Практикум по ветеринарной микробиологии
|
Скачать 3.35 Mb.
|
Тема 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ. БАКТЕРИОФАГИПо происхождению различают антибиотики, продуцируемые грибами и лишайниками (пенициллин, гризеофульвин и др.), акта-номицетами (стрептомицин, неомицин, тетрациклин, эритромицин и др.), бактериями (грамицидин, полимиксин, тиротрицин, субтилин и др.), высшими растениями (аллицин, фитоалексин, препараты алоэ, фитонциды лука, чеснока и др.) и антибиотики животного происхождения (лизоцим, эритрин, экмолин и др.). В лечебной практике антибиотики делят по их спектру действия: действующие преимущественно на какую-то одну группу микроорганизмов (например, на грамположительные или грамот-рицательные) или на разные группы микробов. Антибиотики изготавливают промышленным путем в виде солей калия, натрия, кальция и выпускают в специальных упаковках. Во всех случаях перед выпуском препарата определяют его активность. Нередко приходится определять и концентрацию антибиотиков в исследуемом материале. Биологическую активность антибиотиков выражают в условных единицах (ЕД), содержащихся в I мл раствора (ЕД/мл) или в 1 мг препарата (ЕД/мг). За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, которое подавляет рост стандартного тест-микроба в определенном объеме питательной среды. Для установления активности каждого антибиотика используют свойственный для него тест-микроб: для пенициллина—золотистый стафилококк 209-Р, для стрептомицина и тетрациклина — штаммы Вас. subtilis, для биомицина, левомице-тина — Е. сой. Установлено, что 1 мг чистого основания стрептомицина эквивалентен 1000 ЕД, следовательно, 1 ЕД эквивалентна 1 мкг данного антибиотика. Единица биологической активности не у всех антибиотиков одинаковая: 1 ЕД неомицина эквивалентна 3,3 мкг, пенициллина — 0,6 мкг, бацитрацина — 20 мкг чистого вещества. Весовое количество антибиотика, эквивалентное одной единице биологического действия его, называют международной единицей действия (ME). Активность антибиотиков определяют химическим, но чаше биологическим методом, в основе которого лежит установление интенсивности прямого воздействия препарата на живую микробную клетку. Для этих целей применяют метод серийных разведений в жидких и плотных питательных средах. В штатив ставят 20 пробирок в два ряда и в каждую вносят по 1 мл среды. В пробирках первого ряда готовят последовательные разведения стандартного антибиотика, для чего в пробирку добавляют 1 мл антибиотика, раствор перемешивают и 1 мл его переносят в следующую пробирку и т. д. В две последние пробирки антибиотик не вносят, они служат контролем. В пробирках второго ряда по той же методике разводят испытуемый антибиотик. Затем во все пробирки обоих рядов добавляют тест-микроб в соответствующей концентрации. Пробирки выдерживают в термостате при 37 "С 18..,24 ч. Наименьшее количество (наибольшее разведение) препарата, в котором отсутствует рост тест-микроба, сопоставляют с таким же разведением стандартного антибиотика и определяют содержание его в 1 мл арифметическим подсчетом, принимая во внимание степень разведения. В лабораторных условиях применяют чашечный (или кольцевой) метод с использованием бумажных дисков, пропитанных растворами различных концентраций испытуемого антибиотика. Техника выполнения. Готовят серию последовательных разведений испытуемого препарата в пробирках на физиологическом растворе (1:10, 1:100, 1:1000, 1 :10000 и т.д.). В несколько чашек Петри со стерильным агаром сплошь по всей поверхности высевают культуры тест-микроба. Дно чашки карандашом по рж-38- Посев культуры шпателем стеклу разделяют на четыре сектора. В центр каждого сектора на засеянный агар кладут стерильный бумажный диск (диаметр 0,6 см), пропитанный раствором антибиотика соответствующей концентрации. Чашки Петри выдерживают в термостате при 37 °С 16...18ч. Вокруг дисков в зависимости от активности и концентрации антибиотика в растворе образуются разной ширины зоны задержки роста тест-микроба (см цв. рис. V). Наименьшие зоны точно измеряют с помощью циркуля и линейки. Параллельно исследуют стандартные антибиотики с известной активностью. Для каждой концентрации стандартного и испытуемого антибиотика вычисляют среднее арифметическое число. Активность рассчитывают по стандартной кривой или по специальным таблицам. Для выбора наиболее эффективного антибиотика определяют чувствительность (антибиотикорезистентность) возбудителя болезни к нескольким антибиотикам. В стерильные чашки Петри с ровным дном наливают по 20 мл МПА или агара на переваре Хоттингера с содержанием 120— 140 мг% аминного азота; рН среды 7,2...7,4. Исследуемую культуру возбудителя, выделенного из патологического