Практикум по ветеринарной микробиологии
|
Скачать 3.35 Mb.
|
Серологические методы исследования.В основе всех серологических исследований лежит специфическая реакция между антигенами и антителами. Антигены — генетически чужеродные вещества, которые при па-рэнтеральном введении в организм животного вызывают ответную реакцию в виде сенсибилизации, толерантности и продуцирования антител, взаимодействующих специфически с антителами как in vivo, так и in vitro. Различают антигены корпускулярные, клеточные (бактерии, эритроциты) и растворимые (молекулярно-дисперсные). Антигены поливалентны— имеют несколько детерминантных рецепторов для связи с антителами, способны вступать в реакцию с антителами как в организме животного (in vivo), так и вне организма — в пробирке (in vitro). Антигенной функцией обладают не только полноценные антигены, но и неполноценные (гаптены), то есть вещества небелковой природы (полисахариды, липидо-полисахаридный комплекс соматического антигена микробной клетки и другие вещества). Антитела — высокомолекулярные специфические белки глобу-линовой фракции сыворотки крови (иммуноглобулины). По проявлению феномена взаимодействия между антигеном и антителом in vitro различают осадочные реакции, лизирующие и нейтрализующие. Антитела, участвующие в осадочных реакциях, получили названия по типу взаимодействия с антигеном: агглютинины — вызывают склеивание корпускулярного антигена и осаждение комплекса антиген—антитело (агглютината) и преципити-ны — образуют преципитат с растворимым антигеном. В реакциях лизиса участвуют бактериолизины и гемолизины, обусловливающие лизис, распад корпускулярного антигена. Нейтрализующие антитела обезвреживают, нейтрализуют токсическое действие антигена. В серологических реакциях, применяемых для диагностических целей, один из компонентов должен быть известен, по которому ввиду специфичности определяют наличие другого компонента. Например, если взять заведомо известный антиген (сапной, бруцеллезный, сальмонеллезный) и с ним исследовать сыворотки крови от животных, то положительный результат реакции с данным антигеном указывает на наличие в сыворотке соответствующих антител — то есть сыворотка получена от больного животного. И, наоборот, при наличии специфической сыворотки (гипериммунная сибиреязвенная, колибактериозная и др.) определяют видовую принадлежность (идентифицируют) возбудителя болезни, выделенного из исследуемого материала. Серологические реакции ставят на физиологическом растворе потому, что реакция между антигенами и антителами происходит в слабоэлектролитной среде. Реакция агглютинации (РА).Сущность РА заключается в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфические антигену антитела, в равномерной взвеси клеток происходит их склеивание, образование глыбок, комочков, хлопьев, которые постепенно оседают на дно пробирки, формируя характерный осадок — агглютинат; жидкость над ним просветляется. Характер агглютината зависит от антигенного строения микробной клетки (антигена). Если антигеном является взвесь неподвижных бактерий (без жгутиков), имеющих только соматический О-антиген, образуется мелкозернистый осадок в течение 16...22 ч. Если антигеном служит взвесь бактерий, имеющих жгутики (подвижные виды), и в агглютинации участвует наряду с соматическим еще жгутиковый Н-антиген, формируется крупнохлопчатый, крупнозернистый агглютинат. В ветеринарной практике РА используют для диагностики бруцеллеза, сальмонеллезов, колибактериоза, листериоза, вибриоза, лептоспирозов и других заболеваний. Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинчатый), кровяно-капельный, гемагглютинации, торможения гемагглю-тинации, антиглобулиновый Кумбса, РА по Кастеллани (метод адсорбции агглютининов), кольцевая проба (реакция) с молоком. Для определения антител (по известному антигену) берут 5... 10 мл крови из яремной вены животного (у свиней из хвостовой) в стерильные пробирки и помещают их в теплое место. После образования сгустка осторожно (стерильно!) отделяют его от стенок пробирки, обводя металлической проволокой (вязальной спицей), и ставят в холодное место для ретракции (отделения) сгустка. Сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, нумеруют их, с нарочным и сопроводительным письмом отсылают в лабораторию. Сыворотки для РА (как и вообще при серологических исследованиях) используют свежие без гемолиза или консервированные фенолом, мертиолатом натрия или борной кислотой. Антиген для РА представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых или живых бактерий. Для диагностических целей рекомендуется стандартный антиген биофабричного производства. Для идентифицикации бактериальной культуры, выделенной из патологического материала, применяют стандартные сыворотки, а антиген готовят из суточной культуры — смыва с МПА. Специфические стандартные агглютинирующие сыворотки получают на биофабриках путем гипериммунизации животных соответствующим антигеном (специально подготовленной взвесью живых или убитых микробов, эритроцитами и др.). Готовую сыворотку консервируют, разливают в ампулы и запаивают. Нередко диагностические сыворотки подвергают лиофильному высушиванию. Перед употреблением такие сыворотки разводят дистиллированной водой. Но для постановки реакции (и промывания пипеток) ее разводят физиологическим раствором. Постановка РА классическим (пробирочным) методом. Исследуемые сыворотки разводят в чистых сухих пробирках с ровным сферическим дном. Для каждой сыворотки берут отдельную пипетку. В зависимости от инфекции производят соответствующие степени разведения сывороток (согласно инструкции). Например, для диагностики бруцеллеза сыворотки разводят 1: 25; 1: 50; 1:100; 1 : 200; 1: 400. Разведения удобно производить следующим образом. В отдельной пробирке готовят основное (исходное) разведение сыворотки — 1: 25, смешивая 0,1 мл испытуемой сыворотки с добавлением 2,4 мл физиологического раствора. В опытные пробирки разливают по 1 мл физиологического раствора. Затем из исходного разведения 1 мл жидкости переносят в первую опытную пробирку, смешивают с физраствором (разведение 1: 50) и 1 мл переносят во вторую пробирку (1: 100), из второй 1 мл — в третью и т. д. Из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы в каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки (рис. 44). Во все пробирки добавляют по две капли стандартного антигена (концентрация 10 млрд микробных тел в 1мл), смешивают встряхиванием и выдерживают в термостате 4...6 ч при 37 °С, а затем при комнатной температуре 14...16 ч. При постановке РА (как при каждой серологической реакции) обязательны контроли: в тех же разведениях испытывают сыворотку нормальную (от здорового животного) и позитивную (от заведомо больного животного или стандартную биофабричного производства) с тем же антигеном.  Компоненты при постановке реакции вносят в пробирки индивидуальными мерными пипетками с резиновыми грушами или дозаторами, групповыми дозаторами (рис. 45...47) и автоматическими пипетками с изменяющимися объемами (5...25Омкл). Рис. 45. Многоканальные пипетки для мнкротнтровання: / —оБший вид; 2. а, б, в, г — последовательность работы   Рис. 46. Одиночная автоматическая пипетка: / — стеклянный патрубок; 7—расширение для сбора избыточной жидкости; J — резиновая груша; 4 — пипетка-мерник Рис. 47. Групповая автоматическая пипетка: / — стеклянный цилиндр; 2 — отверстие для слива избыточной жидкости; 3— приемник для избыточной жидкости; 4 —отверстия нижней части цилиндра; 5— пипетки-мерники; 6— резиновая груша Для контроля антигена в 1 мл физиологического раствора добавляют две капли антигена для исключения самоагглютинации. Учет РА осуществляют невооруженным глазом или с помощью агглюти носко па, начиная с контрольных пробирок. Результат РА принято выражать количеством крестов: ++++ (#) —полное просветление жидкости; образовавшийся агглютинат имеет вид перевернутого зонтика, при встряхивании разбивается в глыбки, хлопья разной величины, жидкость остается прозрачной; + + +(///) — неполное просветление жидкости; агглютинат, как и в предыдущем опыте, в виде зонтика, при встряхивании разбивается на более мелкие глыбки, комочки; ++(++) — неполное просветление жидкости; агглютинат в виде зонтика, но при встряхивании разбивается на хлопья разной величины, жидкость мутная; + — наличие небольшого нехарактерного осадка в виде «пуговки», жидкость над ним мутная. При встряхивании такой осадок легко разбивается, увеличивая мутность; — (минус) — вся жидкость мутная, на дне пробирки небольшой осадок антигена с ровными краями в виде «пуговки» и при встряхивании разбивается в равномерную муть. РА в 3...4 креста учитывается как положительная степень проявления агглютинации, в два креста — сомнительная, один крест или отсутствие агтлютината — выражает отрицательный результат. Реакцию оценивают не только по степени выраженности (++ + +, + + + или + +), но и по высоте титров, то