COOH COOH COOH
Цистин Цистеин
Увеличение концентрации ионов ОН- увеличивает скорость реакции, при условии, что концентрация восстановительного иона остается постоянной. Увеличение концентрации восстановительного иона увеличивает скорость реакции, тогда как одновременное увеличение концентраций ионов ОН- и восстановительного приводит также к более энергичному растворению волоса.
По мнению Архипова Г.С., 1988 и Страхова И.П., 1979, механизмы действия сульфита натрия и гидроксида натрия на расщепление дисульфидных связей в кератиновом сырье имеют некоторые различия.
В щелочной среде под действием ионов ОН- происходит разрыв дисульфидной связи по следующей схеме:
HOH
R – CH2 – S – S – CH2 – R R – CH2 – SH + R – CH2 – SOH
(остаток (остаток сульфеновой
цистина) кислоты)
Данная реакция является обратимой, так как образующиеся концевые группы – SH и – SOH могут вступать в новые взаимодействия. Поэтому, чтобы исключить восстановление четвертичной структуры кератина за счет образования – S – S – связей целесообразно введение в реакционную смесь сульфита натрия (Nа2S03). Сульфит натрия вступает в активное взаимодействие с остатками сульфеновой кислоты с образованием натриевых солей:
R – CH2 – SOH R – CH2 – SNa + другие серосодержащие кислоты
Для исследования выше изложенных аспектов нами была проведена серия опытов гидролиза шерсти согласно второй схеме.
Поскольку эффект обработки кератинсодержащего сырья химическими компонентами зависит от концентрации и времени воздействия, представляло интерес исследовать действие временного фактора на растворимость сырья.
Гидромодуль обработки сырья также оказывает достаточно большое влияние на разрушение прочных белковых структур и полноту извлечения целевых компонентов. Для частичной деструкции и обеспечения последующего рационального гидролиза под действием фермента необходимо установить объем воды в реакционной смеси, обеспечивающее нужное количество и соотношение продуктов реакции.
Действие реагентов при обработке овечьей шерсти оценивали при гидромодулях в диапазоне 1:5 - 1:15. Концентрация химических веществ подобрана нами экспериментально с учетом имеющихся в литературе данных.
Эффективность влияния испытуемых веществ на кератинсодержащее сырье определяли по растворимости сырья и содержанию растворимого белка в образцах после воздействия.
Для определения степени растворения шерсти, через каждые три часа отбирали пробы по три центрифужных флакона объемом 50 см3. Не растворенную часть сырья отделяли от гидролизата путем центрифугирования образцов в течение 20 мин при 3000 об/мин. Степень растворения шерсти определяли путем соотношения объема осадка к надосадочной жидкости.
Результаты исследований представлены на рис.1.
В надосадочной жидкости определяли концентрацию белка.
Как показали результаты исследований (рис. 1), после воздействия реакционной смеси при гидромодуле 1:7,5 (2:15) в течение 3 часов при комнатной температуре растворимость шерсти составила 32,6 %.
Гидромодуль 1:7,5 обеспечивает достаточно высокую степень растворимости гидролизованного кератинового сырья - его остаточное количество после 12 часов воздействия не превышает 15,1 %.
Рисунок 1. Растворимость кератинсодержащего сырья
Таким образом, в результате исследований выявлена следующая закономерность для кератинового сырья: с увеличением гидромодуля при его предварительной обработке повышается растворимость сырья.
Наибольшая растворимость сырья была отмечена при гидромодуле 1:15, однако обработка сырья при таких условиях значительно снижает массовую долю растворимого белка до 49,0 мг/см3 (табл. 3).
Таблица 3. Характеристика гидролиза кератинсодержащего сырья при различных гидромодулях обработки, (n=3)
Гидромодуль
|
Растворимость кератинсодержащего сырья, %
|
Белок, мг/см3
|
Время воздействия
|
3 часа
|
6 часов
|
9 часов
|
12 часов
|
1:5
|
17,8±0,4
|
37,9±0,7
|
53,3±0,8
|
67,2±0,8
|
114,0
|
1:7,5 (2:15)
|
32,6±0,4
|
51,3±0,8
|
69,5±1,1
|
84,9±1,0
|
96,0
|
1:15
|
36,1±0,5
|
52,6±0,8
|
71,1±0,8
|
85,9±1,1
|
49,0
|
Таким образом, на основании результатов проведенных исследований обработка при гидромодуле 1:7,5 была определена как наиболее рациональный режим.
Согласно второй схеме сырье обрабатывали раствором, содержащим 3 % гидроксида натрия и 1 % перекиси водорода с добавлением 0,5 % сульфита натрия. Гидролиз проводили при комнатной температуре в течение 12 часов. После окончания гидролиза полученный кератинсодержащий продукт нейтрализовали ортофосфорной кислотой до pH 6,7.
Результаты исследования аминокислотного состава полученного гидролизата представлены в табл. 4.
