3. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны
Ход работы. В три пробирки наливают по 1 мл слюны, разведенной в 40 раз. В первую пробирку добавляют 2 капли воды, во вторую — 2 капли 1 % раствора NaCl, в третью — 2 капли 1 % раствора CuSO4. После этого во все пробирки добавляют по 5 капель 1 % раствора крахмала и оставляют их при комнатной температуре на 2 мин. Затем во все пробирки добавляют по 1 капле раствора Люголя, перемешивают, наблюдают окраску и определяют, в какой пробирке действует активатор или ингибитор.
Результаты опыта запишите в таблицу:
Номер пробирки
|
1 (H2O)
|
2 (NaCl)
|
3 (CuSO4)
|
Реакция с реактивом Люголя
|
|
|
|
Работа 2. Специфичность ферментов
В отличие от неорганических катализаторов, ферменты обладают специфичностью (абсолютной, относительной, стереоспецифичностью). Это свойство определяется уникальным строением активного центра каждого фермента. Определите тип специфичности амилазы слюны по следующей методике.
Ход работы. Для исследования специфичности амилазы берут слюну, разведенную в 5 раз, и наливают в 2 пробирки по 1 мл.
В 1-ю пробирку добавляют 1 мл 1 % раствора крахмала, во 2-ю — 1 мл 1 % раствора сахарозы. Обе пробирки помещают на 10 мин в термостат при 38°С, после чего проводят реакцию Фелинга для обнаружения глюкозы.
Реакция Фелинга: к 15 каплям исследуемого раствора прибавить равный объем реактива Фелинга и довести до кипения верхний слой жидкости. При положительной реакции на глюкозу наблюдается красное окрашивание, которое дает закись меди. Результаты опытов запишите в таблицу:
№
пробирки
|
Фермент
|
Субстрат
|
Реакция Фелинга
|
1
|
|
|
|
2
|
|
|
|
Выводы:
Подпись преподавателя:
Тема 6. Регуляция действия ферментов.
Количественное определение активности ферментов
Актуальность темы
Знание механизмов, посредством которых клетки и целые организмы координируют и регулируют весь набор метаболических процессов, важно при исследованиях в разных областях биомедицинских наук. Из всех факторов, от которых зависит определение активности фермента — концентрация фермента и субстрата, температура, рН и присутствие регуляторов, — наибольший клинический интерес представляют два последних.
Активаторы и ингибиторы влияют на активность фермента, способствуя формированию или блокированию его активного центра. Они могут взаимодействовать с аллостерическим центром и, тем самым, менять ферментативную активность. Нередко ингибиторы — продукты промежуточных или конечных реакций какого-либо биохимического процесса. Некоторые природные или синтетические вещества оказывают избирательное ингибирующее действие на ферменты и используются в качестве лекарственных веществ. В больших дозах подобные вещества могут оказаться ядами.
Большинство лекарственных препаратов оказывает свое действие, влияя на соответствующие ферментативные реакции. Многие такие препараты сходны с природными субстратами и потому могут действовать как конкурентные ингибиторы ферментов. Чтобы понять многие процессы, которые существенны для фармакологии и токсикологии, необходимо иметь четкое представление о механизмах ингибирования ферментов.
Цель занятия
Уметь использовать знания о механизмах регуляции активности ферментов в последующем изучении клинических дисциплин для усвоения принципов диагностики заболеваний и контроля лечения, а также для понимания механизмов действия лекарственных препаратов, регулирующих активность ферментов.
Требования к исходному уровню знаний
Для полного усвоения темы необходимо повторить из:
основные положения теории катализа;
примеры различных типов химических реакций;
конформационные превращения белков.
Для проверки исходного уровня знаний выполните следующие задания:
Задание 1. Известно, что скорость взаимодействия веществ А и В увеличилась в три раза после добавления вещества К. В качестве конечных продуктов обнаруживается вещество АВК. Является ли вещ Задание 2. При интенсивной мышечной работе в скелетной мускулатуре накапливается молочная кислота, образующаяся в реакции:
С Н3-С-СООН ↔ СН3-СН-СООН.
О ОН
К какому типу относится приведенная реакция?
А. Окислительно-восстановительная реакция. Б. Реакция гидролиза.
В. Реакция синтеза. Г. Реакция электролиза.
Задание 3. Вещества А и В взаимодействует по схеме А + В « АВ. При заданной концентрации А и В через 30 мин устанавливается подвижное равновесие, т. е. скорость прямой и обратной реакции уравнивается. Какую из приведенных характеристик реакции изменит внесение катализатора?
А. Скорость прямой реакции. Б. Константу равновесия.
В. Скорость обратной реакции. Г. Время наступления равновесия.
Д. Концентрацию продуктов реакции.
Правильность решений проверьте, сопоставив их с эталонами ответов.
Вопросы для обсуждения
Механизм ферментативного катализа. Теория промежуточных фермент-субстрат-ных комплексов, типы связей.
Представление об активном центре фермента, его организация. Теории, объясняющие работу активного центра (Э. Фишер, Д. Кошленд).
Особенности строения аллостерических ферментов, аллостерический центр.
Механизмы регуляции скорости ферментативных процессов: регуляция количества ферментов (синтез, распад), активности ферментов, изменение количества субстрата, наличие изоферментов, объединение ферментов в полиферментные комплексы, компартментация процессов.
Ключевые ферменты, характеристика.
Регуляция активности ферментов: ковалентная модификация, активаторы и ингибиторы (примеры). Виды ингибирования (необратимое и обратимое, изостерическое и аллостерическое), характеристика, примеры.
Множественные формы ферментов (изоферменты и собственно множественные формы), примеры, биологическая роль.
Медицинские аспекты энзимологии.
ЛИТЕРАТУРА
Основная
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – С. 99–108, 115–126, 129–132.
Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Высшая школа, 1989.– С. 79–92.
Конспект лекций.
Дополнительная
Ленинджер А. Основы биохимии. – М.: Мир, 1985.– С. 226–241.
Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – М.: Мир, 1993.
Задания для самостоятельной работы
Задание 1. Иметь представление о механизмах ферментативного катализа. Обратить внимание на то, что:
а) в активный центр входят радикалы аминокислот различных участков полипептидного остова;
б) активный центр составляет относительно небольшую часть объема фермента;
в) активный центр располагается в углублении фермента.
1.1. Ферментативный гидролиз жиров протекает в сто раз быстрее неферментативного процесса за счет образования промежуточного фермент-субстратного комплекса. Какие связи стабилизируют этот комплекс?
А. Ионные. Б. Водородные. В. Пептидные.
Г. N-гликозидные. Д. Сложноэфирные.
1.2. Методом ИК-спектроскопии изучали природу связей между субстратом и связывающим участком активного центра фермента. В чем заключается взаимодействие фермента и субстрата по Д. Кошленду?
А. Изменяется только конфигурация активного центра фермента.
Б. В молекуле фермента изменяется конфигурация аллостерического центра под действием субстрата.
В. При образовании фермент-субстратного комплекса в ферменте и субстрате одинаково изменяется напряжение химических связей.
Г. Активный центр подходит к субстрату, как ключ к замку.
Задание 2. Уметь дать характеристику основным типам ингибиторов. Усвоить, что действие ферментов можно полностью или частично подавить (ингибировать) определенными химическими веществами (ингибиторами).
2.1. При исследовании влияния салицилатов на активность фермента глутаматдегидрогеназы установлено, что с увеличением концентрации субстрата (глутамата) от 1,5 до 8 ммоль степень ингибирования не изменяется. Удалив ингибитор, активность фермента можно восстановить. Определите тип ингибирования.
А. Необратимое. Б. Обратимое конкурентное.
В. Обратимое неконкурентное. Г. Ингибирование по принципу «обратной связи».
2.2. Для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяются сульфаниламидные препараты, блокирующие синтез фактора роста бактерий. Выбрать механизм действия сульфаниламидных препаратов:
А. Являются ферментами.
Б. Участвуют в окислительно-восстановительных процессах.
В. Являются аллостерическими ингибиторами.
Г. Конкурируют с п-аминобензойной кислотой за место связывания с активным центром фермента, синтезирующего фолиевую кислоту.
Д. Ингибируют всасывание фолиевой кислоты.
Задание 3. Усвоить основные способы регуляции каталитической активности ферментов и понятие «множественные формы ферментов».
3.1. В клинику доставили пациента с приступом бронхиальной астмы. У больного, вследствие дыхательного ацидоза (рН крови 7,2) снижена активность ферментов плазмы. Укажите основную причину инактивации ферментов плазмы крови:
А. Изменение степени ионизации молекул ферментов.
Б. Необратимая денатурация. В. Разрыв пептидных связей.
Г. Изменение концентрации ферментов. Д. Репрессия синтеза ферментов.
3.2. При обследовании больного установлено повышение в крови активности изоферментов креатинкиназы ММ1 и ММ3. Укажите их общие свойства:
А. Термолабильность.
Б. Чувствительность к различным ингибиторам.
В. Электрофоретическая подвижность.
Г. Молекулярная масса. Д. Катализ одной и той же реакции.
3.3. К какому классу относится этот фермент?
А. Оксидоредуктазы. Б. Трансферазы. В. Лиазы.
Г. Гидролазы. Д. Изомеразы. Е. Лигазы.
Правильность решений проверьте, сопоставив их с эталонами ответов.
Проверьте ваши знания (самоконтроль усвоения темы)
Задание 1. Больной С., 42 года, после приема внутрь 20 мл метанола в тяжелом состоянии доставлен в клинику, где ему ввели внутривенно этиловый спирт в количестве, которое у здорового человека вызывает интоксикацию. Объясните, почему такое лечение оказывается эффективным, учитывая, что высокая токсичность метанола обусловлена действием продукта его метаболизма формальдегида, образующегося в печени под действием алькогольдегидрогеназы.
А. Этанол — конкурирующий субстрат для алькогольдегидрогеназы.
Б. Этанол вызывает денатурацию фермента.
В. Вследствие изменения рН среды.
Г. Происходит частичный протеолиз молекулы фермента.
Д. Этанол связывает формальдегид.
Задание 2. При лечении опухолей мочеполовой системы в клинике применяется препарат метотрексат, обратимый конкурентный ингибитор дигидрофолатредуктазы, катализирующей синтез тетрагидрофолиевой кислоты. На взаимодействии с каким компонентом основан механизм действия этого препарата?
А. Апоферментом. Б. Активным центром фермента.
В. Аллостерическим центром фермента. Г. Простетической группой. Д. Субстратом.
Задание 3. Кроме Н+ и углекислого газа, связывание кислорода гемоглобином регулируется 2,3-бисфосфоглицератом, который присоединяется к белку в участках, пространственно удаленных от гема. Как называется такой вид регуляции?
А. Регуляция по принципу обратной связи.
Б. Частичный протеолиз молекулы фермента.
В. Присоединение или отщепление белка-регулятора.
Г. Присоединение или отщепление низкомолекулярного эффектора (модулятора).
Д. Фосфорилирование молекулы.
Задание 4. В клетках Е. соli синтез пиримидиновых нуклеотидов осуществляется по схеме метаболического пути: СО2 + NН3 + 2АТФ→ Р1→ Р2→ УТФ→ ЦТФ. При увеличении в клетке концентрации ЦТФ синтез пиримидиновых нуклеотидов прекращается. Какой вид регуляции описан?
А. Аллостерическая регуляция.
Б. Частичный протеолиз.
В. Фосфорилирование молекулы фермента.
Г. Присоединение белков ингибиторов.
Д. Отщепление белков ингибиторов.
Задание 5. В инкубационную среду, содержащую субстраты — аланин, аспартат и креатин, внесли ферменты: аланинаминотрансферазу, аспартатаминотрансферазу и креатинкиназу. Какие общие признаки характерны для этих ферментов?
А. Ферменты катализируют одну и ту же реакцию.
Б. Ферменты катализируют один тип реакций.
В. Являются изоферментными формами.
Г. Осуществляют передачу нервных импульсов.
Д. Обладают групповой специфичностью.
Эталоны ответов к решению заданий
Для самопроверки и самоконтроля исходного уровня знаний:
1 нет. 2 А. 3 Г.
Для самостоятельной работы:
1.1 Б. 1.2 Г. 2.1 В. 2.2 Г. 3.1 А. 3.2 А, Д. 3.3 Б.
|