есть степени разведения сывороток, давших положительный результат РА. Например, для диагностики бруцеллеза крупных животных диагностическим титром считают положительный результат РА с сывороткой в разведении не ниже 1:100, при сальмонеллезном аборте кобыл — выше 1 : 500. Капельный (пластинчатый) метод РА. Используют для быстрого обследования поголовья животных в лаборатории и в условиях хозяйства. На чистую стеклянную пластинку наносят микропипеткой исследуемую сыворотку по 0,04; 0,02; 0,01 и 0,005 мл. К каждой сыворотке добавляют по одной капле антигена определенной концентрации, постепенно смешивают чистой стеклянной палочкой, начиная с наименьшего объема сыворотки. Условно считают, что сыворотка в первой капле соответствует разведению 1: 50, во второй — 1:100, в третьей — 1: 200, в четвертой — 1: 400. Через 2...3 мин производят учет. Для ускорения реакции стекло слегка подогревают, держа высоко над пламенем горелки. Положительный результат проявляется образованием в капле сыворотки комплекса антиген — антитело в виде крупинок, хлопьев и просветлением жидкости. При отрицательном результате капля смеси сыворотки и антигена остается равномерно мутной (отсутствие в сыворотке антител). Пластинчатым методом РА пользуются также для ориентировочного определения вида микроба или его идентификации (типизации). На предметное стекло наносят каплю известной специфической сыворотки и отдельно каплю физраствора (для контроля). В каждую каплю добавляют культуру испытуемого микроба в количестве, взятом бактериологической петлей, и равномерно размешивают. Положительная реакция указывает на гомологич-ность антигена с известным антителом. Кровяно-капельный метод РА. Реакцию чаще применяют для диагностики пуллороза (сальмонеллеза птиц) и бруцеллеза. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю цельной крови (взятой у птиц из гребешка или сережки), в нее добавляют каплю соответствующего антигена и смешивают стеклянной палочкой. Для лучшей видимости феномена агглютинации биопромышленность выпускает антиген, подкрашенный гематоксилином. В положительных случаях РА (когда в крови присутствуют специфические антигену антитела) через 30...60 с в капле смеси появляются глыбки, хлопья склеенного антигена (агглютинат). Кольцевая проба (реакция) с молоком. В основном используют при обследовании крупного рогатого скота на бруцеллез и при контроле сборного молока. В агглютинацион-ные пробирки наливают по 2...3 мл свежего цельного молока и добавляют антиген (окрашенный гематоксилином) по 0,2 мл (2 капли). Пробирки встряхивают до равномерного окрашивания молока, выдерживают в водяной бане (или термостате) при 37 °С в течение 45.60 мин. При наличии в молоке антител образуется комплекс антиген—антитело, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывает наверх, образуя синее кольцо в нижнем слое сливок; столбик молока обесцвечивается. Отрицательная реакция характеризуется синей окраской всего молока в пробирке и слегка желтоватым слоем сливок. РА методом адсорбции антител (по Касте л л а н и). У некоторых микробов наряду со специфическими видовыми антигенами имеются еще групповые, общие с другими видами одного рода или семейства бактерий. При введении в организм животного (и человека) таких бактерий (например, сальмонелл) образуются антитела как против видоспецифических, так и групповых (общих для разных видов) антигенов. Если в реакции участвует микроб, обладающий групповым и типовым антигенами, то происходит полная агглютинация общих (групповых) и тииоспе-цифических антигенов, при этом из сыворотки все антитела адсорбируются. Если антиген не типоспецифичен антителам, происходит реакция агглютинации за счет групповых антигенов и групповых антител, типоспецифические антитела в сыворотке остаются. Адсорбированные групповые антитела удаляют; сыворотки с групповым агглютинатом центрифугируют, а надосадочную жидкость (сыворотку с оставшимися типоспецифическими антителами) отсасывают и вновь используют в РА. Так как сыворотка, истощенная групповыми антигенами, содержит только специфические антитела, она будет реагировать положительно лишь со специфическим антигеном. На этом принципе основан метод' получения монорецепторных сывороток. Реакция Кумбса. В ряде случаев при постановке РА выпадения агглютината не происходит. Одной из причин этого является наличие в сыворотке больных животных наряду с полными антителами так называемых неполных или блокирующих антител, которые