Техническое задание
Разработка компонент молекулярно диагностических систем для выявления клинически значимых маркеров генетических, онкологических и инфекционных заболеваний человека
Цель и содержание работы
Целью научно-исследовательской работы по государственному контракту является
создание компонент наборов реагентов, позволяющих с помощью высокопроизводительных методов анализа биополимеров проводить диагностику генетических, онкологических и инфекционных заболеваний человека. Наборы реагентов должны входить в состав модулей, которые можно комбинировать друг с другом в зависимости от выявляемых ДНК/РНК или белковых маркеров заболеваний и соответствующих протоколов проведения анализа. В частности, в рамках проведения данной работы должны быть созданы генно-инженерные конструкты, содержащие фрагменты геномной ДНК/кДНК/РНК патогенных для человека и животных микроорганизмов; должны быть созданы генетические конструкции, предназначенной для экспрессии в клетках Escherichia coli и/или, Pichia pastoris и/или, Kluyveromyces lactis рекомбинантных аналогов природных антигенов микроорганизма Rickettsia rickettsii и вируса Варицелла-Зостер; должны быть созданы генетические конструкции, предназначенной для экспрессии в клетках Escherichia coli рекомбинантного фермента Tth праймазы и термостабильного аналога ДНК полимеразы бактериофага phi29.
Обоснование темы НИР
В настоящее время в Российской Федерации все большую актуальность приобретает разработка доступных для широких слоев населения высокотехнологичных методов диагностики онкологических, генетических, инфекционных заболеваний, в том числе, социально значимых заболеваний. Высокопроизводительные технологии анализа биополимеров на основе методов амплификации нуклеиновых кислот, капиллярного секвенирования, массового параллельного секвенирования и иммунобиочипов позволяют одновременно выявлять сотни и даже тысячи клинически значимых генетических маркеров или патогенных микроорганизмов и за один анализ проводить тестирование сразу нескольких (96 и более) пациентов. За счет этого значительно снижаются параметры длительности и трудоемкости анализа и возрастает пропускная способность лаборатории, выполняющей исследование. Использование отечественных аналогов зарубежных ферментов, антигенов, наборов для пробоподготовки биологического материала, а также специфических положительных контрольных образцов в несколько раз снижает стоимость тестирования образцов и повышает достоверность проводимых анализов с учетом особенностей распределения гаплогрупп населения Российской Федерации и циркулирующих на территории Российской Федерации штаммов микроорганизмов.
В рамках настоящей работы предлагается создание панели положительных контрольных образцов фрагментов геномов патогенных для человека и животных микроорганизмов, биотехнологических продуцентов ферментов модификации нуклеиновых кислот (полимераз), рекомбинантных аналогов природных антигенов, как компонент диагностических систем для выявления маркеров наследственных, онкологических заболеваний, маркеров предрасположенности к некоторым социально значимым заболеваниям, а также возбудителей инфекционных заболеваний человека.
Основные требования к работе.
Экспериментальные работы должны проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические исследования. Условия работы (оборудование и помещения) должны позволять минимизировать вероятность перекрестной контаминации биологического материала. Лаборатория должна иметь возможности для проведения работ с клиническим материалом (цельная кровь, сыворотка, плазма) и обеспечивать биологическую безопасность проведения таких работ персоналом.
В процессе разработки продукции должно быть использовано только сертифицированное оборудование, которое подлежит метрологической аттестации в сроки, определенные инструкцией по его эксплуатации.
Материалы, применяемые при проведении экспериментальных работ, должны быть безопасны по своим химическим, физическим, токсикологическим и микробиологическим свойствам.
Условия лаборатории должны обеспечивать возможность проведения генно-инженерных, молекулярно-биологических работ, а также работ с бактериальными и дрожжевыми штаммами-продуцентами Escherichia coli, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis.
Работы должны проводиться высококвалифицированным научным персоналом, прошедшим подготовку по программам профессионального образования в области микробиологии и молекулярной биологии.
При выполнении работы должна быть обеспечена безопасность научного и технического персонала.
О ходе выполнения работы Исполнитель должен регулярно информировать Заказчика для осуществления координации хода работ. Исполнитель по запросу Заказчика должен представлять отчетные или аналитические материалы о ходе выполнения работ.
Основное содержание НИР
Основным содержанием НИР является:
- Сборка не менее 50 согласованных с заказчиком генно-инженерных конструкций из синтетических олигонуклеотидов (или амплификация фрагментов ДНК из биологического материала) в качестве положительных контрольных образцов для выявления 50 маркеров генетических, онкологических и инфекционных заболеваний человека, клонирование их в плазмидные вектора для препаративной наработки в биотехнологических штаммах Escherichia coli с дефектной системой гомологичной рекомбинации; перечисленные конструкты должны содержать ген устойчивости к ампициллину (bla); проверка генно-инженерных структур должна быть проведена с помощью автоматического капиллярного секвенирования;
- Клонирование не менее 10 согласованных с заказчиком фрагментов для выявления соответствующих ДНК маркеров инфекционных заболеваний человека в вектора на основе бактериофага лямбда (желательно на основе аналогов вектора gt10), наработка и очистка рекомбинантных фаговых частиц в препаративных количествах в штаммах на основе Escherichia coli с высокой частотой лизогении (hfl); проверка генно-инженерных структур должна быть проведена с помощью автоматического капиллярного секвенирования;
- Клонирование не менее 25 согласованных с заказчиком фрагментов для выявления соответствующих РНК маркеров инфекционных заболеваний человека в экспрессирующие вектора в виде химерных последовательностей с геномом бактериофага MS2, наработка и очистка псевдовирусных частиц в препаративных количествах с использованием ультрацентрифугирования в градиенте солей цезия; перечисленные конструкты должны содержать фрагмент гена gag вируса ВИЧ в качестве референсной последовательности для определения титра псевдовирусных частиц; проверка генно-инженерных структур должна быть проведена с помощью автоматического капиллярного секвенирования;
- Создание генно-инженерных конструкций, обеспечивающих гетерологичную экспрессию белков, антигенов, эпитопов Rickettsia rickettsii (ompA, ompB, RpsB, SdhB, YbgF, Rh054_02285) и вируса Варицелла-Зостер (варианты гликопротеина gE) в системах экспресс на основе бактерий Escherichia coli и/или дрожжей Pichia pastoris и/или Kluyveromyces lactis. Для этого должны быть клонированы гены целевых белков, антигенов, эпитопов, определены их нуклеотидные, получены экспрессионные конструкции и созданы высокоэффективные штаммы-продуценты клонированных фрагментов. Должна быть осуществлена экспрессия целевых белков, разработана эффективная методика выделения и очистки. В методике должны быть описаны такие показатели, как степень чистоты полученных белковых и ферментных препаратов, стадии очистки, выход целевых белков, способы характеристики свойств белков и ферментов. Должны быть охарактеризованы основные физико-химические свойства полученных рекомбинантных белков и оценена возможность использования их для проведения серологическгого анализа с применением иммуночипов в качестве иммуносорбента.
