ТЕМА 7.
Свойства молекул ДНК.
Указания к изучению темы.
В клетках высших эукариот (например, животных или растений) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органоидах (митохондриях и пластидах). В клетках бактерий и архей кольцевые или линейные молекулы ДНК прикреплены изнутри к клеточной мембране. У них и у низших эукариот встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами. Одно- или двухцепочечные молекулы ДНК могут образовывать геном ДНК-содержащих вирусов.
С химической точки зрения ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счёт дезоксирибозы и фосфатной группы. В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула спирализована. Такую структуру молекулы ДНК принято называть «двойной спиралью».
В ДНК встречаются четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей взаимодействуют с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями по принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином, гуанин — только с цитозином. Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК: матричных (мРНК), рибосомальных (рРНК) и транспортных (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на матрице ДНК за счёт транслирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков. Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции
Каждое основание на одной из цепей связывается с одним определённым основанием на второй цепи. Такое специфическое связывание называется комплементарным. Пурины комплементарны пиримидинам (то есть, способны к образованию водородных связей с ними): аденин образует связи только с тимином, а цитозин — только с гуанином. В двойной спирали цепочки также связаны с помощью гидрофобных взаимодействий, которые не зависят от последовательности оснований ДНК.
Комплементарность двойной спирали означает, что информация, содержащаяся в одной цепи, содержится и в другой цепи. Обратимость и специфичность взаимодействий между комплементарными парами оснований важна для репликации ДНК и всех остальных функций ДНК в живых организмах.
Так как водородные связи нековалентны, они могут обратимо разрываться и восстанавливаться. Цепочки двойной спирали могут расходиться как замок-молния под действием ферментов или при высокой температуре. Разные пары оснований образуют разное количество водородных связей. АТ связаны двумя, ГЦ — тремя водородными связями, поэтому на разрыв ГЦ требуется больше энергии. Процент ГЦ пар и длина молекулы ДНК определяют количество энергии, необходимой для диссоциации цепей: длинные молекулы ДНК с большим содержанием ГЦ более тугоплавки.
В процессе выделения ДНК происходят нарушения ее целостности. Длинные молекулы ДНК рвутся на более мелкие. Часть молекул ДНК теряет двухспиральную структуру. Происходит накопление олигонуклеотидов и мононуклеотидов.
Спектры поглощения нуклеотидов расположены в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. У всех нуклеотидов кроме цитидина максимумы поглощения наблюдаются около 260, у цитидина около 270 нм. Коэффициенты молярной экстинкции нуклеотидов зависят от длины волны, свойств растворителя и природы нуклеотида. Так при 259,5 нм при pH 7 аденин имеет коэффициент молярной экстинкции (εмакс) равный 13400 М–1.см–1.
Спектр поглощения ДНК обусловлен наложением спектров ее мономеров (нуклеотидов). Максимум поглощения ДНК в водных растворах при физиологических значениях рН наблюдается при 260 нм (λмакс). Однако поглощение ДНК при 260 нм существенно меньше, чем суммарное поглощение ее мономеров. При распаде нативной ДНК до мононуклеотидов происходит увеличение поглощения – гиперхромный эффект (гиперхромизм).
Гиперхромным эффектом ДНК называется значительное увеличение оптической плотности раствора эквимолярной смеси свободных нуклеотидов или денатурированной ДНК по сравнению с оптической плотностью раствора нативной ДНК. На основании оценки гиперхромизма возможно определение степени денатурации и ренатурации ДНК. Гиперхромизм в применении к спектру полимера предполагает, что удвоенная мощность осциллятора перехода в мономере больше, чем полная мощность осциллятора соответствующего перехода в димере.
Нуклеотиды, входящие в состав двухцепочечной молекулы ДНК, поглощают ультрафиолет в той же области, что и свободные нуклеотиды, однако интенсивность поглощения двухцепочечной молекулы ДНК меньше, чем в случае эквивалентного количества свободных нуклеотидов. Это обусловлено взаимодействием пар оснований в структуре двойной спирали.
Интенсивность поглощения около 260 нм в спектре ДНК резко изменяется при нагревании выше некоторой критической температуры, величина которой зависит от свойств исследуемой ДНК. При достижении этой критической температуры поглощение возрастает приблизительно на 40 % в температурном интервале, составляющем всего лишь несколько градусов.
Это можно объяснить тем, что в денатурированном состоянии ароматические кольца могут свободно вращаться, в связи с чем взаимная ориентация дипольных моментов переходов соседних групп исчезает.