материала, смывают с агара физиологическим раствором, готовят 1-миллиардную взвесь и 1 мл ее засевают сплошным слоем по всей поверхности агара. Излишек жидкости отсасывают пипеткой. Засеянные чашки подсушивают в термостате 15...30 мин при 37 °С. Бумажные диски, пропитанные разными антибиотиками (лучше фабричного производства), раскладывают на засеянный агар стерильным пинцетом на расстоянии 2 см от края, слегка прижимая к среде. В одной чашке можно испытать 4...5 антибиотиков. Чашки с дисками выдерживают при комнатной температуре (не выше 20 °С) 2...3 ч, затем 14...15 ч в термостате при 37 °С. Учет результатов производят по величине зоны задержки роста микробов вокруг бумажных дисков, включая их диаметр. Если зона задержки роста составляет 15...25 мм, то считают, что микробы чувствительны к антибиотику, до 15 мм — малочувствительны; отсутствие такой зоны указывает на резистентность бактериальной культуры к данному антибиотику (чувствительность отсутствует). Для выявления антибиотикоустойчивых штаммов бактерий используют метод диффузии в агаре с применением дисков. Более точное исследование проводят методом серийных разведений в соответствии с «Указаниями по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных». Бактериофаги. Это вирусы бактерий, характеризующиеся обли-гатным паразитизмом, малой величиной (10...350 нм), специфическими антигенными свойствами. Паразитизм бактериофагов проявляется только в молодой бактериальной культуре, гомологичной (специфичной) фагу. Бактериофаги можно выделить из различных материалов, где содержатся живые микробы (из сточных вод, раневых секретов, фекалий животных и человека, почвы). Называют фаги по виду лизируемого ими микроба (фаги кишечной палочки, сальмонелл). Для выделения фага исследуемый материал пропускают через бактерийные фильтры. Фильтрат вносят в колбу с МПБ и засевают определенным видом бактерий. Ставят в термостат при 37 X на 16,.Л 8 ч, а затем культуру вновь фильтруют и проверяют на наличие фага. С этой целью в 10 мл МПБ засевают 0,05 мл густой взвеси бактерий, добавляют 0,1 мл исследуемого фильтрата и помещают в термостат. Каждые два часа проверяют степень роста культуры (по образующейся мутности среды), сравнивая с контрольной пробиркой МПБ (та же культура, но без фильтрата). В первые часы инкубирования в опытных контрольных пробирках отмечают рост культуры, но в последующем в растущей культуре развившийся фаг лизирует молодую культуру и в пробирках с добавленным фильтратом наступает просветление, мутность исчезает; в контрольных пробирках мутность увеличивается из-за обильного роста культуры. Наличие фага можно определить и на плотных средах. На поверхность скошенного в пробирке МПА засевают микробную культуру так, чтобы она покрывала всю поверхность среды; подсушивают и наносят 1...2 капли фильтрата, давая им стечь сверху вниз по поверхности засеянной среды. Культуру ставят в термостат на 18...20 ч. При наличии фага, гомологичного засеянной культуре, по следу протекавшей капли фильтрата (фага) бактерии не растут, образуется своего рода «дорожка», вокруг которой отмечают обильный рост бактерий. Учитывая специфичность фагов, их используют для диагностических целей, идентификации бактериальных культур, выделяемых из исследуемого материала. При необходимости для определения активности фага применяют специальные методы. Репродукция многих бактериофагов в клетке приводит к ее лизису. На специфической адаптации фагов к строго определенным видам (штаммам) бактерий и внешнем проявлении поражения бактериальных клеток (лизис) основано практическое использование бактериофагов: при помощи известного (диагностического) фага можно обнаружить и идентифицировать бактерии. Кроме того, биологическая промышленность выпускает лечебно-профилактические бактериофаги. Идентификация бактерий с помощью фагов. Фаги применяют для видовой (возбудитель сибирской язвы, листериоза и др.) или внутривидовой идентификации бактерий — установление фаговара конкретного бактериального штамма. Для идентификации неизвестной культуры бактерий при помощи диагностического бактериофага обычно используют плотную питательную среду. Например, исследуемую 18-часовую культуру, предположительно листерий, засевают в МПБ с глюкозой, инкубируют при 37 °С 4 ч до легкой опалесценции среды и затем засевают газоном (0,1 мл) на подсушенный 2%-й МПА в чашку Петри. Через 1...1,5ч инкубирования посевов при 37 "С при слегка приоткрытой крышке на одну половину газона наносят каплю листериозного бактериофага 2А и на вторую половину помешают каплю фага 4А. Посевы инкубируют при 22...25°С 16...24 ч. Учет результатов: если культура листери-озная, то на месте нанесения хотя бы одного фага