- Сборка генно-инженерных конструкций и клонирование их в бактериальные плазмиды для гетерологичной экспрессия рекомбинантного фермента Tth праймазы и термостабильного аналога ДНК полимеразы бактериофага phi29 в штаммах-продуцентах Escherichia coli и/или, Pichia pastoris и/или, Kluyveromyces lactis, очистка и оценка активности перечисленных ферментов с использованием в качестве контрольных препаратов коммерчески доступных аналогов. В рамках выполнения работы должна быть разработана эффективная методика выделения и очистки. В методике должны быть описаны такие показатели, как степень чистоты полученных белковых и ферментных препаратов, стадии очистки, выход целевых белков, способы характеристики свойств белков и ферментов.
Основные результаты работы
В результате выполненной НИР должны быть получены и переданы заказчику плазмидные конструкты (не менее 0,1 мкг плазмидной ДНК) и биотехнологические штаммы-продуценты (глицериновые стоки) рекомбинантных аналогов природных антигенов Rickettsia rickettsii и вируса Варицелла-Зостер (варианты гликопротеина gE), а также рекомбинантных ферментов Tth праймазы и термостабильного аналога ДНК полимеразы бактериофага phi29. Должны быть разработаны и переданы заказчику эффективные методики гетерологичной экспрессии и препаративной очистки перечисленных рекомбинантных белков с использованием аффинной хроматографии низкого давления (на смолах с гепарином, целлюлозой, ионами двухвалентных металлов - Ni2+, Co2+, Cu2+, глутатионом и т.д.) и/или с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и хроматографии на ионообменных смолах. Должны быть представлены результаты тестирования функциональной активности перечисленных белков.
Должны быть получены и переданы заказчику пятьдесят препаратов плазмидных конструктов, составляющих панель положительных контрольных образцов фрагментов инфекционных заболеваний человека. Каждый препарат должен быть представлен в виде 100 мкл раствора очищенной ДНК с концентрацией не менее 1011 плазмидных частиц в мл при пересчете на ген bla.
Должны быть получены и переданы заказчику десять препаратов очищенных рекомбинантных частиц бактериофага лямбда, составляющих панель «ДНК защищенных» положительных контрольных образцов фрагментов инфекционных заболеваний человека. Каждый препарат должен быть представлен в виде 10 мл стабилизированной суспензии фаговых частиц с концентрацией ДНК не менее 1011 «бляшко-образующих» частиц в мл.
Должны быть получены и переданы заказчику двадцать пять препаратов очищенных рекомбинантных псевдовирусных частиц бактериофага MS2, составляющих панель «РНК защищенных» положительных контрольных образцов фрагментов инфекционных заболеваний человека. Каждый препарат должен быть представлен в виде 1,5 мл стабилизированной очищенной в градиенте солей цезия суспензии псевдовирусных частиц с концентрацией РНК не менее 1011 частиц в мл.
По результатам работы должен быть предоставлен отчет, включающий перечисленные выше методики очистки ферментов и антигенов и описание созданной панели контрольных образцов.
Календарный план выполнения работ
№
|
Наименование работ
|
Отчетная документация
|
Сроки выполнения
|
1.
|
Сборка и клонирование генов полимераз, антигенов, фрагментов положительных контрольных образцов в плазмидные вектора и бактериофаги.
Дизайн структур олигонуклеотидных праймеров для сборки генов полимераз, аналогов природных антигенов, фрагментов положительных контрольных образцов. Сборка генов полимераз аналогов природных антигенов и клонирование их в плазмидные вектора и бактериофаги. Подтверждение структуры генов с помощью секвенирования.
Подбор условий очистки и оценки функциональной активности рекомбинантных полимераз и антигенов. Очистка положительных контрольных образцов на основе плазмидных векторов и бактериофагов.
Подбор и оптимизация условий очитки рекомбинантных ферментов и антигенов с использованием аффинной хроматографии, и/или с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, и/или хроматографии на ионообменных смолах. Оценка функциональной активности ферментов с помощью нерадиоактивных методов. Оценка возможности использования рекомбинантных антигенов для иммунодиагностики с использованием иммуночипов.
Наработка и очистка плазмид, бактериофагов и псевдочастиц положительных контрольных образцов, штаммов продуцентов и передача заказчику. Оформление и передача протоколов очистки препаратов заказчику.
|
Итоговый отчёт.
Акты передачи препаратов заказчику
|
До 15 июня 2017 года
|
|