тормозят образование агглютината (выпадение комплекса антиген—антитело в виде осадка). Методика выявления неполных антител в организме больного разработана Кумбсом. Прямая реакция Кумбса (рис. 48) заключается в том, что к эритроцитам больного животного добавляют специфическую антигло-булиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов сыворотки). Эритроциты агглютинируют. При непрямой реакции исследуют сыворотку больного, которую соединяют с эритроцитами здорового животного, затем, как и при прямом методе, добавляют антиглобулиновую сыворотку. Блокирующие (неполные) антитела соединяются с эритроцитами, и добавленная антиглобули-новая сыворотка, вступая в реакцию с неполными антителами, приводит к агглютинации эритроцитов, нагруженных неполными антителами. Для диагностических целей в ветеринарии разработана удобная модификация методики реакции Кумбса — бактерийный вариант, в котором вместо эритроцитов применяют специфический бактерийный антиген. Бактерийный вариант реакции Кумбса. С исследуемыми сыворотками ставят обычную РА. После учета результата реакции в пробирки, в которых отсутствует агглютинация, добавляют по 2 мл физраствора и центрифугируют при 4000 мин~' в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют 1 мл антиглобулиновой сыворотки в рабочем титре (установлен предварительно). Центрифужные пробирки встряхивают, содержимое переносят в агглютинационные пробирки, ставят их в термостат при 37...38 °С на 16...48 ч, а затем выдерживают еще 1 ч при комнатной температуре. Учет производят по характеру агглютината, как при обычном методе РА. Реакция Кумбса очень чувствительная и позволяет более точно выявлять больных. Реакция гемагглютинации (РГ А). Основана на том, что некоторые виды бактерий и вирусов обладают способностью адсорбироваться на поверхности эритроцитов разных видов животных (и птиц), вызывая их склеивание и образование агглютината (прямая РГА). Адсорбция антигена (бактерий, вирусов) на поверхности эритроцитов не всегда проявляется образованием видимого осадка; кроме того, РГА неспецифична, потому что эритроциты одного и того же вида животного могут адсорбировать различные антигены. Специфической является реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) (рис. 49). Для ее постановки предварительно готовят эритроцитарный диагностикум (эритроциты, на которых адсорбирован антиген). С этой целью стерильно получают кровь барана (или петуха), дефибринируют ее и несколько раз отмывают в фосфатно-буферном растворе (рН 7,2) при 3...5-кратном центрифугировании. Надосадочную жидкость сливают, концентрацию эритроцитов доводят до 2,5 % (1 : 40). К 2,5%-й взвеси эритроцитов добавляют в равном объеме (по 1 мл или по 0,5 мл) взвесь исследуемого вида микроба в концентрации 5...10 млрд клеток в 1 мл. Эритроциты легко адсорбируют антиген полисахаридной природы. Для адсорбции антигена белковой природы эритроциты предварительно обрабатывают танином в разведении 1:20 000. Эритроциты в комплексе с добавленным антигеном оставляют для сенсибилизирования (адсорбции) на 2 ч в термостате (37 °С), затем вновь центрифугируют при оборотах З...4тыс. мин""' в течение 5 мин с фосфатно-буферным раствором. Полученный эритроцитарный диагностикум вносят в пробирки (или лунки в плексигласовой доске) и добавляют к нему стандартную иммунную сыворотку. В положительных случаях произойдет РГА — выпадение эритроцитов в характерный хлопьевидный или зернистый осадок, распределенный по всей поверхности дна пробирки (гемагглютинат). Значит, исследуемый вид микроба (антиген) специфичен антителам иммуносыворотки. В отрицательных случаях несклеенные эритроциты осядут на дно в виде небольшого ровного кружочка. Для подтверждения достоверности результатов РПГА ставят реакцию задержки (торможения) феномена гемагглютинации (РЗГА) или ее модификацию — реакцию нейтрализации антител (РИА). Рис. 49. Реакция пассивной гемагглютинации (схема): Эр — эритроциты; АГ— антиген; AT— антитело Методика постановки РЗГА. Сущность заключается в том, что реакцию агглютинации ставят со специфической диагностической сывороткой и испытуемым антигеном (исследуемый вид микроба используют как антиген). Эту смесь выдерживают 1 ...2 ч при 37 °С,  затем добавляют эритроциты. Если испытуемый антиген гомологичен антителам диагностической сыворотки, они взаимодействуют друг с другом и добавленные эритроциты не агглютинируют — результат реакции положительный. Если испытуемый антиген не гомологичен