видна прозрачная зона лизиса. Для установления фаговара исследуемую культуру проверяют с набором типовых фагов, охватывающих все фаговарианты данного вида бактерий, определяют, к какому фагу чувствителен данный штамм, что и служит его маркером. Для идентификации микробов в объектах окружающей среды и диагностики инфекционных болезней используют метод нарастания титра фага, который позволяет обнаружить возбудителя непосредственно в исследуемом материале в присутствии посторонней микрофлоры. Для этого навеску исследуемого материала без консерванта заливают МПБ в 10-кратном объеме (рН 6,8...7,0), встряхивают со стеклянными бусами 5 мин в шуттель-аппарате и разливают в две пробирки по 9 мл. В первую пробирку добавляют 1 мл индикаторного фага известного титра в разведении 1 : 100, в другую — 1 мл бульона (контроль на наличие свободного фага), в третью пробирку (контроль титра фага) — 9 мл стерильного МПБ и 1 мл фага. Пробирки помещают в термостат при 37 "С на 4...5 ч. При наличии в материале микроорганизмов гомологичного фага происходит нарастание титра фага. Затем содержимое каждой пробирки разводят бульоном в 100, 1000 и 10 000 раз при 58 "С, 30 мин прогревают в водяной бане и исследуют по методу агаровых слоев с индикаторной культурой. Результат учитывают через 4...5 ч по колониям фага («пятнам»). Положительным результатом считают тот, при котором титр фага в опытной пробирке увеличивается более чем в 5 раз по сравнению с контролем. Методика рекомендуется при исследовании воды, почвы, молока и другого материала. |
Похожие:
 |
Плюс Утверждены Министерством сельского хозяйства Российской Федерации... Казань, Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии, Дагестанского научно-исследовательского... |
|
Правила проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора Казань, Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии, Дагестанского научно-исследовательского... |
 |
Правила проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора Казань, Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии, Дагестанского научно-исследовательского... |
|
№4: «Детоксикационная терапия в ветеринарной медицине» Цель: Изучить отравления, наиболее часто встречающиеся в ветеринарной практике, и научится применять методы их детоксикации |
|
Бакалавра Работа выполнена на кафедре микробиологии спбгу научный... Выявление представителей рода Mycobacterium в аквариумной воде, находящейся в замкнутой системе очистки |
|
Отчёт по ветеринарно-санитарной экспертизе о прохождении производственной практики «Приложение». Глвсэ является подразделением Государственной ветеринарной службы и подчинена районной ветеринарной лаборатории, находящейся... |
|
Исследования в ветеринарной офтальмологии Шиотца и электронный аппланационный тонометр Tonopen; в российской ветеринарной практике наиболее часто применяют механический аппланационный... |
|
Инструкция №29/13-и по применению дезинфицирующего средства «хорт таблетки» «Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» (гу «рцгэиОЗ» мз республики Беларусь); Государственное учреждение... |
|
Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана часть 1 Казань 2015 Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и учащейся молодежи, посвященной 85-летию зоотехнического образования... |
|
Тезисы докладов 68 научно-практической конференции студентов, аспирантов... Печатается по решению Ученого совета факультета ветеринарной медицины и факультета биотехнологии и стандартизации фгбоу впо «Казанская... |
|
Практикум Федеральное агентство по образованию рв владивостокский государственный университет Практикум «Английский язык: Читаем и говорим по-английски. Часть 2» предназначен для студентов специальностей «Международные отношения»... |
|
Практикум Министерство образования и науки Российской Федерации Владивостокский... Практикум по дисциплине «Маркетинг» предназначен для проведения практических занятий и организации самостоятельной работы студенты... |
|
Практикум ю. А. Медведев Министерство образования и науки Российской... Информационные технологии в математике: Практикум / Владим гос пед ун-т. Владимир, 2005. 96 с |
|
Учебное пособие к лабораторным занятиям по фармацевтической химии... Методическое пособие «Анализ органических лекарственных веществ» предназначено для проведения лабораторно-практических занятий у... |
|
Римское право практикум Игнатенко А. В., Чорновол Е. П. Римское право: Учебное пособие. Практикум. Екатеринбург: Изд-во Уральской академии государственной... |
|
Е. В. Ежова практикум по уголовному праву Практикум по уголовному праву. Особенная часть: Учебное пособие для студентов заочного отделения. Уфа: риц башГУ, 2013. –81 с |