Таблица 4. Результаты аминокислотного анализа гидролизата кератина, мг/см3, (n=3)
Наименование определяемых показателей
|
Значение определяемых показателей
|
X±mх
|
|
Сv, %
|
1
|
2
|
3
|
4
|
лизин
|
1,83±0,04
|
0,05
|
2,90
|
гистидин
|
0,96±0,04
|
0,05
|
5,21
|
аргинин
|
7,33±0,06
|
0,08
|
1,13
|
аспарагиновая кислота
|
6,37±0,05
|
0,07
|
1,02
|
Продолжение таблицы 4. Результаты аминокислотного анализа гидролизата кератина, мг/см3, (n=3)
Наименование определяемых показателей
|
Значение определяемых показателей
|
X±mх
|
|
Сv, %
|
1
|
2
|
3
|
4
|
треонин
|
3,75±0,07
|
0,10
|
2,67
|
серин
|
6,11±0,04
|
0,05
|
0,87
|
глутаминовая кислота
|
14,71±0,09
|
0,12
|
0,82
|
пролин
|
13,16±0,03
|
0,04
|
0,33
|
глицин
|
5,78±0,03
|
0,04
|
0,71
|
аланин
|
3,44±0,05
|
0,07
|
2,15
|
цистин
|
0,61±0,02
|
0,02
|
3,77
|
валин
|
4,21±0,02
|
0,03
|
0,62
|
метионин
|
0,55±0,02
|
0,02
|
3,85
|
изолейцин
|
2,18±0,02
|
0,03
|
1,47
|
лейцин
|
6,89±0,04
|
0,06
|
0,83
|
тирозин
|
4,28±0,03
|
0,05
|
1,10
|
фенилаланин
|
2,92±0,03
|
0,04
|
1,44
|
общий белок
|
96,0±0,60
|
0,90
|
0,21
|
Полученные образцы гидролизатов шерсти по схеме 1 и 2 характеризовались значительной растворимостью кератинового сырья 88,1%; 84,9% и растворимого белка 69,0 мг/см3, 96,0 мг/см3 соответственно.
На основании анализа аминокислотного состава установлено, что исследованные гидролизаты были с низким содержанием серосодержащих аминокислот. Приведенные результаты исследований свидетельствуют о том, что по второму варианту удалось получить раствор кератина с более высоким содержанием белка в сравнении с первым, однако интенсификация гидролиза шерсти в результате совместного воздействия гидроксида натрия и сульфита натрия приводит к значительному разрушению серосодержащих аминокислот.
Этот факт явился основанием для проведения дальнейших исследований направленных на изыскание методических приемов по подбору и оптимизации щадящих методов гидролиза кератинсодержащего сырья.
Для решения этого вопроса был применен третий вариант получения гидролизата, включающий кратковременный щелочной гидролиз раствором, содержащим гидроксид натрия, пероксид водорода и сульфит натрия с последующим воздействием протеолитическим ферментным препаратом.
В настоящее время ассортимент ферментных препаратов, выпускаемых промышленностью, ограничивается 4-6 наименованиями, предназначенными, в основном, для применения в технологии комбикормов. На отечественном рынке потребителей ферментных препаратов в основном пользуются продукцией зарубежных производителей.
В нашей работе был испытан коммерческий ферментный препарат Оллзайм ФД (Allzyme Feather Digest) производства Alltech, Inc. (США), зарегистрированный в РФ (регистрационный номер ПВИ – 2 – 0,2/01161, от 25.12.2002) и рекомендованный для промышленной переработки пера в перьевую муку. Ферментный препарат, выделенный из культуры Aspergillus niger с активностью грибной протеазы 12500 НUT/г и липазы 130 LU/г.
Поскольку эффект обработки кератинсодержащего сырья зависит от концентрации и времени воздействия, представляло интерес исследовать влияние различных концентраций ферментного препарата Оллзайм ФД и времени ферментативного воздействия на растворимость сырья при комнатной температуре. Для решения задачи по определению оптимальной концентрации ферментного препарата массовую долю ферментного препарата изменяли в диапазоне 0, 5 г; 1,0 г; 1,5 г фермента на 1 кг обрабатываемого сырья.
Растворимость кератинсодержащего сырья определяли после 3, 6 и 9 часов ферментативного воздействия (рис. 2).
Для улучшения технологических показателей процесса получения Кератопептида на стадии предварительной обработки кератинсодержащего сырья щелочным раствором были определены значения рациональных режимных параметров: гидромодуля – 1:7,5 и времени обработки – 3 часа.
В результате воздействия на шерсть раствором, содержащим 3 % гидроксида натрия, 1 % перекиси водорода и 0,5 % сульфита натрия при комнатной температуре через 3 часа в растворимое состояние переходило 32,6 %.
