|
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ЛИМНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
На правах рукописи
Петунина Жанна Владимировна
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МИКРОСПОРИДИЙ И ИХ ХОЗЯИНА – БАЙКАЛЬСКОЙ АМФИПОДЫ GMELINOIDES FASCIATUS
03.02.08 – экология
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель
доктор биологических наук
Д.Ю. Щербаков
Иркутск, 2014
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 16
1.1. Амфиподы озера Байкал 16
1.1.1. Роль амфипод в экосистеме озера Байкал 17
1.1.2. Эволюция амфипод в озере Байкал 19
1.1.3. Байкальская амфипода Gmelinoides fasciatus 22
1.2. Популяционные процессы и факторы, влияющие на генетическое разнообразие популяции 28
1.3. Механизмы видообразования. Аллопатрическое и парапатрическое видообразование. Экология и видообразование 34
1.3.1. Следы демографических изменений в популяциях 43
1.4. Паразиты как один из возможных факторов симпатрического или парапатрического видообразования 51
1.4.1. Соотношение разнообразия паразитов и хозяев в экосистемах 60
1.4.2. Коэволюция паразита и хозяина 61
1.5. Микроспоридии 64
1.5.1. Общая характеристика микроспоридий 65
1.5.2. Филогения микроспоридий 67
1.5.3. Инфицирование 71
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 74
2.1. Сбор материала 74
2.2. Экстракция ДНК 78
2.3. Молекулярные методы диагностики микроспоридий 79
2.4. Амплификация ДНК 80
2.5. Методы очистки амплифицированных фрагментов 81
2.6. Определение нуклеотидной последовательности 82
2.7. Оценка генетического разнообразия популяций 82
2.8. Филогенетический анализ 85
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 87
3.1. Популяционная структура G. fasciatus озера Байкал 88
3.2. Основные характеристики популяций G. fasciatus 95
3.3. Демографическая история популяций G. fasciatus 98
3.4. Микроспоридии и их разнообразие у G. fasciatus 106
3.5. Микроспоридии юго-западной популяции G. fasciatus 111
3.6. Возможная роль микроспоридий в формировании межпопуляционных барьеров у G. fasciatus 112
Заключение 116
ВЫВОДЫ 118
Список используемой литературы 120
Список используемых в работе сокращений
БТШ – белок теплового шока
ВИЧ – вирус иммунодефицита человека
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
мтДНК – митохондриальная ДНК
п.н. – пар нуклеотидов
ПЦР – полимеразная цепная реакция
рДНК – рибосомальная ДНК
РНК – рибонуклеиновая кислота
рРНК – рибосомальная РНК
СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита
ТЭМ – трансмиссионный электронный микроскоп
ЦТАБ – цетилтриметиламмоний бромид
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭР – эндоплазматический ретикулум
СО1 – ген, кодирующий первую субъединицу митохондриальной цитохром с-оксидазы
EF – фактор элонгации (translation elongation factor)
RPB1 – большая субъединица РНК-полимеразы II (the largest subunit of RNA
polymerase II)
rRNA – рибосомальная РНК
sHSP – малые белки теплового шока
SSU – малая субъединица рРНК (small subunit)
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы
Исследование экологических обстоятельств видообразования абсолютно необходимо для понимания движущих сил эволюции. Как отмечал С.С.Четвериков (1983) – «В эволюционном развитии органического мира протекают два процесса: (1) дифференциация, распадение, приводящая, в конце концов, к видообразованию, - в основе его лежит изоляция; (2) другой ведет к адаптации, к прогрессивной эволюции органической жизни и причиной его является борьба за существование и вытекающий из нее естественный отбор [100]. Роль внешних факторов в эволюции организмов выступает в высшей степени ясно. Для каждого конкретного организма изменялось не только физическое его окружение, изменялся комплекс организмов (биоценоз), с которым он связан как непосредственной пищевой связью (пищевой материал, с одной стороны, и хищники, и паразиты с другой), так и различными формами конкуренции и другими косвенными зависимостями. Это изменение биотических факторов среды являлось решающим для существования тех или иных форм жизни, оно непосредственно определяло преобразование организмов и, в частности, влияло на темп их эволюции» [103].
Одним из самых богатых возможностями объектов такого рода исследований является озеро Байкал – уникальный водоем нашей планеты по многим характеристикам: древний возраст, большие глубины, низкие температуры, огромные объемы пресной воды, толщина донных осадков, уровень эндемизма и высокое разнообразие флоры и фауны [44, 45, 46, 97, 98, 140, 141]. Эволюционные события, сформировавшие современное разнообразие населения озера, разворачивались в широких пределах – от 10 до 70 млн. лет [20, 23, 54, 61, 99, 273, 286]. В Байкале по данным на 2001 год описано 2570 видов и подвидов животных, из которых большинство составляют эндемики [38]. Таким образом, Байкал превосходит другие древние пресноводные озера мира по видовому разнообразию и уникальности его обитателей [98, 140, 141, 283, 284].
Объяснение механизмов, которые создали в относительно ограниченной экосистеме такое колоссальное разнообразие жизни, важно не только для познания Байкала, но и для общей теории видообразования.
Амфиподы – один из наиболее интересных элементов байкальской фауны, в виду того, что они относятся к группам с наиболее глубоко выраженным эндемизмом из байкальских обитателей [44, 45, 46, 97, 98, 140, 141, 303], число их насчитывает более 347 видов из 71 рода [38, 93]. Объяснение механизма возникновения и поддержания такого большого количества видов является одной из основных задач исследования озера.
Особый интерес вызывает разнообразие паразитов, инфицирующих амфипод [52, 79, 82]. Являясь промежуточными хозяевами некоторых видов паразитов, они потенциально открывают путь для проникновения паразитических видов-палеарктов в экосистему озера. С этим же связаны уникальные случаи усложнения жизненных циклов паразитов, не присущие им в других водоемах [52].
Для экосистемы Байкала характерны паразиты, развивающиеся без промежуточных хозяев (63% видов). Например, фауна паразитов рыб Байкала выглядит обедненной в сравнении с таковой водоемов Европы и Западной Сибири, за счет отсутствия в озере ряда специфичных паразитов. В отличие от рыб-хозяев, с весьма высокой долей эндемиков (56%), у паразитов отмечено только 15,7% эндемичных видов и подвидов. Это свидетельствует о разных темпах видообразования у паразитов, в сравнении с другими группами, эндемизм которых составляет 56 – 100% (рыбы, моллюски, ракообразные) [85].
Паразитофауна беспозвоночных Байкала изучена слабее, чем фауна хозяев. Не полностью учитывается потенциальное разнообразие симбионтов и паразитов ряда таксономических групп беспозвоночных гидробионтов.
Паразиты составляют существенную долю в видовом разнообразии практически любой экосистемы. Более того, они могут принимать участие в видообразовательных процессах у хозяев [139, 142, 143]. Обычно число видов паразитов равно, либо сопоставимо с числом видов хозяев, населяющих данную экосистему [191, 234]. Известное к настоящему времени разнообразие паразитов в Байкале является в этом смысле исключением, поскольку в Байкале существует выраженный дефицит таксономического разнообразия паразитов, и еще больший дефицит разнообразия видоспецифических паразитов [76, 77, 78, 80, 84, 86].
Недавно было показано [259, 320], что микроспоридии, известные в Байкале с шестидесятых годов [268, 269], представлены у байкальских амфипод исключительно большим количеством видов (рис.1), которое, потенциально, может заполнить дефицит разнообразия паразитов. Однако остается неясным вопрос о видовой специфичности микроспоридий, и связанный с ним вопрос о возможном участии этих паразитов в эволюционных процессах у хозяев.
