2.2.2 Технология получения кормовой добавки Кератопептид
В условиях ООО «Печора Шубина», согласно разработанному технологическому регламенту, нами было изготовлено 3 опытно-производственных серии кератинсодержащей кормовой добавки Кератопептид.
Кератопептид представляет собой биологически активную кормовую добавку в форме темно-коричневой жидкости, полученную на основе гидролиза шерсти овец, содержащую в своем составе пептиды, аминокислоты, в том числе серосодержащие.
Опытно-производственные серии кормовой добавки Кератопептид готовили в реакторе объемом 100 л.
Шерсть, очищенную от механических примесей, в количестве 6,7 кг вносили в реактор, промывали в 30 л теплой воды в течение 20 минут. Промывную жидкость удаляли, шерсть отжимали. К промытой шерсти в реактор вносили 50 л раствора, содержащего 1,5 кг гидроксида натрия, 1,5 л перекиси водорода и 250 г сульфита натрия. Гидролиз проводили при комнатной температуре в течение 3 часов при постоянно работающей мешалке. рН раствора доводили до значения 6,7 путем внесения 1,25 кг ортофосфорной кислоты. Далее вносили 7 г ферментного препарата Оллзайм, предварительно растворенного в небольшом объеме воды и продолжали гидролиз в течение 6 часов. Стерилизовали гидролизат при температуре 110 0С в течение 15 мин путем пропускания пара через «рубашку» реактора. На этом этапе фермент инактивируется. После стерилизации выдерживали 3-4 часа для оседания нерастворенных частиц. Далее гидролизат фильтровали через лавсановый фильтр и фасовали во флаконы вместимостью 10, 100, 200 и 500 см3. Фасовку проводили в асептических условиях. Расфасованную и этикированную кормовую добавку Кератопептид контролировали по всем показателям качества, предусмотренным СТО 85753185-0001-2009.
Таким образом, технологический регламент изготовления опытно-производственных серий кератинсодержащей кормовой добавки Кератопептид включает 6 основных этапов (рис 3):
1Подготовка помещения и оборудования, инструментов и посуды;
2 Приготовление гидролизата;
Подготовка составных компонентов;
Подготовка овечьей шерсти (очистка от механических загрязнений, промывка);
Предобработка раствором, содержащим 3 % гидроксида натрия (NaOH), 1 % перекиси водорода (H2O2) и 0,5 % сульфита натрия (Na2SO3) в течение 3 часов;
Нейтрализация раствора ортофосфорной кислотой (H3PO4) до pH 6,7;
Ферментативный гидролиз в течение 6 часов при комнатной температуре ферментным препаратом Оллзайм ФД (Allzyme Feather Digest) из расчета 1 г фермента на 1 кг исходного сырья (шерсти);
3 Стерилизация при температуре 110ºС в течение 15 минут. На этом этапе фермент инактивируется;
4Фильтрация через лавсановый фильтр;
5Фасовка кератинсодержащей кормовой добавки Кератопептид;
6 Контроль кератинсодержащей кормовой добавки Кератопептид по всем показателям качества, предусмотренным СТО 85753185-0001-2009 (табл. 7).
Таблица 7. Показатели качества кератинсодержащей кормовой добавки
Кератопептид
Наименование показателя
|
Характеристика и норма
|
Внешний вид
|
Темно-коричневая
жидкость
|
Номинальный объем, см3
|
10, 100, 200, 500 + 2%
|
pH
|
6,7 ± 0,3
|
Массовая доля белка, мг/ см3
|
82,0 ± 1,0
|
Массовая доля цистина, мг/ см3
|
5,0 ± 0,5
|
Стерильность
|
Стерилен
|
Токсичность, в тест-дозе 1см3 на мышь
|
Нетоксичен
|
2.2.3 Определение стабильности кормовой добавки Кератопептид в процессе хранения
В процессе разработки готовых форм препаратов устанавливаются сроки годности и условия их хранения, которые отражаются в СТО.
Основанием заявляемых сроков годности готовых продуктов считаются результаты долгосрочных испытаний их стабильности.
Согласно статьям Государственной Фармакопеи XI термин «срок годности» определяет время, в течение которого лекарственные средства (кормовые добавки) сохраняют свои свойства по всем показателям качества, предусмотренным СТО.
Согласно проекту СТО на кормовую добавку Кератопептид критериями оценки качества служили следующие показатели: внешний вид, номинальный объем упаковки, показатель концентрации водородных ионов, массовая доля белка, массовая доля цистина, токсичность и стерильность.
Предложенные качественные и количественные методы контроля кератинсодержащей кормовой добавки, позволяют обеспечить оптимальный уровень качества продукта в процессе его производства и хранения.
Для установления гарантированного срока годности кормовой добавки Кератопептид и условий хранения проведены исследования стабильности препарата в условиях естественного хранения при температуре. Исследование образцов проводили через 6, 12, 18 и 24 месяца после закладки на хранение.
Результаты проведенных исследований представлены в табл. 8.
Таблица 8. Стабильность кератинсодержащей кормовой добавки Кератопептид при 25±2 °С, (n = 3)
Наименование показателя
|
Характеристика и норма согласно СТО
|
Характеристика показателя в процессе хранения
|
Соответствие нормам
|
Через 6 мес.
|
Через 12 мес.
|
Через 18 мес.
|
Через 24 мес.
|
Внешний вид
|
Темно-коричневая жидкость
|
Темно-коричневая жидкость
|
Темно-коричневая жидкость
|
Темно-коричневая жидкость
|
Темно-коричневая жидкость
|
Соответствует
|
рН раствора
|
6,7 ± 0,3
|
6,75±0,01
|
6,75±0,01
|
6,76±0,01
|
6,76±0,01
|
Соответствует
|
Номинальный объем, см3
|
100 + 2%
|
102,67±0,39
|
102,67±0,39
|
102,67±0,39
|
102,33±0,31
|
Соответствует
|
Массовая доля белка, мг/см3
|
82,0±1,0
|
81,80±0,40
|
81,80±0,40
|
81,60±0,30
|
81,40±0,20
|
Соответствует
|
Массовая доля цистина, мг/см3
|
5,0 ± 0,5
|
5,17±0,14
|
5,16±0,13
|
5,13±0,13
|
5,08±0,14
|
Соответствует
|
Токсичность, в тест-дозе 1см3 на мышь
|
Нетоксичен
|
Нетоксичен
|
Нетоксичен
|
Нетоксичен
|
Нетоксичен
|
Соответствует
|
Стерильность
|
Стерилен
|
Стерилен
|
Стерилен
|
Стерилен
|
Стерилен
|
Соответствует
|
Обработка результатов проведенных исследований показала, что качественные и количественные показатели кератинсодержащей кормовой добавки Кератопептид при хранении при температуре 25±2 °С в течение 24 месяцев оставались практически без изменений, т.е. разница значений не достоверна. Таким образом, установлено, что срок хранения Кератопептида в течение 2 лет не оказывает существенного влияния на свойства и не снижает качество продукта. Полученные результаты позволили включить в инструкцию по применению и СТО срок годности препарата 2 года с даты изготовления.
2.2.4 Бактериологический контроль стерильности кормовой добавки
Кератопептид
Стерильность кормовой добавки определяли в соответствии ГОСТом 28085-89 «Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности».
Из трех флаконов испытуемой серии кормовой добавки по 10 см3 объединяли, разбавляли стерильным физраствором 1:10 и производили посев в МПА, МПБ и жидкую среду Сабуро по 3 пробирки, среду Китта-Тароцци – по 2 пробирки.
Для выявления аэробов высевали по 0,5 см3 образца в одну пробирку, а для выявления анаэробов - по 1 см3.
Пробирки с посевами на всех средах, кроме среды Сабуро, выдерживали в термостате 7 суток при 37 °С, на среде Сабуро – при 21°С.
По истечении указанного срока делали пересев, за исключением посева на МПА. Пересевали пробы на те же питательные среды и в тех же объемах, что и при посеве. Вторичные посевы выдерживали 7 суток.
В результате испытания было установлено, что все испытуемые образцы были стерильными - ни в одной из пробирок визуально не было отмечено роста бактериальной и грибной микрофлоры. При микроскопическом анализе посевов микробных клеток не обнаружено. Предлагаемая нами технология обеспечивает получение стерильной кормовой добавки.
Таким образом, кормовая добавка Кератопептид, полученная на основе гидролиза шерсти овец комбинированным методом, содержащая в своем составе в качестве основных компонентов: пептиды, аминокислоты, в том числе серосодержащие, представляет собой стерильную темно - коричневую жидкость специфического запаха.
2.2.5 Изучение токсичности и ростостимулирующей активности кормовой добавки Кератопептид
Токсичность кормовой добавки определяли методом биотестирования параллельно на кроликах (кожная проба) и на беспородных белых мышах согласно ГОСТ Р-52337-2005 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности».
2.2.5.1 Изучение токсичности кормовой добавки Кератопептид
на кроликах
Изучение дермонекротического воздействия на кожу животных проводили на 5 кроликах породы шиншилла массой 2,0 – 2,2 кг. Для постановки опыта у кроликов на участке кожи размером 6х6 см в области бедра тщательно выстригали волосяной покров, на выстриженный участок кожи кроликов пластиковой лопаткой наносили кормовую добавку. На следующий день проводили повторное нанесение. В качестве контроля использовали оголенный участок кожи размером 6х6 см, на который не наносили препарат. Наблюдение за реакцией продолжали в течение 3 суток, начиная со следующего дня после повторного нанесения Кератопептида. У опытных животных не было отмечено воспалительного процесса на участках с нанесенным препаратом.
2.2.5.2 Изучение токсичности кормовой добавки Кератопептид
на белых мышах
Влияние кормовой добавки Кератопептид на пищеварительную систему теплокровных животных изучали на беспородных белых мышах массой 18-20 г.
Для этого были сформированы опытная и контрольная группы по 5 животных в каждой.
Мышам опытной группы с помощью шприца с тупой изогнутой иглой длиной 4 см вводили однократно внутрижелудочно предельно допустимый объем (1,0 см3) кормовой добавки.
Наблюдение за клиническим состоянием лабораторных животных вели в течение 3 суток. После завершения эксперимента всех животных усыпляли эфиром и вскрывали.
Влияние кормовой добавки Кератопептид на мышей оценивали по внешнему виду внутренних органов (желудочно-кишечного тракта, печени, селезенки, почек).
При проведении испытаний по определению токсичности на белых мышах было установлено, что в течение трех суток эксперимента все животные опытной и контрольной групп оставались клинически здоровыми. При вскрытии мышей опытной группы не выявлено видимых изменений внутренних органов в сравнении с контролем.
По совокупности реакций в обоих параллельных методах можно сделать вывод, что исследуемая кормовая добавка Кератопептид является нетоксичной.
Отсутствие вредного воздействия испытуемой кормовой добавки при однократном введении в желудок в большой концентрации (4000 мг в пересчете на белок на 1 кг массы животного) явилось основанием для испытания ростостимулирующих свойств различных концентраций Кератопептида на белых мышах.
2.2.5.3 Определение ростостимулирующей активности кормовой добавки Кератопептид на белых мышах
Для исследования ростостимулирующей активности кормовой добавки были сформированы 4 группы мышей массой 12-14 г, по 10 животных в каждой.
Первую группу - контрольную, кормили приготовленным гранулиро-ванным кормом из дробленого зерна. Кормовую смесь для животных второй, третьей, четвертой опытных групп готовили с добавлением препарата в пересчете на белок, соответственно, по 0,2 %, 2 %, 20 % от массы корма. Кормовую смесь насыпали в кормушки и пополняли по мере поедания. Все кормушки были снабжены поилками.
Наблюдение за животными вели в течение месяца. Взвешивание проводили через 2-3 дня.
Полученные в ходе исследований данные были обработаны статистически (табл. 9).