Предварительная кратковременная (3 часа) обработка шерсти раствором содержащем 3 % NaOH, 1 % Н2О2 и 0,5 % Na2SO3 при гидромодуле 1:7,5 значительно стимулировала последующий ферментативный гидролиз подготовленного сырья. Ферментативный гидролиз проводили после нейтрализации щелочи ортофосфорной кислотой до рН 6,7. Через шесть часов воздействия раствором, содержащим фермента 1г на 1 кг исходного сырья при комнатной температуре, в растворимое состояние переходило - 72,5 % сырья, при этом концентрация белка составила 81,9 мг/см3.
Добавление ферментной системы Оллзайм ФД из расчета 0,5 г на 1 кг сырья через 6 часов воздействия при комнатной температуре переходило в растворимое состояние только 65,9 % шерсти.
Незначительный рост (всего на 1,9 %) растворимости сырья продолжался до внесения дозы 1,5 г/кг. При такой дозировке овечья шерсть растворялась до 74,4 % после шести часов ферментативного воздействия. Полученные данные свидетельствуют о неэффективном расходовании препарата в концентрации 1,5 г фермента/кг шерсти.
а) – 0,5г фермента/кг сырья
б) – 1,0г фермента/кг сырья
в) – 1,5г фермента/кг сырья
Рисунок 2. Растворимость кератинсодержащего сырья
Таким образом, на основании анализа полученных результатов проведенной серии опытов был выбран рациональный для гидролиза шерсти овец технологический прием, включающий предварительную кратковременную (3 часа) обработку шерсти раствором содержащем 3 % NaOH, 1 % Н2О2 и 0,5 % Na2SO3 при гидромодуле 1:7,5. После нейтрализации щелочи ортофосфорной кислотой до pH 6,7 в полученную систему добавляли фермент из расчета 1 г на 1 кг шерсти и проводили гидролиз в течение шести часов при комнатной температуре.
Полученный кератинсодержащий продукт также исследовали на содержание белка и аминокислот.
Результаты исследований проведенных опытов приведены в табл. 5.
Таблица 5. Результаты аминокислотного анализа Кератопептида, мг/см3, (n=3)
Наименование определяемых показателей
|
Значение определяемых показателей
|
X±mх
|
|
Сv, %
|
лизин
|
2,03±0,21
|
0,21
|
10,34
|
гистидин
|
1,74±0,03
|
0,04
|
2,18
|
аргинин
|
6,48±0,15
|
0,21
|
3,24
|
аспарагиновая кислота
|
5,17±0,10
|
0,14
|
2,71
|
треонин
|
2,96±0,11
|
0,16
|
5,37
|
серин
|
4,89±0,04
|
0,05
|
1,06
|
глутаминовая кислота
|
11,15±0,68
|
0,95
|
8,48
|
пролин
|
5,29±0,11
|
0,16
|
2,93
|
глицин
|
4,01±0,09
|
0,12
|
2,97
|
аланин
|
3,23±0,05
|
0,07
|
2,17
|
цистин
|
5,18±0,14
|
0,20
|
3,80
|
валин
|
4,17±0,20
|
0,28
|
6,67
|
метионин
|
0,54±0,01
|
0,01
|
1,85
|
изолейцин
|
2,47±0,07
|
0,09
|
3,68
|
лейцин
|
5,78±0,35
|
0,49
|
8,48
|
тирозин
|
3,42±0,17
|
0,23
|
6,84
|
фенилаланин
|
2,74±0,02
|
0,03
|
1,13
|
общий белок
|
81,90±0,40
|
0,06
|
0,73
|
По предложенной методике бóльшая часть гидролиза щелочью заменена на ферментативный гидролиз. При проведении операций по предлагаемой третьей схеме технологический цикл сокращается на 31 час в равнении с исследуемым запатентованным способом.
Сравнительная характеристика гидролизатов шерсти, полученных различными методами представлена в табл. 6.
Таблица 6. Сравнительная характеристика гидролизатов шерсти, полученных различными методами, (n=3)
Способ получения гидролизата
|
Использовано сырья, кг
|
Получено гидролизата, дм3
|
Содержание белка в гидролизате, мг/ см3
|
Содержание цистина, мг/ см3
|
Нерастворенный остаток, кг
|
I – схема
|
1,00
|
9,88 ±0,05
|
69,20 ± 0,90
|
1,13 ± 0,03
|
0,12 ±0,04
|
II – схема
|
1,00
|
7,36 ±0,03
|
96,00 ± 0,60
|
0,61 ± 0,02
|
0,14 ±0,03
|
III – схема
|
1,00
|
7,22 ±0,04
|
81,90 ± 0,40
|
5,18 ± 0,14
|
0,28 ±0,03
|
Анализ аминокислотного состава образцов, полученных различными методами гидролиза, показал, что последовательность операций, согласно предлагаемой нами методике, позволяет получить продукт с максимальным содержанием серосодержащих аминокислот по сравнению с исследуемыми способами.
Исходя из сравнительно высокого содержания серосодержащей аминокислоты цистина, разрушение целостности пептидных цепочек кератина шерсти овец происходит незначительное в результате комбинированного гидролиза с применением ферментного препарата Оллзайм ФД.
|