В качестве объектов исследования выбрали представителя фауны амфипод Байкала – вид Gmelinoides fasciatus (Stebbing, 1899) [9, 10, 57, 65] и внутриклеточных паразитов, принадлежащих к микроспоридиям (Microsporidia (Balbiani, 1882)). Последние сдвигают равновесие полов с помощью феминизации, самцовой смерти или стимулируют партеногенез. Изменяют они также и экологические параметры хозяев [173]. Характер качественного и количественного распределения их между геномами хозяина может отражать эволюционные события и/или механизмы, которые привели к существующей популяционной структуре вида-хозяина. Для байкальских амфипод они могут служить «катализаторами видообразования».
Микроспоридиоз [409] относится к таким заболеваниям человека как оппортунистические инфекции при СПИДе (синдром приобретенного иммунодефицита). Механизм заражения микроспоридиозом мало изучен. Лечение микроспоридиоза не разработано. Чаще всего микроспоридиоз встречается у ВИЧ-инфицированных (вирус иммунодефицита человека),
Рис. 1. Филогенетическое древо основных видов микроспоридий.
Цветом показана территориальная принадлежность образцов: синий – Байкал, Россия; розовый – Европа; красный – Северная Америка; зеленый – Австралия [259, 261].
реже при иммунодефицитах иной этиологии и совсем редко – на фоне нормального иммунитета. На настоящий момент обнаружено более 14 видов [164], инфицирующих человека и приводящих к длинному списку заболеваний, включая хроническую диарею и потенциально летальную диарею, кератоконъюнктивит, пневмонию, бронхит, нефрит, уретрит, простатит, гепатит, энцефалит, мастит и перитонит. Чтобы понять, насколько он опасен, в том числе и для человека, необходимо хорошо знать распределение возбудителя.
Методы молекулярной систематики, основанные на сравнительном анализе гомологичных последовательностей ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), успешно применяются для диагностических целей, видовой идентификации и бесценны для таксономической классификации и филогенетического анализа микроспоридий [408]. Эти же современные методы применяются и для исследования их внутривидового полиморфизма.
Настоящая работа посвящена изучению внутривидовой генетической структуры амфиподы Gmelinoides fasciatus и возможному влиянию микроспоридий на эволюцию этого вида.
Цели и задачи исследования
Цель настоящего исследования – выявление взаимосвязи между разнообразием видов микроспоридий и внутривидовым разнообразием хозяина, G. fasciatus, в Байкале. Согласно поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Определить пространственно-генетическую неоднородность внутри вида Gmelinoides fasciatus в Байкале по фрагментам митохондриальной ДНК (мт ДНК).
Установить видовое разнообразие микроспоридий, паразитирующих на различных популяциях G. fasciatus, по фрагменту гена малой субъединицы рибосомальной ДНК (рДНК).
Определить степень зараженности различных популяций.
Оценить возможную роль микроспоридий во внутривидовой изоляции G. fasciatus.
Научная новизна
Впервые подробно исследована пространственно-генетическая неоднородность байкальского вида G. fasciatus с помощью методов молекулярного анализа. Установлено подразделение вида как минимум на четыре популяции: юго-западную, северную, центральную, юго-восточную.
Выявлено низкое генетическое разнообразие юго-западной популяции G. fasciatus по исследованному митохондриальному локусу СО1 (первая субъединица цитохромоксидазы с). Предложена гипотеза «бутылочного горлышка» для юго-западной популяции. Установлено, что исток Ангары является частично изолирующим барьером для субпопуляций юго-западной популяции G. fasciatus.
Установлена скорость накопления замен для фрагмента митохондриального гена первой субъединицы цитохром-с-оксидазы G. fasciatus.
Впервые реконструирована демографическая история исследованных популяций.
Выявлено большое разнообразие видов микроспоридий в пределах одного исследуемого байкальского вида амфипод, G. fasciatus. Установлен видовой состав, частота встречаемости микроспоридий во всех четырех популяциях хозяина, а так же присутствие коинфицирования в юго-западной популяции G. fasciatus.