В меньшей степени уменьшение оптического поглощения по сравнению с мономерными компонентами характерно для всех полинуклеотидов и олигонуклеотидов, для которых не характерны необратимые изменения при обычных условиях денатурации. При увеличении длины цепи олигонуклеотида гиперхромизм быстро достигает предельного значения у цепочки в 5-6 остатков. Это было показано и при изучении синтетических олигонуклеотидов. Гипохромизм важен не только сам по себе, как чрезвычайно интересное оптическое явление.Этот феномен, дает нам в руки простой и удобный метод, который можно использовать в химии нуклеиновых кислот для качественной и количественной оценки процессов денатурации, ренатурации, обратимого образования гомополимерных комплексов или образования гибридных спиралей ДНК – РНК. Он также применяется для установления генетической связи между ДНК из различных организмов или из различных клеток одного и того же организма. Все, что требуется для проведения такой оценки - это спектрофотометр или какой-нибудь другой прибор, с помощью которого можно измерять поглощение света в области 260 нм.
Гиперхромизм является признаком денатурации (переход от двухспиральной структуры ДНК к односпиральной). Поэтому изучение гиперхромного эффекта является критерием качества препаратов ДНК.
Качественное изучение свойств ДНК возможно лишь при использовании высокоочищенных образцов. Препарат ДНК считается чистым, если отношение 260 нм/280 нм составляет 1,8–2,0 и отношение 260 нм/230 нм составляет 1,8 – 2,2. Меньшие значения этих отношений характерны для загрязненных образцов ДНК. Поглощение при 320 нм характерно при наличии в растворе частичек пыли.
Вопросы для самоконтроля.
Как устроен геномный аппарат в клетках высших эукариот?
Как устроен геномный аппарат в клетках прокариот?
Что представляет собой ДНК с химической точки зрения?
Что понимается под комплементарностью двойной спирали ДНК?
Какие физические и химические процессы могут происходить в процессе выделения ДНК?
Чем отличаются от исходного образца ДНК денатурированная и ренатурированная ДНК?
Какие процессы влияют на спектры поглощения ДНК?
Как нативность ДНК связана со спектрами ее поглощения?
В чем состоит гиперхромнный эффект ДНК?
Какие задачи можно решать используя абсорбционную спектроскопию ДНК?
Каким образом с помощью абсорбционной спектроскопии можно решать задачи установления генетической связи между ДНК из различных организмов?
Литература к теме 7:
Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007.
Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика : учеб. пособие / И. Ф. Жимулев. – Новосибирск, 2005.
Коничев, А. С. Молекулярная биология: учеб. / А. С. Коничев,Г. А. Севастьянова. – М. : Академия, 2005.
Ченцов, Ю. С.Введение в клеточную биологию : учеб. для вузов / Ю. С. Ченцов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М. : Академкнига, 2005.
Кларк, Д. Молекулярная биология / Д. Кларк, Л. Рассел. – М., 2004.
Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – 4-е издание, перераб. и доп. - М: изд-во "Агар", 1999.
Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
Dahm R (2005). «Friedrich Miescher and the discovery of DNA». Dev Biol 278 (2).
Thanbichler M, Wang S, Shapiro L (2005). «The bacterial nucleoid: a highly organized and dynamic structure». J Cell Biochem 96 (3).
ТЕМА 8.
Полимеразная цепная реакция.
Указания к изучению темы.
ДНК – молекула, в которой закодирована наследственная информация любого организма в виде последовательности генов. Эта информация регулирует жизнедеятельность клеток, из которых состоят все организмы. Структура и работа самих клеток определяется различными видами белков, в том числе и ферментами. Информация гена записана в виде последовательности из четырех типов нуклеотидов Это аденин (A), гуанин (Г) (относящиеся к пуринам) и тимин (T), цитозин (Ц) (относящиеся к пиримидинам).
Молекула ДНК обычно состоит из двух нитей, которые обвивают друг друга в виде спирали. Это знаменитая двойная спираль, за открытие которой Уотсон и Крик в 1962 году получили Нобелевскую премию. При делении клетки происходит удвоение ДНК – репликация, во время которой обе нити ДНК расходятся. Каждая из них становится матрицей, на которой фермент ДНК-полимераза по принципу комплементарности достраивает вторую нить нуклеиновой кислоты, двигаясь от 5'-конца нити ДНК к ее 3'-концу, где цифры 5 и 3 обозначают положение атомов углерода в нуклеотиде.
Однако ДНК-полимераза не способна инициировать процесс репликации, она лишь добавляет нуклеотиды к уже имеющемуся небольшому двунитевому участку - праймеру (затравке). Синтез праймеров обеспечивается другим ферментом – праймазой, после чего ДНК-полимераза начинает перемещаться вдоль матрицы, добавляя и соединяя нуклеотиды. Сворачивание двунитевой молекулы ДНК в спираль происходит автоматически.
ДНК, несущая в себе оригинальную копию генетической информации, считается неприкосновенной и не используется как непосредственный источник инструкций для управления клеткой и построения необходимых ей белков. Рабочие копии генов состоят из другой нуклеиновой кислоты – РНК (рибонуклеиновой кислоты). Это РНК-посредник, или мРНК. РНК отличается от ДНК тем, что несет в себе сахар рибозу, а тимин (T) заменяется родственным ему урацилом (У). К тому же, РНК обычно однонитевая. И по этой информации, передающейся от ДНК через мРНК, специальный аппарат клетки – рибосома - строит белки.
В современном мире развитие науки напрямую связано с развитием методов исследования. В 1983 годов американский ученый Кэри Мюллис изобрел полимеразную цепную реакцию, получив впоследствии за это Нобелевскую премию.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод ферментативного получения большого количества копий (ампликонов) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити). При этом происходит копирование только необходимого участка ДНК, так как только он соответствует заданным условиям. И только в том случае, если этот фрагмент присутствует в исследуемом образце.
Для протекания этой реакции необходимы три основных компонента. Во-первых, служащая матрицей молекула ДНК, содержащая исследуемый фрагмент. Во-вторых, ДНК-полимераза и нуклеотиды, используемые ДНК-полимеразой для синтеза ДНК. В-третьих, два праймера ПЦР – два коротких сегмента однонитевой нуклеиновой кислоты, комплементарных началу и концу исследуемого фрагмента ДНК (обычно длиной 15-20 оснований). Присоединяясь к этому фрагменту, праймеры инициируют запуск синтеза ДНК. ДНК-полимераза начинает добавлять последующие звенья.
Праймеры в настоящее время можно синтезировать с помощью автоматизированного аппарата, задав программу требуемой последовательности нуклеотидов.
Реально метод ПЦР осуществляет естественную репликацию ДНК, только в пробирке, повторяющуюся много раз и столько, сколько это необходимо для исследования. Метод включает следующие этапы. Сначала происходит расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующая комплементарная достройка обеих с помощью специального фермента (полимеразы). Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных "стартовых блоках" - коротких двунитевых участках. Для проведения такого процесса используют две генетические маркеры - праймеры, которые служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры - это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (10-30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить. Сначала двунитевую ДНК нагревают до температуры чуть ниже 1000 С. ДНК денатурирует и комплементарные нити ДНК расходятся. Далее к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяются праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые - "стартовые блоки". Праймеры присоединяются в направлении с 3 , - конца цепочки ДНК, по одному на каждую цепь, поэтому достраивание новой цепи ДНК в последующих циклах происходит в ограниченном праймерами участке ДНК.
Следующая стадия заключается в наращивании новой цепочки ДНК посредством присоединения имеющихся в реакционной смеси дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. Процесс наращивания начинается от праймеров и осуществляется при помощи фермента - ДНК-полимеразы при температуре около 72 С (специфические бактериальные ферменты - полимеразы, устойчивые к высоким температурам). Полимераза осуществляет синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей после нового прогрева. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть полимеразная цепная реакция (ПЦР). Процедура ПЦР включает несколько высокотемпературных этапов, поэтому и используются термостабильные ДНК-полимеразы. В ходе реакции последовательно меняют температуру: при температуре 90-95 градусов происходит разделение цепей ДНК, при температуре 40-60 градусов - присоединение праймера (отжиг), при температуре 72 градуса - синтез цепей ДНК. Термостабильные полимеразы выделяются из термостойких бактерий, живущих в горячих источниках при температурах до 90°С. Чаще всего это Taq-полимераза бактерий Thermus aquanticus, Tth-полимераза (Thermus thermophilus), Pwo-полимераза (Pyrococcus woesei). В настоящее время при проведении ПЦР часто используются смеси полимераз с различными свойствами, включая искусственно полученные модификации природных ферментов.
Так как процесс ПЦР требует постоянной смены циклов с несколькими разными температурами, современные аппараты для ПЦР – амплификаторы - работают в режиме быстрого изменения температуры реакционной смеси по заданной программе и способны амплифицировать фрагмент ДНК длиной от 100 до 3000 пар оснований в течение нескольких часов, начиная с микрограмма ДНК. Однако амплификаторы могут начать процесс и с миллионной доли микрограмма. Помимо простого увеличения числа копий ДНК ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом: введение мутаций, изменение оснований, сращивание фрагментов.
|
