ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов для количественного определения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке или плазме крови человека УФ-кинетическим методом
«ЛДГ - UTS»
Набор ЛДГ-UTS разрешен к производству, продаже и применению на территории РФ.
Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/09379
Информация для заказа набора «ЛДГ-UTS»
Кат. №
|
Комплектация
|
Количество определений
|
ЛДГ-029-100
|
Р1 80 мл + Р2 20 мл
|
100/v
|
ЛДГ-029-400
|
Р1 320 мл + Р2 80 мл
|
400/v
|
где v – объем фотометрической ячейки анализатора.
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов «ЛДГ-UTS» предназначен для определения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови человека кинетическим методом, рекомендованным Немецким обществом Клинической Химии (DGKC) в клинико-диагностических и биохимических лабораториях для целей диагностики заболеваний и контроля проводимого лечения пациентов.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
2.1. Принцип метода
2.1. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует восстановление пирувата молекулой НАДН в щелочной среде по следующей схеме реакции:
 
2.2. Фотометрическое измерение основано на наличии максимума поглощения света на длине волны 340 нм молекулами НАДН. Все остальные компоненты реакционной смеси не поглощают свет на этой длине волны. Таким образом, cкорость уменьшения концентрации НАДН измеряется фотометрически при 340 нм и прямо пропорциональна активности ЛДГ в образце 1].
2.2. Клиническая диагностика
2.2.1 ЛДГ – цитоплазматический фермент, присутствующий в разных изоформах во всех тканях человека. Активность общей ЛДГ измеряют при диагностике и лечении заболеваний сердца (в первую очередь инфаркта миокарда), печени, крови или мышц. Определение соотношения уровней активности ЛДГ и других ферментов, а также отдельных изоферментов ЛДГ, служит для дифференциации заболеваний. На этом основано клиническое значение анализа [1,2,3].
2.2.2. Клинический диагноз не может быть поставлен по результатам одного анализа, он должен объединять как клинические, так и лабораторные данные.
3. СОСТАВ НАБОРА
3.1. Поскольку рабочий реагент, содержащий все компоненты для обеспечения химической реакций, не стабилен, набор реагентов поставляется в виде двух растворов Р1 и Р2.
Компоненты и их состав:
Наименование
|
Состав
|
Концентрация
|
Реагент 1 (Р1)
Буферный раствор
|
Трис буфер рН 7,5
Пируват
Хлорид натрия
|
100 ммоль/л
2,75 ммоль/л
222 ммоль/л
|
Реагент 2 (Р2)
Субстратный раствор
|
НАДН
|
1,55 ммоль/л
|
4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
4.1. Набор обеспечивает линейную область определения активности лактатдегидрогеназы от 5 Е/л до 1500 Е/л, отклонение от линейности не превышает 5%.
4.2. Чувствительность – не более 5 Е/л.
4.3. Воспроизводимость: коэффициент вариации результатов определений – не более 5%.
4.4. Качество набора можно оценивать по отечественным или зарубежным контрольным сывороткам, аттестованным по значению активности ЛДГ методом DGKC.
4.5. Для калибровки автоматизированных фотометрических систем рекомендуется использовать сывороточные калибраторы, аттестованные по значению активности ЛДГ методом DGKC.
4.6. Нормальные величины активности лактатдегидрогеназы в сыворотке или плазме взрослого человека составляют 240-480 Е/л.
4.7. Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон значений нормальных величин для обследуемого контингента людей.
4.8. Перечень лекарственных препаратов, влияющих на определение активности ЛДГ, приведены в обзоре [4].
5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
5.1. Потенциальный риск применения набора – класс 1 (ГОСТ Р 51609-2000). Основной риск косвенный и связан с возможностью получения неверного результата анализа, что может привести к неправильно поставленному диагнозу и назначению неэффективного лечения пациента. Для снижения указанного риска необходимо в каждой аналитической серии контролировать качество результатов анализов с применением контрольных сывороток в соответствии с ОСТ 91500.13.0001-2003.
5.2. При выполнении лабораторного исследования необходимо соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).
5.3. При работе с биологическими пробами следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирусы гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.
6. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ
- Спектрофотометр, программируемый фотометр или анализатор, длина волны 340 нм, термостатируемая при 370 (±0,5 0С) кювета с длиной оптического пути 10 мм*
- Термостат или водяная баня, обеспечивающие температуру +370 (±0,5 0С)
- Секундомер
- Пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 20, 40 и 1000 мкл
- Цилиндры мерные объемом 25 и 100 мл
- Колба коническая вместимостью не менее 150 мл
- 0,9% раствор NaCl (физиологический раствор)
- Вода дистиллированная или деионизированная.
- Перчатки резиновые или пластиковые.
7. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
7.1. Негемолизированная сыворотка или плазма крови 1].
Не использовать оксалат в качестве антикоагулянта, так как он ингибирует ЛДГ.
7.2. Сыворотку или плазму крови следует отделить от форменных элементов крови не позднее, чем через 1 час после забора крови.
7.3. Образцы сыворотки и плазмы крови стабильны при температуре +2-8 0С не более 2 дней, или 1 месяца при –20 0С.
8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
8.1. Приготовление рабочего реагента. Смешать в колбе конической 4 объема Реагента 1 и 1 объем Реагента 2, отмеренные мерными цилиндрами. Раствор рабочего реагента стабилен 2 месяца при температуре 2-8 0С. Защищать от воздействия света.
8.2. Раствор рабочего реагента прогреть до 37 0С.
8.3. Оптическая плотность рабочего реагента при 340 нм должна составлять 1,22,0 ед. опт. плотн. (Б), (при использовании кювет с длиной оптического пути 10 мм).
8.5. Проведение реакции.