Таблица 9. Динамика изменения массы тела подопытных белых мышей, (n=10)
Дата взвешивания
|
Масса тела, г
|
Группа
|
I – контрольная
|
II – опытная
|
III – опытная
|
IV – опытная
|
X±mх
|
X±mх
|
X±mх
|
X±mх
|
14.05.2007
|
12,1±0,2
|
12,0±0,3
|
12,3±0,2
|
12,2±0,2
|
17.05.2007
|
13,7±0,2
|
13,6±0,2
|
13,6±0,2
|
13,8±0,2
|
21.05.2007
|
14,8±0,2
|
15,0±0,2
|
14,8±0,2
|
14,9±0,2
|
24.05.2007
|
15,4±0,2
|
15,7±0,2
|
15,7±0,2
|
15,8±0,3
|
28.05.2007
|
17,4±0,2
|
17,5±0,2
|
17,0±0,3
|
17,3±0,3
|
31.05.2007
|
18.2±0,2
|
18,4±0,3
|
18,2±0,3
|
18,1±0,2
|
04.06.2007
|
19,7±0,3
|
20,1±0,2
|
20,0±0,3
|
19,8±0,3
|
07.06.2007
|
21,1±0,3
|
22,3±0,3
|
21,8±0,3
|
21,3±0,4
|
11.06.2007
|
23,2±0,3
|
24,7±0,3
|
23,9±0,3
|
22,8±0,3
|
14.06.2007
|
23,4±0,2
|
24,8±0,2
|
24,1±0,2
|
22,7±0,2
|
Кормление животных приготовленной гранулированной кормовой смесью, содержащей Кератопептид, вызывало более выраженный прирост массы во второй и третьей группе по сравнению с контрольной.
При введении Кератопептида в кормовую смесь в концентрации 0,2 % и 2 % от массы корма наблюдалось статистически достоверное увеличение массы тела мышей через 4 недели от начала постановки опыта на 6 % и 3 % при td I-II = 5,0; td I-III= 2,5 (tst = 2,3)
У животных IV группы наблюдалось статистически достоверное снижение массы тела на 3 % (при td I-IV = 2,5)
Наблюдение за животными на протяжении всего опыта не выявило каких-либо изменений в поведенческих показаниях животных контрольной и опытных групп.
Животные опытных и контрольных групп на протяжении всего периода наблюдения вне зависимости от концентрации введения изучаемого препарата в кормовую смесь были подвижными и активными. Было также отмечено, что у животных четвертой группы поедаемость корма во второй половине опыта снизилась.
Действие кормовой добавки на организм мышей также оценивали при определении биохимических, гематологических показателей крови (табл. 10).
Таблица 10. Показатели крови мышей, (n=10)
Показатель крови
|
До применения кормовой добавки (X±mх)
|
Через 30 дней (X±mх)
|
I –
контрольная
|
II –
опытная
|
III –
опытная
|
IV –
опытная
|
I –
контрольная
|
II –
опытная
|
III –
опытная
|
IV –
опытная
|
Гемоглобин,
г/л
|
96,2±2,4
|
95,8±3,1
|
97,6±4,1
|
96,6±2,8
|
96,8±3,5
|
97,3±4,4
|
98,2±3,8
|
96,3±2,6
|
Эритроциты, 1012/л
|
8,6±0,4
|
8,1±0,2
|
9,1±0,5
|
8,9±0,4
|
8,4±0,5
|
8,6±0,5
|
9,2±0,6
|
8,9±0,3
|
Лейкоциты, 109/л
|
9,4±0,9
|
9,7±0,7
|
10,5±0,9
|
9,9±0,6
|
9,6±0,8
|
10,1±0,8
|
10,3±0,6
|
9,8±0,9
|
Белок, г/л
|
67,1±2,0
|
66,9±1,5
|
68,1±2,3
|
67,8±1,8
|
67,3±1,8
|
67,2±1,3
|
68,2±2,8
|
67,9±1,6
|
Клинический анализ крови не выявил статистически значимых изменений показателей крови мышей при завершении эксперимента.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемая кормовая добавка является стерильным, нетоксичным продуктом и при использовании его в малых концентрациях оказывает стимулирующие действие на белых мышей.
Полученные положительные результаты испытания Кератопептида на лабораторных животных явились предпосылкой для изучения влияния его на продуктивные свойства пушных зверей.
|
