Методические рекомендации по выявлению возбудителя листериоза listeria monocytogenes в рыбе и рыбной продукции

Скачать 336.17 Kb.

Название	Методические рекомендации по выявлению возбудителя листериоза listeria monocytogenes в рыбе и рыбной продукции
страница	1/3
Тип	Методические рекомендации

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Методические рекомендации

1 2 3

Государственный комитет Российской Федерации по рыболовству

Национальный центр качества и безопасности рыбной продукции

(Нацрыбкачество)

Мухина Л. Б., Дмитриева Е. Ю., Борисовская Э. Н.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по выявлению возбудителя листериоза

LISTERIA MONOCYTOGENES

в рыбе и рыбной продукции

Санкт-Петербург

«Моринтех»

2003

УДК 637.56:576.8

ББК 36.1 +36.94

Рекомендовано к публикации решением Научно-технического совета «Нацрыбкачество» от 21 октября 2002 г.

Мухина Л. Б., Дмитриева Е. Ю., Борисовская Э. Н. Методические рекомендации по выявлению возбудителя листериоза Listeria monocytogenes в рыбе и рыбной продукции. - СПб.: Моринтех, 2003. -28с.

Методические рекомендации разработаны сотрудниками Национального центра качества и безопасности рыбной продукции (Санкт-Петербург) на основе многолетнего опыта исследовательской работы по оценке эффективности различных методов выявления патогенных листерий в рыбной продукции. В основу Методических рекомендаций положены ГОСТ 51921-2002, МУК 4.2.1122-02 и международный стандарт ISO 11290-1. В Методических рекомендациях освещены биологические особенности листерий, существенные для их выявления и идентификации в неклинических образцах, а также специфические проблемы, возникающие при анализах рыбных продуктов. Методические рекомендации предназначены для использования в качестве отраслевого документа микробиологами испытательных центров в рутинных и арбитражных микробиологических анализах, а также предприятиями, организациями, учреждениями, деятельность которых осуществляется в области обращения пищевой рыбной продукции.

The manual is developed by specialists of the National Center of quality and safety of fishery products (St.-Petersburg) on the basis of long-term experience in research of efficiency evaluation of various methods of pathogenic listeria revealing in fishery products. The Manual is based on the standards of the Russian Federation ГОСТ 51921 -2002, МУК 4.2.1122-02 and the international standard ISO 11290-1. The biological properties of listeria, essential for their revealing and identification in samples that are not clinical, as well as specific problems arising at the analyses of fishery products are covered in the Manual. The manual is intended to be used by microbiologists of test centers and offish industry during the routine and arbitration microbiological analyses, and also by enterprises, organizations, establishments, carrying out their activities is in the field of food fishery products handling.

ISBN 5-93887-017-8 © Мухина Л. Б., 2003

© Дмитриева Е. Ю., 2003

© Борисовская Э. Н., 2003

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Целью настоящих Методических рекомендаций является повышение эффективности и сокращение продолжительности процедуры выявления возбудителя листериоза — Listeria monocytogenes в свежей, охлажденной, мороженой рыбе и продукции, изготавливаемой из нее.
Методические рекомендации предназначены для использования в рутинных и арбитражных микробиологических анализах микробиологическими лабораториями рыбной отрасли, предприятиями, организациями, учреждениями, деятельность которых осуществляется в области обращения пищевой рыбной продукции, организациями Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и санитарно-эпидемиологических служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющими государственный и ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством пищевой рыбной продукции.
Настоящие Методические рекомендации разработаны в соответствии с ГОСТ 51921 -2002, МУК 4.2.1122-02 и международным стандартом ISO 11290-1.

2. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

2.1. Listeria monocytogenes — бактериальный патоген III группы опасности.

2.2. L. monocytogenes способна сохранять жизнеспособность и размножаться вне организма хозяина. L. monocytogenes встречается в загрязненной стоками озерной, речной воде, в прибрежной зоне заливов. L.monocytogenes может поселяться на поверхности тела рыб, используя в качестве источника питания эскулин рыбьей слизи.

Присутствие L.monocytogenes в рыбе и рыбной продукции характеризуется низкой численностью и неравномерным распределением.
Обнаружение L. monocytogenes в рыбе и рыбной продукции усложняется следующими обстоятельствами: пониженной жизнеспособностью клеток L.monocytogenes, низкой скоростью их размножения, присутствием посторонней микрофлоры, превышающей численность листерий на несколько порядков.
В этих условиях выявление листерий достигается проведением стадии накопления в богатой питательной среде в два этапа. На первом этапе накопления концентрацию антибиотиков снижают в два раза. В результате этого поврежденные клетки листерий восстанавливают жизнеспособность и размножаются до уровня, достаточного для их обнаружения. Накопительную культуру высевают на твердую диагностическую среду. Типичные колонии листерий отсевают и идентифицируют до вида по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам. Чувствительность метода — 1—2 жизнеспособные клетки листерий и более в 25 г продукта.
Для повышения надежности и ускорения видовой идентификации листерий рекомендуется использовать наборы для видовой идентификации листерий типа API-тест или автоматический твердофазный иммуноферментный анализатор VIDAS фирмы Biomerieux, Франция. Отобранные клоны, подозрительные на L.monocytogenes, в обязательном порядке следует подтверждать по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам по ГОСТ 51921-2002 и МУК 4.2. И22.

2.7. Персонал отраслевых микробиологических лабораторий перед началом работы по выявлению листерий должен пройти предварительное обучение методам выделения и идентификации патогенных листерий в «Национальном центре безопасности и качества рыбной продукции» («Нацрыбкачество») или уполномоченных им лабораториях и получить аттестационное удостоверение.

3. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ

3.1.Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii и Listeria seeligeri — контрольные штаммы для проверки правильности проведения тестов, Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi — для САМР-теста — получают через «Нацрыбкачество».

4. СРЕДЫ И РЕАГЕНТЫ

4.1. Среды для поддержания изолятов, выращивания посевного материала, проверки подвижности.

4.1.1. Питательный агар с 1% глюкозы и питательный бульон с 1% глюкозы, полужидкий питательный агар с 1% глюкозы и 0,8% агар-агара или их западные аналоги.

4.2. Среды накопления.

4.2.1. Питательный бульон для выделения листерий — ПБЛ (ГНЦ «Прикладная микробиология», Оболенск). Состав среды (г/л): гидролизат казеина ферментативный 10,0; пептон ферментативный мясной— 15,0; гидролизат автолизованных дрожжей — 2,0; хлорид натрия — 3,5; хлорид лития — 3,0; рН 7,0±0,2. Перед употреблением к 1 л основы среды добавляли 4,44 мл раствора антибиотиков (в 10 мл физиологического раствора растворить 10 мг налидиксовой кислоты, 5 мг акриф-лавина, 5 мг полимиксина В сульфата).

4.2.2. Бульон Фразера (Fraser broth) — прототип среды ПБЛ. Состав среды (г/л): гидролизат казеина ферментативный — 5,0; мясной пептон — 5,0; дрожжевой экстракт — 5,0; хлорид натрия— 20,0; дигидрофосфат калия— 1,35; гидрофосфат натрия — 12,0; эскулин — 1,0; хлорид лития — 3,0; цитрат аммонийного железа — 0,5; рН 7,2. На 1-й стадии накопления на 1 л среды добавляют селективные компоненты: налидиксовой кислоты — 10 мг, акрифлавина — 12,5 мг; на 2-й стадии — эти же добавки вносят в 0,5 л среды.

4.2.3. L-PALCAM-бульон (L-PALCAM-Listeria Selective Enrichment Broth) — отечественный аналог отсутствует. Данная среда используется в одну стадию накопления, рекомендуется для обнаружения листерий в образцах с высокой численностью посторонней микрофлоры. Состав среды (г/л): пептон — 23,0; крахмал — 1,0; натрий хлористый — 5,0; маннит — 10,0; железо аммоний цитрат — 0,5; эскулин — 0,8; глюкоза— 0,5; литий хлористый — 15,0; феноловый красный — 0,08. Селективные агенты: налидиксовой кислоты — 20 мг, 0,01 полимиксина В сульфата— 10 мг, акрифлавина— 10 мг растворяли в 10 мл стерильной дистиллированной воды, вносили 4,44 мл в 1 л среды, рН 7,2.

4.3. Диагностические среды.

4.3.1. Питательный агар для выделения листерий — ПАЛ (ГНЦ «Прикладная микробиология», Оболенск). Состав среды (г/л): гидролизат казеина панкреатический — 10,0; гидролизат автолизованных дрожжей — 2,0; хлорид натрия — 3,5; хлорид лития— 15,0; цитрат аммонийного железа — 0,5; эскулин — 0,8; агар-агар — 13,0; рН 7,2±0,2. Селективные агенты: налидиксовой кислоты — 20 мг, полимиксина В сульфата —10 мг, акрифлавина — 10 мг растворяли в 10 мл стерильной дистиллированной воды, вносили 4,44 мл в 1 л среды.

4.3.2. L-PALCAM-агар (L-PALCAM-Listeria Selective Agar) — отечественный аналог отсутствует. Состав среды (г/л): пептон — 23,0; крахмал — 1,0; хлорид натрия — 5,0; эскулин — 0,8; хлорид лития — 15,0; цитрат аммонийного железа — 0,5; глюкоза — 0,5; маннит— 10,0; феноловый красный — 0,08; агар-агар— 13,0. рН 7,0±0,2. На 1л среды добавляли: акриф-лавина — 5 мг, полимиксина В — 10 мг, цефтацидина — 20 мг в 10 мл стерильной дистиллированной воды.

Питательные среды готовят согласно инструкциям фирм-изготовителей накануне или непосредственно перед использованием. Готовые среды защищают от яркого света, так как акрифлавин, входящий в их состав, может окисляться на свету с образованием продуктов, подавляющих рост листерий.
Среды Гисса, содержащие рамнозу и ксилозу, для определения сбраживающей активности изолятов листерий, их импортные аналоги, или диски с соответствующими источниками углерода. Допускается использовать среды Гисса с агар-агаром.
Кровяной агар для определения бета-гемолитической активности, готовят добавлением к питательному агару, или импортной основе кровяного агара 5% по объему дефибринированной крови или суспензии эритроцитов барана.
Поливалентная листериозная сыворотка для реакции агглютинации на стекле из набора сывороток для типизации листерий (например, Ставропольской биофабрики), поставляется в рабочем разведении.
Питательные среды и диагностикумы для быстрой видовой идентификации листерий.

4.8.1. «API-Listeria» — стриповый диагностикум фирмы Biomerieux (Франция) для идентификации видов листерий по биохимическим признакам и способности листерий к гемолизу, используется по инструкции фирмы-изготовителя.

4.8.2. «VIDAS LMO/miniVIDAS LMO» — набор фирмы BioMerieux (Франция) для автоматического анализатора VIDAS/miniVIDAS для обнаружения L.monocytogenes на стадии диагностики методом твердофазной ферментзависимой иммунофлюоресценции используется по инструкции фирмы-изготовителя.

4.9. Физиологический раствор (0,85%-ный водный раствор хлорида натрия) — для реакции агглютинации и приготовления разведений накопительных культур.

5. МЕТОДЫ ОТБОРА И ПОДГОТОВКИ ПРОБ К АНАЛИЗУ

При анализе продукции, поставляемой на внутренний рынок, содержание L.monocytogenes оценивают количественно методом наиболее вероятных чисел, выявляя патоген в 3 повторностях по 10 г, 1г и 0,1г. При анализе экспортной рыбной продукции содержание L.monocytogenes оценивают альтернативным методом (есть/нет) в 5 точечных пробах по 25 г.
Подготовка проб к анализу.

5.2.1. При анализе продукции, поставляемой на внутренний рынок, отбирают 2 точечные пробы по 25 г. При наличии кожи в исследуемом продукте ее обязательно вводят в состав отбираемой пробы в максимальном количестве, но не более половины массы пробы. Пробы измельчают до кусочков размером 1 см³, хорошо перемешивают и отвешивают 3 раза по 11,1 г в три стерильных пакета гомогенизатора Стомакер или последовательно в стакан Блендера. К каждой навеске добавляют по 100 мл среды накопления и гомогенизируют образец в течение 1-1,5 мин. Гомогенаты выливают в 3 стерильные колбы. Из каждой колбы переносят в три пустые пробирки по 10 мл гомогената и в три пробирки — по 1,0 мл гомогената. В пробирки с 1,0 мл гомогената дополнительно вносят по 2 мл среды накопления.

В случае анализа экспортной продукции каждую точечную пробу по 25 г помещают в пакет Стомакера или стакан Блендера, приливают 225 мл среды накопления и проводят гомогенизацию в течение 1-1,5 мин. Гомогенаты переносят в 5 стерильных колб для культивирования.
При анализе свежей и охлажденной рыбы, в которой ожидается большое содержание посторонних микроорганизмов, рекомендуется использовать PALCAM-бульон. При анализе образцов, где вероятно присутствие поврежденных клеток листерий (соленая, копченая, сушеная рыба), следует использовать более мягкую среду накопления: ПБЛ или бульон Фразера.

6. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

6.1. Стадия накопления.

Накопление листерий проводят в две стадии. На первой стадии пробы инкубируют при 30°С 24 часа в среде ПБЛ или бульоне Фразера (1/2 концентрации антибиотиков). На второй стадии 0,1 мл культуры переносят в 10 мл среды ПБЛ или бульона Фразера с полной концентрацией антибиотиков. Посевы инкубируют еще 24-48 ч при 30°С.
Накопление листерий в PALCAM-бульоне (п. 5.2.2) проводят в одну стадию, посевы инкубируют при 30°С 48 ч.
Регистрация результатов.

6.1.3.1. В бульоне Фразера (но не в среде ПБЛ) рост листерий сопровождается почернением среды в результате расщепления бактериями эскулина до эскулетина и глюкозы и взаимодействия эскулетина с ионами Fе⁺³. Отсутствие почернения бульона Фразера не является основанием для прекращения анализа с отрицательным ответом.

6.1.3.2. Размножение бактерий, расщепляющих эскулин в PALCAM-бульоне, также сопровождается изменением цвета среды с красной на черную или оливково-коричневую. Слабый рост, нетипичное изменение цвета среды или отсутствие изменения цвета не являются основанием для прекращения анализа с отрицательным ответом.

6.2. Диагностический высев.

Из накопительных культур готовят с помощью физиологического раствора серийные десятикратные разведения и проводят поверхностный высев по 0,1 мл на PALCAM-агар.

Посевы инкубируют 48 ч при 30°С.

Регистрация результатов, выбор клонов для идентификации.

Колонии всех видов листерий на PALCAM-агаре имеют одинаковый внешний вид: на 2-е сутки они маленькие, диаметром 1,0-2,0 мм зеленовато-серые, полупрозрачные с черным ореолом. На 3^-е сутки у колоний листерий темнеет и углубляется центр, что позволяет безошибочно их отличить от колоний посторонних микроорганизмов.
Колонии L.grayi на PALCAM-агаре имеют желтый оттенок, среда вокруг колоний окрашивается в желтый цвет, что указывает на потребление маннита и крахмала (маннит- и крахмал-положительные колонии).
Для идентификации отсевают не менее 10 типичных листериозных колоний, исключая маннит- и крахмал-положительные колонии L.grayi. Потребность в анализе большого числа клонов листерий объясняется присутствием в образце разных видов листерий, а также высокой гетерогенностью популяций L.monocytogenes по идентификационным признакам.

6.3. Стадия подтверждения.

Для идентификации отсеянных клонов листерий, предположительно L.monocytogenes, L.innocua, L.seeligeri, L.ivanovii и L.welshimeri, согласно ГОСТ 51921-2002 и МУК 4.2.1122, следует установить родовые и видовые признаки. К родовым признакам относят: морфологию клеток, окраску по Граму, каталазный тест, проверку подвижности культур при двух инкубационных температурах 22° и 37°С, реакцию агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой к листериям. К видовым признакам относят: сбраживание рамнозы, ксилозы и маннита, бета-гемолитическую активность, САМР-тест.
При окрашивании по Граму (ГОСТ 1044.3) листерий выглядят как короткие грамположительные палочки.
Подвижность проверяют в суточных посевах листерий, выращенных при 22 и 37°С уколом в полужидкий питательный агар. Листерий подвижны при 22°С и слабо подвижны или неподвижны при 37°С. При положительном ответе рост листерий в полужидком агаре напоминает раскрытый зонтик.
Для оценки наличия каталазы на поверхность 1 — 2—суточного штриха проверяемого клона наносят каплю 3-5%-ного свежего водного раствора перекиси водорода. Появление выделяющихся пузырьков газа указывает на наличие каталазы в бактериальных клетках. Листерий образуют катал азу.
Для проведения реакции аглютинации изоляты листерий выращивают при 22-3 0°С на твердой питательной среде в течение 24 ч. Бактериальную массу смывают физиологическим раствором и готовят густую суспензию. Реакцию агглютинации проводят на предметном стекле с помощью поливалентной листериозной агглютинирующей сыворотки согласно инструкции фирмы-изготовителя. Положительная реакция исследуемого изолята с поливалентной сывороткой является признаком, необходимым для его отнесения к роду Listeria, но не достаточным, поскольку у листерий имеются общие поверхностные антигены с бациллами и микрококками.

