Практикум по ветеринарной микробиологии

Скачать 3.35 Mb.

Название	Практикум по ветеринарной микробиологии
страница	2/27
Тип	Учебники и учебные пособия

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Учебники и учебные пособия

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 27

Тема 1. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

При выполнении любых микробиологических исследований необходимо точно знать особенности строения микроорганизмов. Эти сведения могут быть получены только путем изучения данного организма с помощью микроскопа. Первый простейшего устройства оптический микроскоп был сконструирован Антони ван Левенгуком (рис. 1).

В настоящее время многие вопросы цитологии микробов решаются на уровне электронной микроскопии. Это, однако, не значит, что традиционная микроскопия в видимом свете потеряла свое значение. Первоначальный подсчет количества микроорганизмов, первичная их идентификация, изучение роста и отдельных элементов структуры производят с помощью светового микроскопа. Микробиологические лаборатории оснащены микроскопами различных моделей: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, «Биолам», Р-1 и др. Микроскопированием определяют морфологические особенности микроорганизмов, их тинктори-альные (способность окрашиваться теми или иными красителями) свойства, подвижность, наличие специальных структурных элементов (спора, капсула).

Современный микроскоп состоит из оптической и механической частей. К механической части относятся штатив, тубус (труба) с револьверным устройством, предметный столик, механизм тонкой и грубой наводки (рис. 2).Штатив состоит из двух частей: держателя трубы микроскопа

Рис 1. Микроскоп Левенгука:

1— линза; 2—- булавка, к которой крепится объект; З, 4— фокусирующие винты

Рис. 2. Устройство оптического микроскопа;

/ — основание микроскопа; 2 — рукоятка мак-рометрнческого винта; 3 — тубусодержатсль; 4 — тубус; 5—окуляр; й—револьвер объективов; 7— объектив; 8— предметный столик; 9—конденсор; 10 — осветитель;11-рукоятка микрометрического винта
и массивной ножки, которая служит опорой микроскопа. На штативе укреплен подвижный столик, который приводится в движение двумя винтами, расположенными по его бокам. При помощи этих винтов препарат вместе со столиком вращается и перемешается в разных

направлениях, что облегчает его рассмотрение. Для этой цели предназначены крестообразные устройства, которые позволяют двигать препарат в двух взаимно перпендикулярных направлениях. С помощью двух шкал, имеющихся на таком столике, можно отмечать участки препарата, интересующие исследователя, и отыскивать их при повторных наблюдениях.

В тубусе находится оптическая система. Он перемешается вверх и вниз при помощи двух винтов. Для более грубого перемещения служит зубчатка, или кремальера. Точная установка достигается движением микровинта с мелкой нарезкой: полный оборот микровинта передвигает тубус на 0,1 мм.

В нижней части тубуса имеется револьверное устройство, в которое можно ввинчивать 4 объектива (на некоторых микроскопах 5) и переключать их во время работы. В верхнее отверстие тубуса вставляется окуляр.

Оптическая часть микроскопа состоит из окуляров, объективов, конденсора и зеркала.

Зеркало отражает падающий на него свет и направляет его в конденсор для освещения препарата. Одна сторона зеркала плоская; ею пользуются при любом источнике света и при любом увеличении. Другая, вогнутая, сторона зеркала предназначена для работы без конденсора при малых увеличениях.

Конденсор состоит из нескольких линз, собирающих отраженный зеркалом свет в пучок и направляющих его па плоскость препарата. В нижней части конденсора расположена ирисовая диафрагма, посредством которой можно менять угол лучей и количество пропускаемого конденсором света. Фокусировку конденсора осуществляют специальным микровинтом.

Наиболее важная часть микроскопа — объектив. Он представляет собой систему линз, строящих действительное увеличенное и перевернутое изображение объекта. Наружная, или передняя, линза носит название фронтальной. Даваемое ею изображение объекта страдает рядом аберраций, свойственных каждой простой линзе. Эти аберрации устраняются вышележащими коррекцион-ными линзами.