Среди паразитов Microsporidia встречаются не только виды-палеаркты, но и космополитные виды, поскольку паразиты распространяются очень легко. В данном исследовании у G. fasciatus обнаружены популяционно специфические паразиты наряду с Dictyocoela duebenum, который является широко распространенным.
Подробное исследование амфиподы G. fasciatus показало относительно высокое видовое разнообразие паразитирующих на ней микроспоридий. Число видов паразита превышает таковое хозяина.
Практическое значение работы
Результаты исследования могут быть использованы для моделирования макро- и микроэволюционных процессов формирования репродуктивной изоляции и видового разнообразия. Полученные данные могут помочь в развитии общей теории видообразования амфипод озера Байкал.
Нуклеотидные последовательности фрагмента гена СО1 мтДНК депонированы в GeneBank с номерами доступа: FJ715824 – FJ715919. Нуклеотидные последовательности фрагмента гена малой субъединицы рДНК микроспоридий депонированы в GenBank с номерами доступа: FJ820187 – FJ820237.
Материалы диссертационной работы могут быть привлечены для установления естественных резервуаров микроспоридий и циркуляции их в Байкале.
Результаты проведенных исследований используются в курсе лекций по генетике на биолого-почвенном факультете Иркутского государственного университета.
Защищаемые положения
Байкальский вид Gmelinoides fasciatus образует четыре непрерывные популяции по берегам Байкала. Границы между популяциями не всегда соответствуют географической подразделенности озера.
Юго-восточная популяция G. fasciatus является предковой для трех других популяций этого вида амфипод.
Демографическая история юго-западной популяции резко отличается от истории остальных байкальских популяций. Предложена гипотеза «бутылочного горлышка».
G. fasciatus заражен шестью видами микроспоридий. Один из них, Dictyocoela duebenum, обнаружен во всех популяциях.
Юго-западная популяция отличается присутствием всех видов паразита, характерных для G. fasciatus, а также наличием двойного заражения, несмотря на относительно небольшую частоту встречаемости микроспоридий в этой популяции (32,18%).
Качественное и количественное распределение паразитов в популяциях G. fasciatus указывает на весьма вероятную причастность микроспоридий к формированию и/или поддержанию межпопуляционных барьеров у G. fasciatus.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на Всероссийской научно-практической конференции «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе», Иркутск, 2003. На 12-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI век», Пущино, 2008. На II Всероссийской научно-практической конференции «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе», Иркутск, 2008. На 5-ой Международной конференции «Speciation In Ancient Lakes», Македония, Охрид, 2009 и 6-й Международной конференции «Speciation In Ancient Lakes», Богор, Индонезия, 2012. На III Международном симпозиуме «Invasion of alien species in Holartic» (Борок, 2010). На III Международной конференции «MolPhy-3» (Москва, 2012).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 в отечественном и 1 в международном рецензируемом журнале.
Гоманенко Г.В. Филогения основных семейств амфипод / Г.В. Гоманенко, Р.М. Камалтынов, Т.И. Трибой, Ж.В. Кузьменкова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2003. – № 7. – С. 128–129.
-
Гоманенко Г.В. Популяционная структура байкальского бокоплава Gmelinoides fasciatus (Stebbing) / Г.В. Гоманенко, Р.М. Камалтынов, Ж.В. Кузьменкова, Camillo Berenos, Д.Ю. Щербаков // Генетика. – 2005. – Т. 41. – № 7. – С. 1–6.
Gomanenko G.V. Population structure of the Baicalian amphipod Gmelinoides fasciatus (Stebbing) / G.V. Gomanenko, Zh.V. Kuzmenkova [et al.] // Rus. J. Genetics. – 2005. – V. 41. – № 8. – P. 907–912.