Отобрать компоненты реакционной смеси с использованием пипеточных дозаторов в объемах, указанных в таблице:
Наименование
|
Объем, мкл
|
|
|
37 0С
|
Рабочий реагент
|
1000
|
Сыворотка или плазма крови
|
20
|
8.5. Измерить оптическую плотность анализируемого образца (Dо) при выбранной температуре, при длине волны 340 нм против дистиллированной воды или воздуха.
8.6. Повторить измерения оптической плотности пробы 3 раза с интервалом 0,5-1 минута (D1, D2 и D3).
8.7. Рассчитать среднее изменение оптической плотности пробы в минуту (ΔD):
ΔD = [(D0 –D1)+ (D1 –D2)+ (D2 –D3)]/(3*t),
где t – интервал времени (мин).
8.8. Активность лактатдегидрогеназы в сыворотке или плазме крови А (Е/л) определить по формуле:
А = FΔD
где F – фактор пересчета для выражения активности лактатдегидрогеназы в Е/л, равный:
при 37 0С – 7107.
8.9. Если вычисленное значение ΔD превышает величину 0,35 ед. опт. плотн./мин, развести исследуемый образец физиологическим раствором в 10 раз, повторить анализ, а результат определения умножить на 10.
8.10. Для проведения анализа на полуавтоматическом анализаторе должен быть выбран кинетический режим измерений по фактору и установлены следующие значения параметров методики:
Параметр
|
Значение
|
Имя теста
|
ЛДГ
|
Основной светофильтр
|
340
|
Дополнительный светофильтр
|
600
|
Фактор, F0
|
7107 (37 оС)*
|
Время лаг-фазы
|
1 мин.
|
Время измерения
|
3 мин.
|
Единицы измерения
|
Е/л (МЕ/л)
|
Линейность, МЕ/л
|
5,0 - 1500
|
При использовании биохимических анализаторов с другим фотометрическим объемом количество рабочего реагента и анализируемых образцов в зависимости от объема используемой кюветы может быть пропорционально изменено (соотношение сыворотки или плазмы крови к рабочему реагенту составляет 1 : 50 при 37 0С).
При использовании кювет с длиной оптического пути, отличной от 10 мм, требуется перерасчет фактора набора. При использовании биохимического анализатора с ненормированной длиной оптического пути требуется калибровка по сывороточным калибраторам, аттестованным по значению активности ЛДГ методом DGKC.
8.11. Пробы смешать, поместить в фотометрическую ячейку анализатора.
8.12. Результат анализа - активность ЛДГ рассчитывается автоматически при введении в память полуавтоматического биохимического анализатора фактора, указанного в таблице.
8.13. Если результат определения активности ЛДГ превышает 1500 МЕ/л, то следует разбавить пробу ЛДГ (0,9% NaCl) в 10 раз и повторно провести измерение, а полученный результат умножить на 10.
Для выполнения измерений на автоматическом биохимическом анализаторах следует:
Установить программу определения активности ЛДГ согласно таблице:
-
Наименование параметра
|
Значение
|
Метод измерения
|
кинетический
|
Длина волны, нм
|
340
|
Измерение против
|
Воздух или дист. вода
|
Температура реакции
|
37 ОС
|
Единица измерения
|
Е/l, (МЕ/л)
|
Число знаков после запятой
|
0
|
Изменение оптической плотности
|
Уменьшается
|
Фактор*
|
Зависит от длины оптического пути
|
Соотношение рабочего реагента/проба
|
25:1
|
Количество измерений, не менее
|
3
|
Время лаг-фазы, мин
|
1
|
Время реакции, мин
|
1-3
|
Верхний предел абсорбции реагента против воды, Б
|
2,0
|
Нижний предел абсорбции реагента против воды, Б
|
1,7
|
Максимальная скорость изменения абсорбции, Б мин
|
0,15
|
Границы линейности, МЕ/л
|
5-1500
|
Минимум нормы, МЕ/л
|
240**
|
Максимум нормы, МЕ/л
|
480**
|
* - Перед первым использованием набора а также при получении новой серии необходимо определить значение фактора по мультикалибратору, аттестованному по активности ЛДГ методом DGKC (1970, 37 oC). Полученное значение ввести в память анализатора.
** - Нормальные величины активности ЛДГ у мужчин.
8.14. Если результат измерения активности ЛДГ выше 1500 МЕ/л, следует разбавить пробу физраствором (0,9% NaCl) в 10 раз, повторно провести измерение, полученный результат умножить на 10.
9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
9.1. Набор реагентов «ЛДГ-UTS» должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2-8 ОС в течение всего срока годности. Допускается хранение набора до 25 ОС не более 10 суток. Замораживание компонентов набора не допускается.
9.2. Срок годности набора указан на этикетке набора.
9.3. Реагенты 1 и 2 после вскрытия флаконов могут храниться при температуре 2–8 0С в плотно закрытых флаконах в темном месте в течение всего срока годности набора.
9.4. Рабочий реагент можно хранить в плотно закрытом флаконе при температуре 2–8 0С не более 2 месяцев в защищенном от света месте.
9.5. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
Список литературы
1. Pesce A. Lactate degidrogenase. Kaplan A et al. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis. Toronto. Princeton 1984; 1124-117, 438.
2. Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999.
3. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed AACC 1995.
4. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001.
Производится ООО «Эйлитон» по заказу ЗАО «А/О Юнимед».
По вопросам, касающимся качества набора «ЛДГ–UTS» следует обращаться в ЗАО «А/О ЮНИМЕД» по адресу: 129301, Москва, ул. Касаткина, 3а; Тел. (495) 734-91-31, 8-800-333-91-31,
Факс: (495) 564-86-41;
E-mail: office@unimedao.ru; http://www.unimedao.ru
|