Объективы по способности устранять аберрации бывают следующие: ахроматы, апохроматы и с плоским изображением. Ахроматы более распространены вследствие простоты и дешевизны. В них 6 линз из оптического стекла, изображение наиболее резкое в центре. Апохроматы более совершенно устраняют хроматическую погрешность, их резкость и величина изображения более равномерная в лучах разной длины волн: их используют совместно со специальными компенсационными окулярами.

Каждый объектив характеризуется свойственным ему собственным увеличением, фокусным расстоянием, численной апертурой и некоторыми другими константами. Увеличение объектива и значение его апертуры обычно обозначены на оправе.

Под численной апертурой (А) объектива понимают произведение синуса половины угла лучей, входящих в объектив (и), и показателя преломления среды (п), находящейся между покровным стеклом препарата и фронтальной линзой объектива:

А = sin« ■ п.

Если этой средой является воздух, то ввиду того, что показатель преломления воздуха равен единице (1), численная апертура «сухих» объективов практически не может быть выше 0,95. Чтобы ее повысить, объектив иммерсируют, т. е. погружают в специальную среду (воду, глицерин, иммерсионное масло), показатель преломления которой больше такового воздуха.

Работа с иммерсионным объективом состоит в следующем. Предварительно наносят сверху на препарат каплю иммерсионного масла, а затем, опуская осторожно тубус, погружают в него объектив. Так как показатели преломления стекла и масла близки между собой, то таким образом устраняется возможность слишком большого рассеивания лучей (рис. 3 и 4).

Окуляр микроскопа — это увеличивающая оптическая система, через которую рассматривается действительное изображение объекта, которое дает объектив. Окуляр состоит из двух линз: собирающей, обращенной к объективу, и глазной, обращенной к глазу. Между ними находится диафрагма, которая задерживает боковые лучи и пропускает лучи, близкие к оптической оси и дающие более контрастное изображение. Окуляр еще раз увеличивает построенное объективом изображение объекта, но не раскрывает новых деталей его строения. Собственное увеличение окуляра (F₀_K) равно расстоянию наилучшего видения для нормального глаза (250 мм), деленному на фокусное расстояние (/) линз:

Рис. 3. Объектив оптического микроскопа;

/—фронтальная линза; d — предметное стекло; п = 1 — показатель преломления воздуха; п= 1,33 —показатель преломления воды; л = 1,515 —показатель преломления иммерсионного (кедрового) масла

Оптическая мощность микроскопа включает в себя возможное увеличение, разрешающую силу и способность точного изображения, зависящую от устранения аберраций.

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива и увеличения окуляра .

Под разрешающей способностью микроскопа (а) понимают наименьшее расстояние между двумя точками объекта, которые воспринимаются глазом раздельно и не сливаются в одну: чем меньше размер частицы, видимой в микроскоп, тем больше его разрешающая способность.

Чем меньше длина волны света и чем больше числовая апертура, тем меньшие детали объекта можно рассмотреть в микроскопе.

Разрешающая способность микроскопов увеличилась благодаря усовершенствованию оптики, применению иммерсионных объективов и конденсоров с апертурой, равной апертуре объектива. Повышение разрешающей способности микроскопа ограничивается длиной волны света. При встрече с объектом меньше ее длины световая волна «обтекает» объект и предмет остается невидимым.

Рис. 4. Ход лучей в иммерсионной системе:

I — иммерсионное масло (п- 1,515); 2 — фронтальная линза иммерсионного объектива; 3— предметное стекло (я = 1,52); 4— воздух

Наименьшие частицы, которые удается рассмотреть в современных световых микроскопах, должны иметь величину больше '/з длины волны света. Следовательно, при пользовании видимой частью дневного света, включающей волны от 400 до 700 нм, в микроскопе могут быть обнаружены частицы величиной не менее 200 нм. Чтобы довести эту величину до размеров, видимых глазом, разрешающая способность которого составляет 0,2 мм, необходимо увеличить объект в 1000 раз. Это увеличение принято считать полезным.

Определение размеров микроорганизмов. Размеры бактерий варьируют в широких пределах — от 0,2 мкм до 125 мкм; у большинства патогенных бактерий — от десятых долей микрометра до нескольких микрометров.

При характеристике размеров бактерий обычно указывают длину и ширину клетки в микрометрах {10~³ мм). В качестве инструментов измерения используют окуляр- и объект-микрометры.

Окуляр-микрометр — стеклянная пластинка, на которой линия в 5 мм разделена на 10 или 20 делений {размещают в окуляре).

Объект-микрометр — предметное стекло с линией длиной 0,5 или 1,0 мм, разделенной на сотые доли (рис. 5 и 6).

Объект-микрометр помещают на предметный столик и, глядя в окуляр с окуляр-микрометром, совмещают начальную черту в объект- и окуляр-микрометрах. Затем определяют цену деления окуляр-микрометра при данных окуляре и объективе.

Пример. Шкала объект-микрометра составляет 1 мм, и одно ее деление равно 10~² мм, т. е. 10 мкм. При совмещении шкалы объект-микрометра три его деления (т. е. 30 мкм) соответствуют 14 делениям окуляр-микрометра, отсюда одно деление окуляр-микрометра составляет 30: 14 =2,14 мкм. После того как определена цена одного деления окуляр-микрометра, вместо объект-микрометра помещают препарат с исследуемым объектом. Например, палочковидный микроб по длине занимает 3, а по ширине—0,5 деления окуляр-микрометра: если одно деление окуляр-микрометра составляет 2 мкм, то длина бактериальной клетки будет 3-2 = 6 мкм, а ширина — 0,5 -2=1 мкм.

При микроскопировании существенное значение имеет освещение исследуемого объекта. Освещение чаще устанавливают по методу Келера:

Осветитель (желательно
использовать стандартные ос
ветители ОИ-7 и ОИ-19, у ко
торых микролампу с неболь
шой плотно скрученной спира
лью можно передвигать вдоль
оси осветителя) располагают на
расстоянии 30...40 см от мик
роскопа.
На предметный столик

кладут препарат; объектив х8

переводят в рабочее положение.

Рис. 5. Микрометры:

а — общий ввд; б— объект-микрометр; в-окуляр-микрометрггрр

Конденсор поднимают до упора; ирисовую диафрагму полностью открывают.
Зеркало устанавливают плоской поверхностью и почти полстью закрывают диафрагму осветителя.

На зеркало помещают лист белой бумаги и, передвигая патрон осветителя, добиваются четкого изображения на бумаге его нити накала лампы.
Глядя в окуляр, при помощи зеркала получают в центре поля зрения изображение краев диафрагмы осветителя — светлое пятно с нерезко очерченными краями.
Используя объектив х8, фокусируют объект в области свет лого пятна.
Опуская конденсор, в плоскости препарата фокусируют изображение краев диафрагмы осветителя и движением зеркала переводят светлое пятно в центр поля зрения.
Диафрагму осветителя открывают до тех пор, пока светлое пятно не закроет все поле зрения.

10. В дальнейшем положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не меняют.

0 5 10 15 20 25

0 12 3 4 5 6

- Окуляр-микрометр • Объект-микрометр

Рис. 6. Определение цены деления окуляр-микрометра.
При работе с учебным микроскопом освещение нередко устанавливают упрощенным способом. Приступая к работе, следует проверить состояние конденсора: он должен быть приподнят, диафрагма открыта.
Приподняв тубус микроскопа, устанавливают объектив с наименьшим увеличением (х8, хЮ) и, глядя в окуляр, при помощи зеркала добиваются полного освещения поля зрения. На исследуемый препарат наносят каплю кедрового масла (или его заменителя), помещают препарат на предметный столик и поворотом револьвера устанавливают иммерсионный объектив. (Чтобы избежать соприкосновения объектива со столиком, тубус следует держать приподнятым.) Под контролем глаза (смотреть сбоку) фронтальную линзу объектива легким поворотом макрометрического винта погружают в каплю иммерсионного масла и, наблюдая в окуляр, осторожно поднимают тубус до видимости препарата. Затем легкими поворотами микрометрического винта (вперед-назад) регулируют четкость изображения.

Световая микроскопия.

Существует несколько модификаций светового микроскопа, позволяющих изучать детали строения микроскопических объектов.

Бактериальные и другие биологические препараты в большинстве своем прозрачны в видимом свете. Лучи света, прошедшие через подобные объекты, почти неотличимы от лучей, прошедших через окружающую их среду. Поэтому при микроскопировании важное значение имеет освещение исследуемого объекта.

Чтобы исследовать под микроскопом живые нефиксированные неокрашенные микроорганизмы, используют особые оптические системы: фазово-контрастное устройство и темнопольный конденсор.

Фазово-контрастное устройство

(рис. 7)обеспечивает четкое изображение объектов. В основе этого метода лежит изменение фазы световых лучей при прохождении их через прозрачные объекты. Как известно, человеческий глаз выявляет только различия в длине (цвет) и амплитуде (интенсивности) световой волны, но не в состоянии выявить различия в фазе. С помощью фазово-контрастного устройства различия в фазе превращаются в изменение амплитуды, в результате чего прозрачные объекты становятся видимыми человеческим глазом.

Другое полезное приспособление в микроскопии — специальный конденсор, создающий эффект так называемого темного поля. Темнопольный конденсор отличается от обычного тем, что пропускает только косые краевые лучи источника света, которые ввиду их сильного наклона не попадают в объектив, в результате чего поле зрения микроскопа остается темным.

Косые лучи, пропускаемые конденсором, проходят через препарат, содержащий частицы разной оптической плотности, огибают их, образуя волны дифрагированного света. В результате этого получается чрезвычайно контрастный препарат, на темном фоне которого видны окруженные сиянием плотные частички, например клетки бактерий (рис. 8).

Фазово-контрастное устройство включает в себя фазовую пластинку— расположенный в задней фокальной плоскости объектива прозрачный диск, на поверхность которого напылено кольцо из

. 7. Схема фазово-контрастного устройства:

I — кольцевая диафрагма; 2 — конденсор; 3 — объект; ^—объектив; 5 —фазовая пластинка

металла (фазовое кольцо); кольцевую диафрагму — помещенную под конденсором светонепроницаемую пластину с прозрачным кольцевидным участком.

Световая волна при прохождении через живую клетку отстает по фазе Приблизительно на '/₄ Длины волны и дополнительно сдвигается еще на 'Д после прохождения через фазовую пластинку (см. рис. 7). Сдвинутые по фазе после прохождения через фазовую пластинку лучи либо совпадают и сливаются с прямыми лучами, идущими мимо объекта, либо оказываются в противо-фазе. В первом случае исследуемый объект виден как светлый на темном фоне, а во втором — как темный на светлом фоне. В микробиологии широко применяют фазово-контрастное устройство КФ-4 (см. рис. 7) (объект виден темным на светлом фоне).

Работа с фазово-контрастным устройством:

Обычный конденсор заменяют на фазово-контрастный, а объектив х40 — на аналогичный фазовый объектив.
Диск револьвера конденсора поворачивают до появления в окошечке цифры 0; диафрагму конденсора полностью открывают.
Используя объектив х8, устанавливают освещение по Келеру.
Обычный окуляр заменяют на вспомогательный и с помощью тубуса добиваются четкого изображения фазовой пластинки в виде темного кольца.

5. Устанавливают кольцевую диафрагму, соответствующую объективу х40. В этом случае наряду с темным кольцом фазовой ластинки можно видеть светлое кольцо диафрагмы.

6. При помощи центрировоч-ных винтов совмещают фазовое кольцо и кольцо диафрагмы.

Рис. 8. Ход лучей в темнолольных конденсорах:

а — параболоид- конденсор; 6~ кардиоид-конденсор; / — объектив; 2—иммерсионное масло; 3 — пренарат; ^ — зеркальная поверхность; 5 —диафрагма

; 2

20

Рис. 9. Оптическая схема люминесцентного микроскопа:

/ —ртутно-кварцевая лампа; 2— коллектор; 3 — кювета; 4—сменные светофильтры; 5— апергурная диафрагма; 6, 8— собирательные линзы; 7— полевая диафрагма; 9— светоотдели-тельная пластинка; 10— объектив; 11 — объект; 12— запирающий светофильтр (сменный); О —зеркало; 14— окуляр; /5— фотоокуляр (гомал); 16— фотопленка; 17— тепловые лучи лампы; i#— УФ-лучи; 19 — сине-фиолетовые лучи; 20—лучи люминесценции.
7. Вспомогательный окуляр заменяют обычным и микроско-пируют препарат. При работе с другими объективами устанавливают соответствующие диафрагмы.

Темнопольный конденсор.

При темнопольной микроскопии используют специальный конденсор с затемненной центральной частью, поэтому в плоскость объекта попадают только боковые лучи, отраженные от внутренних зеркальных поверхностей конденсора. Лучи направлены под таким углом, что не попадают в линзу объектива, и поэтому поле зрения выглядит темным (см. рис. 8). Та часть лучей, которая попадает на объект, отражается в линзу объектива, что позволяет видеть светлое изображение объекта на темном фоне.

Метод темнопольной микроскопии:

Вынимают окуляр, светлопольный конденсор и вывинчивают один из объективов (х8).
Прикрывают диафрагму осветителя и фокусируют нить накала лампы осветителя на листе белой бумаги, помещенном на зеркало (см. п. 5 установки освещения по Келеру).
Раскрывают диафрагму осветителя, закрывают матовым стеклом конец тубуса и с помощью зеркала добиваются равномерого освещения поля зрения.
Ставят на место окуляр, объектив х8, темнопольный конденсор, положение зеркала при этом не изменяют.
На линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды, на столик помещают препарат «раздавленная капля» таким образом, чтобы вода на линзе конденсора контактировала с нижней поверхностью предметного стекла.
Глядя в окуляр, при помощи центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое кольцо с темным пятном в центре. Далее регулируют видимость объекта в поле зрения.

Люминесцентная микроскопия.

Люминесценцией (lumen — свет, escent — слабое действие) называется свечение объекта, возбуждаемое поглощенной им световой энергией. Возбуждать люминесценцию можно как ультрафиолетовым излучением, так и коротковолновым излучением видимой части спектра — сине-фиолетовым. При этом может возникать люминесценция в цветовой гамме видимого спектра, что дает цветное светящееся изображение. Если объект сам не дает явления люминесценции, его подкрашивают специальными красителями — флуорохромами (акридин оранжевый, корифосфин, тиофлавин и др.).

Установка для люминесцентной микроскопии в видимых лучах состоит из яркого источника света и биологического микроскопа (рис. 9). Непосредственно между источником света и зеркалом микроскопа устанавливают сине-фиолетовый светофильтр, а на окуляр микроскопа — желтый светофильтр. Сине-фиолетовый свет, попав на препарат, возбуждает в последнем люминесценцию. Для того чтобы ее увидеть, необходимо убрать все сине-фиолетовые лучи, что и осуществляет желтый фильтр на окуляре, отсекающий коротковолновую часть спектра и пропускающий в глаз наблюдателя длинноволновый свет флуоресценции.

Ветеринарно-бактериологические лаборатории снабжены люминесцентными микроскопами серий МЛ и «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3 — модели рабочего типа; И-1, И-2, И-3 — модели исследовательского типа).

Атомы некоторых веществ, называемых люминофорами (люми-ногены, флуорохромы), поглощая энергию, переходят на более высокий энергетический уровень (возбуждаются). Возбужденное состояние слабоустойчивое, атомы возвращаются на стабильный низкоэнергетический уровень, отдавая избыток энергии в виде свечения — люминесценции. В зависимости от источника энергии возбуждения различают фото-, электро-, радио-, хемо- и рентге-нолюми несценцию.

В лабораторной практике в основном используют фотолюминесценцию — свечение, возбуждаемое энергией световых лучей. По длительности свечения различают люминесценцию кратковременную — флуоресценцию, быстро затухающую после прекращения воздействия возбуждающих лучей, и длительную — фосфоресценцию, продолжающуюся и после окончания возбуждения вещества. По правилу Стокса свет флуоресценции отличается от света возбуждения большей длиной волны, поэтому при освещении объекта невидимыми ультрафиолетовыми или короткими сине-фиолетовыми лучами получают длинноволновые свечения объектов, хорошо видимые простым глазом.

Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первичная люминесценция присуща практически всем веществам, однако интенсивность свечения большинства из них невелика. Флуорох-ромы, связываясь с определенными химическими структурами клетки, придают им способность ярко люминесцировать при освещении объекта (препарата) сине-фиолетовыми лучами — вторичная люминесценция.

В люминесцентных микроскопах источником возбуждения служит ртутно-кварцевая лампа ДРТ-250. Для успешной люминесцентной микроскопии необходимо: 1) из светового потока, идущего от ртутно-кварцевой лампы, с помощью специальных светофильтров выделить коротковолновую (сине-фиолетовую) часть спектра для возбуждения свечения изучаемого объекта и отсечь лучи той же длины, что и лучи люминесценции (в противном случае все поле зрения будет интенсивно светиться). Для этого между источником света и исследуемым объектом ставят светофильтры (возбуждающие) УФС-3, ФС-1, СС-4 и др.; 2) из свето-воТо потока, идущего от изучаемого объекта в окуляр, пропустить длинноволновое свечение (люминесценцию) и одновременно защитить глаз наблюдателя от коротковолновых (возбуждающих) лучей. С этой целью между объектом и глазом наблюдателя помешают окулярные (запирающие) светофильтры: ЖС-3, ЖС-18, Т-1НиТ-2Н.

Сочетанное применение в оптической системе люминесцентного микроскола фильтров целевого назначения (возбуждающие, запирающие) называют принципом скрещенных фильтров. Эффект скрещенных светофильтров обеспечивает цветную (зелено-желтую) флуоресценцию объектов на темном фоне поля зрения. Ход лучей в люминесцентном микроскопе показан на рисунке 9. Лучи от лампы ДРТ попадают на светоделительную пластинку между объективом и окуляром. Ненужные длинноволновые лучи проходят через светоделительную пластинку и гаснут в кожухе микроскопа. Возбуждающие коротковолновые лучи пластинка отражает на изучаемый объект. Часть возбуждающих лучей трансформируется на объекте в длинноволновые лучи люминесценции, которые проходят через объектив, светоделительную пластинку, запирающие фильтры и попадают в глаз наблюдателя. Другую часть возбуждающих лучей, не претерпевших изменений, светоделительная пластинка отражает в сторону источника света. Такое дифференцирующее свойство светоделитель-ной пластинки обусловлено тем, что она покрыта несколькими слоями диэлектриков и расположена под углом 45° по отношению к падающим на нее лучам.

Существенное отличие микроскопов серии «Люам» т МЛ — наличие у «Люмам» сменных светоделительных пластин с разными параметрами возбуждающего спектра и спектра люминесценции, комбинируемых с соответствующими запирающими фильтрами и фильтрами возбуждающего света. При люминесцентной микроскопии в качестве иммерсионной жидкости используют специальное нефлуоресцирую-щее масло (обычное иммерсионное масло для этих целей непригодно из-за собственной люминесценции).

Преимущество люминесцентной микроскопии заключается В ТОМ, ЧТО она дает цветное изображение, высокую сте-пень контрастности, возможность обнаруживать в исследуемом материале бактерии в небольших количествах (цв. рис. I; рис.10). В микробиологии нашли применение такие виды исследований, как люминесцентная микроскопия флюорохромированных объектов и метод флуоресциру-ющих-антител (МФА) в экспресс-диагностике инфекционных болезней.

Люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить ряд важных клеточных структур, изучить их изменения при разных функциональных состояниях организма, различать мертвые и живые клетки, облегчает количественный подсчет микроорганизмов.

Для люминесцентной микроскопии применяют осветитель ОИ-18 с ртутно-кварцевой лампой РК или СВДШ-120А в комбинации с обычными биологическими микроскопами, или специальный люминесцентный микроскоп МЛ-2.
Рис.10 Вид препарата в люминесцентном микроскопе.

Рис. 11. Схема электронного микроскопа:

/ — к вакууму; 2— вакуумная трубка; J—к источнику питания нити накала; 4— нить (катод); 5—анод; 6 — заземление; 7— электронный луч; 8— конденсорная линза; 9— объект; 10— объективная линза; 11 — увеличенное изображение объекта; 12 — проекционная линза; 13 — люминесцентный экран; 14 — фотографическая пластинка; /5— к источнику питания линз. Точечной линией изображен ход электронных лучей

Электронная микроскопия.

Появление электронного микроскопа стало новым этапом в развитии микроскопии благодаря повышению разрешающей способности по меньшей мере в 100 раз из-за использования вместо света потока движущихся электронов.

Электронный микроскоп (рис. 11) является своеобразной копией светового микроскопа (по принципу устройства). Как и в световом микроскопе, в электронном микроскопе освещение обеспечивает источник света, формирующий изображение. Интенсивность и собирание лучей осуществляются с помошью кон-денсорной линзы. Конечное изображение производит проекционная линза в электронном микроскопе или окуляр в световом микроскопе. Основное различие между световым и электронным микроскопами заключается в том, что в качестве источника освещения для получения изображения в электронном микроскопе¹, служит электронный пучок, а вместо стеклянных линз —магнитные или электростатические поля. В световом микроскопе изображение воспринимается глазом непосредственно, а в электронном оно видимо только на флуоресцирующем экране. Изображения в электронном микроскопе можно получить на фотопластинке, помещаемой под экраном.

Электронный микроскоп обеспечивает возможность эффективного визуального наблюдения и анализа структуры твердых тел неоднородного характера от 0,01 нм и менее до 10 нм.

Длина волн видимой области спектра лежит в пределах 0,4...0,7 мкм, следовательно, максимальное разрешение (половина длины волны), которое можно получить при помощи светового микроскопа, — около 0,2 мкм (200 нм). Волновые свойства также присущи электронам. При напряжениях 50... 100 тыс. В длина волны электрона составляет 0,0055... 0,0039 нм. По чисто техническим причинам получить теоретически максимальное разрешение, равное 0,002 нм, невозможно, и на практике оно не превышает 1...2 нм.

Основная часть электронного микроскопа включает в себя ряд магнитных линз, люминесцентный экран и фотографическую пластинку. Электрический ток проходит через вольфрамовую нить и вызывает эмиссию электронов. К нити приложено высокое отрицательное напряжение, что обеспечивает большую разницу потенциалов между нитью и заземленной пластиной анода. В этом поле электроны движутся к аноду, часть из них проходит через отверстие в центре анода (центральная апертура) и формирует электронный луч, который фокусируется первой магнитной линзой (конденсорной) и освещает объект. Большая часть электронов проходит через объект без отклонения, часть электронов после столкновения с тяжелыми атомами выбивается из общего электронного луча. В итоге образуется такая структура электронного луча, которая при дополнительной фокусировке дает изображение объекта.

Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной магнитной линзой, которая дает увеличенное изображение; третья магнитная линза (проекционная), в свою очередь, также увеличивает изображение, которое и попадает на экран. Если люминесцентный экран убрать, то луч попадает на фотопластинку.

Электронный микроскоп, создающий изображение при прохождении электронов через тонкопленочный образец, называют трансмиссионным или просвечивающим. В сканирующем электронном микроскопе первичный электронный луч, попадая на поверхность фиксированного, высушенного и покрытого тонким слоем металла объекта, вызывает различные вторичные излучения, интенсивность которых зависит от характеристик рельефа, электропроводности и химического состава. Полезное увеличение сканирующей электронной микроскопии обычно не превышает 50 тыс. раз. С ее помощью получают трехмерное изображение изучаемого объекта.