антителам сыворотки или отсутствует в исследуемом материале, добавленные эритроциты адсорбируют антиген и происходит РГА —результат РЗГА отрицательный, вид испытуемого микроба (антигена) не установлен, Методика постановки РНА. Сущность заключается в том, что в равных объемах смешивают диагностическую иммунную сыворотку с различными разведениями исследуемого материала (искомого антигена), оставляют для контакта на 1...2ч, затем добавляют эритроциты, сенсибилизированные определенным (известным) антигеном, специфическим по отношению к антителам сыворотки (эритроцитарный диагноста кум). Когда искомый антиген вступает в реакцию с антителами сыворотки, происходит их нейтрализация и добавленные эритроциты не агглютинируют, РГА не происходит — результат РНА положительный. Если в исследуемом материале не содержится антиген, специфический к антителам используемой сыворотки, нейтрализации антител не будет; поэтому при добавлении эритроцитарного диагностикума проявляется агглютинация эритроцитов (гемагглютинация), а результат РНА отрицательный. Реакция нейтрализации антител — высокочувствительный метод обнаружения антигена не только во взвеси живых (или убитых) бактерий, но и во взвеси растертой ткани различных органов, нативных и гретых секретах и экскретах больного организма. |
Похожие:
 |
Плюс Утверждены Министерством сельского хозяйства Российской Федерации... Казань, Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии, Дагестанского научно-исследовательского... |
|
Правила проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора Казань, Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии, Дагестанского научно-исследовательского... |
 |
Правила проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора Казань, Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии, Дагестанского научно-исследовательского... |
|
№4: «Детоксикационная терапия в ветеринарной медицине» Цель: Изучить отравления, наиболее часто встречающиеся в ветеринарной практике, и научится применять методы их детоксикации |
|
Бакалавра Работа выполнена на кафедре микробиологии спбгу научный... Выявление представителей рода Mycobacterium в аквариумной воде, находящейся в замкнутой системе очистки |
|
Отчёт по ветеринарно-санитарной экспертизе о прохождении производственной практики «Приложение». Глвсэ является подразделением Государственной ветеринарной службы и подчинена районной ветеринарной лаборатории, находящейся... |
|
Исследования в ветеринарной офтальмологии Шиотца и электронный аппланационный тонометр Tonopen; в российской ветеринарной практике наиболее часто применяют механический аппланационный... |
|
Инструкция №29/13-и по применению дезинфицирующего средства «хорт таблетки» «Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» (гу «рцгэиОЗ» мз республики Беларусь); Государственное учреждение... |
|
Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана часть 1 Казань 2015 Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и учащейся молодежи, посвященной 85-летию зоотехнического образования... |
|
Тезисы докладов 68 научно-практической конференции студентов, аспирантов... Печатается по решению Ученого совета факультета ветеринарной медицины и факультета биотехнологии и стандартизации фгбоу впо «Казанская... |
|
Практикум Федеральное агентство по образованию рв владивостокский государственный университет Практикум «Английский язык: Читаем и говорим по-английски. Часть 2» предназначен для студентов специальностей «Международные отношения»... |
|
Практикум Министерство образования и науки Российской Федерации Владивостокский... Практикум по дисциплине «Маркетинг» предназначен для проведения практических занятий и организации самостоятельной работы студенты... |
|
Практикум ю. А. Медведев Министерство образования и науки Российской... Информационные технологии в математике: Практикум / Владим гос пед ун-т. Владимир, 2005. 96 с |
|
Учебное пособие к лабораторным занятиям по фармацевтической химии... Методическое пособие «Анализ органических лекарственных веществ» предназначено для проведения лабораторно-практических занятий у... |
|
Римское право практикум Игнатенко А. В., Чорновол Е. П. Римское право: Учебное пособие. Практикум. Екатеринбург: Изд-во Уральской академии государственной... |
|
Е. В. Ежова практикум по уголовному праву Практикум по уголовному праву. Особенная часть: Учебное пособие для студентов заочного отделения. Уфа: риц башГУ, 2013. –81 с |