Кузьменкова Ж.В. Разнообразие микроспоридий, паразитирующих на байкальских амфиподах Gmelinoides fasciatus из разных популяций / Ж.В. Кузьменкова, Д.Ю. Щербаков, Д.Э. Смит // Известия Иркутского государственного университета. – 2008. – Т. 1. – № 2. – С. 56–61.
Кузьменкова Ж.В. Роль микроспоридий в эволюции байкальской амфиподы Gmelinoides fasciatus (Stebbing) / Ж.В Кузьменкова, Д.Э. Смит, Д.Ю. Щербаков // 12-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI век»: Сборник тезисов (Пущино, 10-14 ноября 2008 г.). – Пущино, 2008. – С. 302–303.
Fazalova V. Signals of differential impact of environmental changes on demographic histories of invertebrates from Lake Baikal / V. Fazalova, B. Nevado, T. Peretolchina, Z. Kuzmenkova, D. Sherbakov // SIAL 5: Book of abstracts (Ohrid, 7-11. 09. 2009). – Ohrid, 2009. – P. 24–25.
Kuzmenkova J.V. Microsporidian parasites of Gmelinoides fasciatus (Stebbing) in Lake Baikal, Siberia: possible mechanism of parasite driven host speciation / J.V. Kuzmenkova, Y. Qiu, D.Y. Sherbakov, J.E. Smith // SIAL 5: Book of abstracts (Ohrid, 7-11. 09. 2009). – Ohrid, 2009. – P. 57–59.
Malavin S.A. Phylogenetic interrelationship of three introduced populations of Gmelinoides fasciatus (Stebbing, 1899) (Crustacea: Amphipoda) inferred from molecular data / S.A. Malavin, Zh.V. Petunina, D.Yu. Sherbakov // III International Symposium «Invasion of alien species in Holartic». – Borok, 2010. – P. 68–69.
Fazalova V. When environmental changes do not cause geographic separation of fauna: differential responses of Baikalian invertebrates / V. Fazalova, B. Nevado, T. Peretolchina, J. Petunina, D. Sherbakov // BMC Evolutionary Biology. – 2010. – № 10. – P. 320.
Petunina J.V. Population structure and demographic history of Gmelinoides fasciatus (Stebbing, 1899) from Lake Baikal and Angara River / J.V. Petunina, D.Y. Sherbakov // SIAL 6: Book of abstracts. – Bogor, 2012. – P. 57–59.
Petunina J.V. Population structure of Gmelinoides fasciatus (Stebbing, 1899) from Lake Baikal and Angara River / J.V. Petunina, D.Y. Sherbakov, R.M. Kamaltynov // MolPhy-3: Contributions to the 3rd Moscow International Conference “Molecular Phylogenetics” – Moscow, 2012. – P. 64–65.
Благодарности
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю – д.б.н. Щербакову Д.Ю. за руководство в работе, а также коллегам из лаборатории геносистематики ЛИН СО РАН, особенно Букину Ю.С. за ценные консультации и поддержку на всех этапах подготовки диссертационной работы. Автор признателен Гоманенко Г.В. за помощь при исследовании, Тахтееву В.В. и Кондратову И.Г. за ценные замечания по материалам диссертации. Огромную благодарность автор выражает Камалтынову Р.М. за помощь и консультации при определении видов амфипод, за ценные замечания по материалам диссертации. Большое спасибо моей семье за понимание и поддержку.
Исследование выполнялось при частичной поддержке грантов РФФИ (№ 03-04-63157к, 04-04-48970, 04-04-48945а, 04-04-48549; 07-04-01410-а, 09-04-09436-моб_з), гранта Marie Curie Fellowship 2008 г., гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры …» (2009 – 2013) «Исследование динамики популяций байкальских организмов» (соглашение от 23.07.2012 г. № 8099).
Структура и объем диссертации
Работа включает следующие разделы: введение, литературный обзор, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список используемой литературы (415 ссылок). Диссертация изложена на 158 страницах, содержит 19 рисунков и 11 таблиц.
|
