-объекты: на мембранные фильтры N 4 или 6 наносят 0,2 мл взвеси, содержащей не менее 4-5 тысяч жизнеспособных цист. Фильтры складывают по типу конверта и помещают в капроновые мешочки размером 3x2,5 см, которые вкладывают в среднюю, нижнюю и верхнюю части перфорированных алюминиевых трубок длиной 10 см, диаметром 2x2,5 см, содержащих почву с подопытных участков. Трубки с пробами цист кишечных простейших размещают на расстоянии 8-10 см друг от друга в алюминиевой сетке сечением 30x50 см и высотой 7-10 см, которая предварительно заполняется почвой с подопытного участка. Сетку закапывают в почву на такую глубину, чтобы верхний конец алюминиевых трубок находился на уровне поверхности почвы. Сетку засыпают сверху тонким слоем почвы подопытного участка.

Трубки с пробами цист кишечных простейших вынимают из почвы и доставляют в лабораторию для исследования 1 раз в неделю. Извлеченные из трубок капроновые мешочки ополаскивают чистой водой. Жизнеспособные и погибшие цисты кишечных простейших, содержащиеся на мембранных фильтрах, могут быть идентифицированы под люминесцентным микроскопом при помощи акридинового оранжевого. На предметное стекло наносят каплю 0,1-0,2%-го водного раствора акридинового оранжевого и делают отпечаток с развернутого фильтра, извлеченного из капронового мешочка. Тщательно смывают красителем с фильтра взвесь цист. Полученную на предметном стекле смесь накрывают покровным стеклом и спустя 30-45 мин. исследуют под люминесцентным микроскопом.

У живых цист наблюдается свечение оранжевым цветом оболочки, а цитоплазма не прокрашивается. Цитоплазма и оболочка у погибших цист окрашивается в красный или красно-оранжевый цвет.

При отсутствии в лаборатории люминесцентного микроскопа идентификацию жизнеспособных и нежизнеспособных цист кишечных простейших осуществляют под световым микроскопом в препаратах, окрашенных акридиновым оранжевым. Препараты готовят в этом случае по той же методике, что и при люминесцентной микроскопии. Под световым микроскопом жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а мертвые приобретают желтую окраску.

Для определения соотношения между жизнеспособными и нежизнеспособными цистами достаточно подсчитать их число в 3-5 рядах покровного стекла. Число жизнеспособных и погибших цист, содержащихся в исследуемой пробе, определяют по формуле:
Х = А x В x Д,
где:

X - число живых или погибших цист соответствующего вида кишечных простейших, содержащихся в пробе;

А - число цист, обнаруженных в 1 ряду под покровным стеклом;

В - число рядов покровного стекла, которое было использовано для подсчета цист;

С - число капель в 1 мл смыва;

Д - объем смыва с мембранного фильтра (мл).
О динамике отмирания цист судят по изменению количественного соотношения между жизнеспособными и погибшими цистами.

16.2.2. Сточные воды как среда обитания простейших. Первый этап приготовления тест-объектов в мембранных фильтрах, вложенных в капроновые мешочки, остается таким же, как и при определении сроков выживаемости цист кишечных простейших в почве. Затем мешочки перевязывают сверху нитками и погружают в пробирки высотой 10-15 см, диаметром 2 см. В пробирки наливают изотонический раствор натрия хлорида для предупреждения гибели цист до момента погружения пробирок в сточную воду. Для того, чтобы предупредить всплывание в пробирке мешочков с пакетиками исследуемого материала, в них вкладывают кусочки гранита величиной с фасоль. Пробирки с исследуемым материалом помещают в перфорированные жестяные банки, к которым прикрепляется тонкая медная проволока. Перед погружением банок в исследуемую сточную воду изотонический раствор натрия хлорида из пробирок удаляют. Банки с пробками фиксируют при помощи проволоки в условиях опытной канализационной установки. Пробы для исследования извлекают 1 раз в неделю и обрабатывают по той же методике, что и почву.

16.2.3. Твердые поверхности как среда обитания простейших. Обогащенную взвесь цист кишечных простейших объемом 0,2 мл наносят тонким слоем на поверхность опытных образцов, которые помещают в емкости, позволяющие активно регулировать температуру и относительную влажность воздуха. В качестве таких емкостей можно использовать термостат и холодильник, необходимая температура в которых устанавливается при помощи терморегуляторов. Обеспечение необходимой влажности воздуха достигается путем помещения в указанные емкости соответствующего количества чашек Петри с дистиллированной водой, в которой увлажняются полоски из марли. Выживаемость цист целесообразно изучать при температуре 2-6 град. С и 18-21 град. С, относительной влажности воздуха 40-65% и 80-100%. Определение температуры и относительной влажности воздуха производят при помощи термовлагобарометра БМ-2.

1 2 3 4 5 6 7 8

	Методические указания мук 2661-10 Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия...		Методические указания мук 3007-12 Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический...
	Методические указания мук 2429 08 Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия...		Методические указания мук 2429 08 Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия...
	Методические указания методические указания разработаны: Федеральной... Му 3011-12. Дезинфектология. "Неспецифическая профилактика клещевого вирусного энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов". Методические...		Методические указания по курсовому проектированию по дисциплине «Проектирование... Электронный ресурс]: методические указания / О. Ф. Абрамова// Сборник «Методические указания» Выпуск. Электрон текстовые дан.(1файл:...
	Методические указания му 1891-04 Организация работы прививочного... Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы и лечебно-профилактических...		Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Методические указания предназначены для студентов факультета заочного социально-экономического образования специальности 040101....
	Методические указания doc Методические указания по выполнению лабораторно... Данные методические указания для студентов являются частью учебно-методического комплекта по пм 01. «Техническое обслуживание и ремонт...		Методические указания му 2… Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов. Методические указания. 2009. 66 с
	Методические указания для обучающихся Методические указания рассмотрены и утверждены на заседании кафедры от 23. 03. 2015 протокол №11		Методические указания по изучению учебной дисциплины Методические указания предназначены для преподавателей русского языка и литературы профессиональных образовательных организаций
	Методические указания по выполнению практических работ адресованы... Методические указания для выполнения практических работ являются частью основной профессиональной образовательной программы огбоу...		Методические указания по проведению практических занятий Методические указания рассмотрены и одобрены на заседании пцк по укрупненной группе 140000 Электроснабжение (нпо и спо)
	Методические указания к лабораторной работе Барнаул 2008 ...		Методические указания му 1252-03 Методические указания предназначены для специалистов санитарно-эпидемиологической службы и лечебно-профилактических организаций,...

Методические указания мук 2661-10

Похожие: