Разработка идентификации bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов
|
Скачать 338.81 Kb.
|
|
На правах рукописи Мастиленко Андрей Владимирович РАЗРАБОТКА ИДЕНТИФИКАЦИИ BORDETELLA BRONCHISEPTICA НА ОСНОВЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич кандидат ветеринарных наук, доцент Васильева Юлия Борисовна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна доктор биологических наук Заднова Светлана Петровна Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», г. Москва. Защита диссертации состоится «16» июня 2011 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова». Автореферат диссертации разослан «12» мая 2011 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы. В настоящее время бордетеллез является широко распространенным заболеванием животных во многих странах мира (Baker, 2003). Однако в Российской Федерации до настоящего времени исследования в этой области не проводились. Bordetella bronchiseptica является возбудителем хронических и, довольно часто, асимптоматических инфекций респираторного тракта (трахеобронхита) животных. Возбудитель поражает животных всех возрастных групп, но наиболее тяжелые последствия развиваются у молодых особей. Тяжесть заболевания связана с присутствием у B. bronchiseptica факторов патогенности: адгезинов (филаментозного гемагглютинина, пертактина и фимбрий) и токсинов (дермонекротического, аденилатциклазы-гемолизина и липополисахарида) (Woolfrey et al., 1991; Gueirard et al., 1995). Инфекционный агент долго сохраняется в окружающей среде, поэтому чаще всего его обнаруживают в местах скученности животных (питомники, фермы, частные хозяйства) (Bemis, 1977). Возможность трансмиссии возбудителя из природных эпизоотических очагов к животным, содержащимся в фермерских хозяйствах, и, как следствие, значительных экономических потерь в малом и среднем сельскохозяйственном бизнесе вследствие гибели или снижения продуктивности животных, обусловливают необходимость выявления B. bronchiseptica и проведение противоэпидемических мероприятий. В связи с этим актуальным является разработка методов индикации и идентификации B. bronchiseptica. Цель работы - разработка методических приемов индикации и идентификации B. bronchiseptica, основанных на иммунохимических и молекулярно-генетических методах. Задачи работы:
Научная новизна. Впервые в Российской Федерации проведен сравнительный анализ антигенного состава B. bronchiseptica с гипериммунными сыворотками в реакциях радиальной иммунодиффузии по O. Ouchterlony (1948), встречного электрофореза по G. Bedarida et al. (1969) и иммуноэлектрофореза по P. Grabar и C. Williams, описанному Х. Фримель (1979). Показана высокая чувствительность метода иммуноэлектрофореза для изучения антигенной структуры B. bronchiseptica при использовании иммунной сыворотки с низким титром. На примере использования разработанных систем праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ доказана высокая специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции при идентификации B. bronchiseptica. Подобраны и оптимизированы соотношения систем праймеров для одновременного выявления 3 специфичных участков генома B. bronchiseptica в мультиплексном формате ПЦР. Предложена схема проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для количественной оценки содержания ДНК B. bronchiseptica в биоматериале. Практическая значимость работы. Метод иммуноэлектрофореза при проведении антигенной идентификации B. bronchiseptica позволяет использовать его для контроля состава и специфичности антигенов при разработке и производстве биопрепаратов, а подобранные и оптимизированные системы праймеров – в производстве ПЦР-систем, основанных на амплификации специфических участков генома B. bronchiseptica для диагностики бордетеллеза. Разработаны «Методические рекомендации по выявлению Bordetella bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции», утвержденные ректором УГСХА от 10 ноября 2010 г. и подтвержденные актом комиссионных испытаний, проведенных на базе ООО «Медицинский Центр «Академия» (г. Ульяновск). Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии и биотехнологии, а также при проведении практических занятий для студентов и аспирантов в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Основные положения, выносимые на защиту:
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы и в Научно-исследовательском центре микробиологии и биотехнологии ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия». Апробация работы Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008; 2009), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» (Москва, 2010). Публикации По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 144 страницах, содержит 15 таблиц и 28 рисунков. Список использованных литературных источников включает 207 наименований, в том числе 190 зарубежный. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект, материалы и методы исследований Штаммы: в работе были использованы 5 референс-штаммов B. bronchiseptica из коллекции музея Научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (№ 1, 7, 214, 22067, 8344) и штамм B. parapertussis (№ 119), которые в соответствии с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этих видов морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами. Также были использованы 37 штаммов B. bronchiseptica, выделенные из клинических образцов биоматериала от собак и кошек в ветеринарных клиниках Ульяновской области. Для определения специфичности иммунохимических методов и ПЦР использовали 13 бактериальных культур: P. aeruginosa, P. putida, A. hydrophila, E. coli, Y. enterocolytica, Y. pseudotuberculosis, O. rhinotracheale, S. pyogenes, S. epidermidis, L. acidophilus, S. aureus, B. subtilis из музея Научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами. Питательные среды и реактивы: для проведения иммунохимических исследований были использованы: агароза «Biotechnology Grade AM-0710-0,1» (Helicon, г. Москва), буфер трис-борат для электрофореза (ДНК-Технология, г. Москва), краситель Amido Black 10B (Diffco), 10% лимонная кислота, стандартный раствор альбумина с молекулярной массой 65 кДа (Serva Feinbiochemica, Германия). Для проведения иммунизации кроликов был использован полный адъювант Фрейнда. При выполнении этапа выделения бактериальной ДНК были использованы наборы: «Проба-ГС» (сорбентная методика очистки ДНК), «Проба-НК» (фенольно-хлороформная преципитирующая методика выдеделения ДНК), «Проба-Рапид» (термический лизис с использованием бычьего альбумина для удаления ионов) (НПФ «ДНК-Технология», г. Москва), «ДНК-экспресс» (термический лизис с использованием бычьего альбумина для удаления ионов), «Выделение ДНК из биопроб» (сорбентная методика очистки ДНК) (НПФ «Литех», г. Москва), «Пробоподготовка универсальная» (сорбентаная методика) (ООО «ИзоГен», г. Москва), «ДНК-сорб-А-М – вариант 100» (сорбентная методика) («ИнтеЛабСервис», г. Москва). Для проведения амплификации были использованы наборы «GenPak@ PCR Core» (ТУ 9398-001-73867468-2005, ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва), «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ с Taq-ДНК-полимеразой в присутствии красителя SYBR Green I» (ООО «Синтол», г. Москва). Для проведения электрофоретической детекции продуктов амплификации ПЦР были использованы готовые 2,3% агарозные гели с навеской трис-боратной буферной смеси (НПФ «ДНК-Технология», г. Москва), минеральное масло для ПЦР. Праймеры были синтезированы в НПФ «Литех» и ООО «Синтол» (г. Москва). Методы: в работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения, идентификации и индикации бактерий (Васильев и др., 2004; Лабинская, 2004) и соответствующие им среды и реагенты. Основные биохимические свойства штаммов B. bronchiseptica исследовали с использованием тест–системы, разработанной в НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург. Режимы инкубирования посевов составляли 24-72 часа при 37ºС. Исследования с использованием бактериальных штаммов проводили согласно ГОСТ Р 51446-99, ГОСТ Р 51426-99, ГОСТ Р 26670-9. Морфологические свойства определяли при помощи световой микроскопии окрашенных по Граму мазков, которые готовили из 24-72 часовых бульонных и агаровых культур B. bronchiseptica. Иммунологические методы исследования включали в себя гипериммунизацию лабораторных животных для получения иммунных сывороток. Иммунохимические методы включали: получение антигенов B. bronchiseptica с помощью ультразвукового дезинтегратора и их электрофорез, который проводили по методике, описанной Л.А. Остерманом с модификацией применяемого буфера; встречный электрофорез по схеме, описанной G. Bedarida et al. (1969), реакцию иммуноэлектрофореза по методу P. Grabar и C. Williams, описанному Х. Фримель (1979). Иммунодиффузию для выявления особенностей антигенов посредством реакции преципитации в геле проводили по методу O. Ouchterlony (1948). Молекулярно-генетические методы исследования включали в себя выделение нуклеиновых кислот (ДНК) из культур, проведение полимеразной цепной реакции с системами праймеров детекцию с помощью горизонтального электрофореза и в режиме «реального времени» (Real Time PCR) с интеркалирующим красителем SYBR Green I. Статистические методы включали расчет чувствительности и специфичности ПЦР в сравнении с микробиологическим методом по методу А. Петри и К. Сэбин (2002). Расчеты произведены с помощь программного обеспечения Microsoft Exell 2002 (10.2701.2625). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительный анализ иммунохимических методов для изучения антигенного состава Bordetella bronchiseptica При решении одной из задач данной работы были получены комплексные антигены разрушенных с помощью ультразвука бактериальных клеток. Затем была проведена иммунизация кроликов и получена гипериммунная сыворотка. После этого был проведен сравнительный анализ иммунохимических методов для изучения антигенного состава B. bronchiseptica. Получение антигенов Bordetella bronchiseptica Антигены B. bronchiseptica изолировали экстракцией микробных клеток в стерильном 0,9 % NaCl с последующей ультразвуковой дезинтеграцией. При их получении были использованы различные режимы дезинтеграции. Оптимальным оказался режим: частота 23 кГц, амплитуда колебаний 5 микрон, в течение 1 минуты на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом. Контроль полного разрушения бактериальных клеток при выборе режима дезинтеграции был проведен с помощью окрашенных по Граму препаратов дезинтеграта, а наличие антигенов контролировалось электрофоретическим разделением белков в агарозном геле. В качестве контроля при электрофорезе был использован стандартный раствор сывороточного альбумина с молекулярной массой 65 кДа. Электрофорез антигенов B. bronchiseptica после ультразвуковой дезинтеграции проводили в 2,0 % агарозном геле в трис-боратном буфере (рН-8,3) с режимом 25 В/см в течение 30 минут. После электрофореза гель окрашивали красителем 1% Amido Black 10B в течение 60 минут. После этого пластину геля помещали в промывающий раствор, содержащий 10 % лимонную кислоту на 24 часа для просветления фона. Затем гель документировали и анализировали количество полученных полос антигена (рис. 1). В результате экспериментов был подобран оптимальный режим дезинтеграции бактериальных клеток, позволяющий полностью разрушить бактериальные клетки и максимально сохранить антигены B. bronchiseptica. При этом режиме дезинтеграции (частота 23 кГц, амплитуда колебаний 5 микрон, в течение 1 минуты на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом) при электрофорезе в 2 % агарозном геле и использовании трис-боратного буфера было определено 7 антигенов. Также был определен диапазон расположения антигенов в агарозном геле с соответствующим режимом электрофореза, что необходимо для проведения реакции иммуноэлектрофореза.   - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 |
Похожие:
 |
Техническое задание Разработка компонент молекулярно диагностических... Разработка компонент молекулярно диагностических систем для выявления клинически значимых маркеров генетических, онкологических и... |
|
Роль молекулярно-генетических и гормонально-метаболических факторов... Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «тюменский государственный медицинский... |
|
Исследование алгоритмов идентификации для систем бездатчикового векторного... Разработка и исследование алгоритмов идентификации и векторного управления в асинхронном электроприводе |
|
О внесении изменений в документацию об открытом аукционе в электронной... А/эф на поставку оборудования, комплектующих и материалов для проведения молекулярно-генетических исследований для нужд фгаоу во... |
 |
Разработка и исследование алгоритмов идентификации и векторного управления... |
|
5 Решение задачи на ЭВМ 59 Для этого был произведен обзор и анализ различных методов выбора критериев, а также методов оценки. На основе проанализорованной... |
|
Соискателя на степень магистра филологии Крастынь Валерии Валерьевны... Целью данного исследования является разработка системы для извлечения именованных сущностей из текстов микроблогов (Твиттер) на русском... |
|
Система идентификации транспортных объектов Система автоматической идентификации (сито) служит для автоматической электронной идентификации транспортных объектов (ТО), автомобильного... |
|
Разработка и проектирование оптимальных по различным критериям систем... 2 Способы записи информации на радиочастотные метки и способы её обработки 12 |
|
Разработка методов обеспечения безопасности использования информационных... |
|
Разработка и применение лекарственных средств на основе ароксиалканкарбоновой... Разработка и применение лекарственных средств на основе ароксиалканкарбоновой кислоты |
|
Разработка и внедрение методов повышения качества ортопедического... |
|
Пояснительная записка дипломного проекта: Разработка устройства идентификации... Учреждение образования Гомельский государственный дорожно-строительный колледж имени Ленинского комсомола Белоруссии |
|
Цкп «Генетический полиморфизм» обн ран Разработка тест-систем для определения пола и идентификации особей амурских тигров по любому биологическому материалу методом пцр... |
|
Выпускной квалификационной работы бакалавра Разработка стенда для исследования угроз информационной безопасности и методов защиты в сети ноц сибгути |
|
Выпускная квалификационная работа: на тему: «Разработка концепции... «Разработка концепции кадровой политики предприятия на основе анализа системы управления» |