Для определения сбраживания рамнозы, ксилозы клоны пересевают на короткий пестрый ряд в жидкие среды Гисса. Культивирование проводят при 37°С до 7 дней, ежедневно проверяя кислото- и газообразование. Большинство изолятов L.monocytogenes уже на вторые сутки демонстрирует рост на рамнозе с подкислением без газообразования (табл. 1). Некоторые изоляты L.monocytogenes сбраживают рамнозу на 5-7 день культивирования. Большинство изолятов L.ivanovii и L.seeligeri не сбраживают рамнозу и маннит, но сбраживают ксилозу.
Сбраживание маннита проверяют только у тех клонов, для которых не удалось однозначно установить этот признак на PALCAM-агаре.

Способность к гемолизу.

Исследуемые клоны засевают штрихами на питательный агар с кровью или эритроцитами барана. Посевы инкубируют при 37°С 48 ч. Чашки просматривают в проходящем свете и сравнивают с контрольными высевами музейных штаммов листерий. L.monocytogenes обладает низкой бета-гемолитической активностью и образует, как и L.seeligeri, узкую зону лизиса эритроцитов около 1мм шириной. У L.ivanovii зона гемолиза значительно шире, до 10 мм шириной, и более четкая. У некоторых изолятов L.monocytogenes гемолитическая активность настолько мала, что просветление кровяного агара может быть отмечено только после снятия бактериальной массы с агара петлей. Некоторые изоляты L.monocytogenes лишены гемолитической активности. Под штрихами некоторых изолятов L.innocua на кровяном агаре может наблюдаться просветление питательной среды, связанное с образованием кислотных продуктов метаболизма.

Таблица 1

1 2 3

	Технический регламент Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции"... О принятии технического регламента Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции"		Технический регламент Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции"... О принятии технического регламента Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции"
	Методические и практические рекомендации по выявлению насилия над детьми и подростками Рекомендации педагогам общеобразовательных учреждений по выявлению случаев насилия над детьми		Технический регламент "Требования к безопасности рыбы и рыбной продукции" Об утверждении технического регламента "Требования к безопасности рыбы и рыбной продукции"
	Методические рекомендации москва 2012 аннотация методические рекомендации... Организация мероприятий по раннему выявлению случаев употребления психоактивных веществ в образовательных учреждениях		Методические рекомендации по выявлению, возбуждению и рассмотрению... Методические рекомендации по выявлению, возбуждению и рассмотрению административных правонарушениях, предусмотренных ст. 13. 26 Коап...
	Методические рекомендации по подготовке, выполнению, оформлению и... «Технология продукции общественного питания»: методические рекомендации. – Чпоу «Торгово – технологический колледж»/ Составители:...		Методические рекомендации по выявлению деградированных и загрязненных... Методические рекомендации предназначены для выявления деградированных и загрязненных земель путем обследований предприятиями, организациями...
	Методические рекомендации по проведению контроля (надзора) на территории... По делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации последствий стихииных бедствий		Методические подходы к организации оценки процессов производства... Методические подходы к организации оценки процессов производства (изготовления) пищевой продукции на основе принципов хассп. Методические...
	Методические рекомендации по профилактическим мерам выявлению и предупреждению... Приведены действующие нормативно-правовые документы по основам борьбы с терроризмом в Российской Федерации		Методические рекомендации по профилактическим мерам выявлению и предупреждению... Рекомендации руководителям автотранспортных предприятий, организаций связанных с эксплуатацией автотранспортных средств по профилактическим...
	Приказ от 6 июня 2003 г. №792 об утверждении методических рекомендаций... Утвердить Методические рекомендации по бухгалтерскому учету затрат на производство и калькулированию себестоимости продукции (работ,...		Методические рекомендации включают следующие приложения «О межведомственном взаимодействииорганов и учреждений системы профилактики безнадзорности и правонарушений несовершеннолетних Пермского...
	Методические рекомендации по профилактическим мерам, выявлению и... По предприятию издается приказ «О предупреждении актов терроризма и ликвидации их последствий». В данном приказе назначаются ответственные...		19 мая 2000 года Дата введения Методические указания предназначены: для организаций по производству пищевых продуктов, общественного питания и продовольственной...

Методические рекомендации по выявлению возбудителя листериоза listeria monocytogenes в рыбе и рыбной продукции

Похожие: