Методы биохимических исследований
|
Скачать 0.55 Mb.
|
|
Министерство образования и науки Российской Федерации Сибирский федеральный университет МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Методические указания к самостоятельной работе Красноярск СФУ 2012 УДК 577.1 ББК 28.072 М 545 Составитель О.А.Гусейнов М 545 Методы биохимических исследований: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост О.А Гусейнов. – Красноярск: Сибирский федеральный университет, 2012. – 48 с. В пособии представлены методические указания для самостоятельной работы студентов по следующим темам биохимических исследований: основные принципы исследований в биохимии, гель-фильтрация, разделение белков, общие принципы хроматографии, электрофорез, выделение и спектрометрический анализ ДНК, рестриктный анализ ДНК и полимеразная цепная реакция. Предназначено для студентов специальности 020208.65 – «Биохимия». Предложенные методические указания могут быть использованы преподавателями высшей школы при обучении студентов методам биохимических исследований. УДК 577.1 ББК 28.072 © Сибирский федеральный университет, 2012 ВВЕДЕНИЕ В курсе «Методы биохимических исследований» изучаются теоретические и практические основы биохимических методов исследований с фокусом на последние достижения науки, современные методы исследования, использование современного лабораторного оборудования. Курс предназначен для студентов четвертого курса очной формы обучения направления 020200 – биология. Главная цель дисциплины – ознакомление с важнейшими принципами и методическими приемами экспериментальной биохимии. Предлагаемые методические указания для самостоятельной работы будут содействовать глубокому усвоению студентами учебного материала, формированию теоретических основ для проведения экспериментальных работ. Особое внимание обращается на проблему выделения изучаемых соединений из живых организмов в индивидуальном виде. Самостоятельная работа студентов по курсу «Методы биохимических исследований» включает изучение теоретического материала: работу с научной, учебной, методической и справочной литературой, изучение лекционного материала; подготовку презентаций и написание реферата. В методических указаниях приведены вопросы для самостоятельной проработки теоретического материала и темы для написания реферата. Приводится список литературы, необходимой для самостоятельной подготовки. Самостоятельная работа способствует развитию у студента таких навыков, как выбор и решение поставленной задачи, сбор и аналитическое изучение опубликованных результатов, умение выделить главное и сделать обоснованное заключение. Самостоятельная работа способствует развитию у студентов навыков творческого исследования, литературного редактирования. В результате изучения дисциплины «Методы биохимических исследований» обучающиеся должны знать:
уметь:
владеть:
Систематическое усвоение программы практикума и лекционного курса обеспечивает фундаментальную теоретическую и практическую подготовку студентов, позволяющую им впоследствии самостоятельно работать в биохимических лабораториях самого различного профиля. ПЕРЕЧЕНЬ ИЗУЧАЕМЫХ ТЕМ:
ГРАФИК Самостоятельной работы студентов по дисциплине «Методы биохимических исследований» образовательной программы направления 020208.65 Биология Института фундаментальной биологии и биотехнологии 4 курса на 7 семестр
Условные обозначения: ВЗ – выдача темы для самостоятельного изучения; ЗП – защита презентации; РФ – реферат; ВРФ – выдача темы реферата; ЗРФ – защита реферата. ТЕМА 1. Основные принципы исследований в биохимии. Указания к изучению темы. В основе биохимических методов исследования лежит выделение индивидуальных веществ из биологических источников, фракционирование, анализ, изучение структуры и свойств отдельных компонентов живого вещества. Методы биохимии преимущественно формировались в 20 веке; наиболее известными являются хроматография, изобретённая М.С. Цветом в 1906 г., центрифугирование (Т. Сведберг, 1923 г.), электрофорез (А. Тизелиус, 1937 г.), полимеразная цепная реакция (К. Муллис, 1983 г.). За изобретение последних трех методов их авторы получили Нобелевские премии. С конца 20 века в биохимии всё шире применяются методы молекулярной и клеточной биологии, в особенности искусственная экспрессия и исследование генов в модельных клетках и целых организмах. Определение структуры всей геномной ДНК человека выявило приблизительно столько же ранее неизвестных генов и их неизученных продуктов, сколько уже было известно к началу 21 века благодаря полувековым усилиям всего человечества. Оказалось, что традиционный химический анализ и очистка ферментов из биомассы позволяют получить лишь те белки, которые в живом веществе присутствуют в сравнительно большом количестве. Не случайно основная масса ферментов была открыта биохимиками в середине 20 века и к концу столетия распространилось убеждение, что все ферменты уже открыты. Данные геномики опровергли эти представления, но дальнейшее развитие биохимии требовало изменения методологии. Искусственая экспрессия ранее неизвестных генов предоставила биохимикам новый материал для исследования, часто недоступный традиционными методами. В результате возник новый подход к планированию биохимических исследований, который получил название обратная генетика. Эта методология предоставляет биохимикам шанс изучать функции продуктов уже известных генов, в то время как ранее наука шла по пути определения структуры генов, кодирующих уже известные ферменты. Необходимо выделить следующие проблемы выделения в индивидуальном виде структурных элементов из живых организмов: 1) Исходный материал (биомасса) состоит из сотен и даже тысяч разных соединений. Разделение такой смеси довольно сложно, мало того, многие индивидуальные компоненты смеси построены довольно однотипно. В связи с этим они мало различаются между собой по физико-химическим характеристикам, например по способ-ности к сорбции на определенном типе сорбента или растворимости, подвижности в электромагнитном поле и так далее. 2) Работа с биологическими объектами зачастую сопровождается необходимостью манипулировать с очень небольшими количествами первоначального вещества. При ничтожно малом количестве исходного материала методы детекции должны быть крайне чувствительными. Такими методами и являются спектрофотометрические методы, основанные на измерении по-глощения видимого или УФ света, люминесцентные, основанные на изменении флуоресценции, био- и хемилюминесценции, радиохимические методы, основанные на изменении радиоактивности изучаемых объектов. 3) Многие клеточные соединения обладают очень низкой устойчивостью вне клетки. Часто задача состоит в том, чтобы выделить соединение в нативном, т.е. сохраняющим биологическую активность, состоянии. Между тем многие компоненты клеток при умеренных температурах и незначительных изменениях рН среды подвержены явлению денатурации, которая приводит к потере биологической активности. Кроме того, в клетках имеются ферменты способные разрушить те или иные вещества, в первую очередь нуклеиновые кислоты и белки. 4). При изучении активности многих ферментов, в процессе их работы, они могут необратимо денатурировать. Учитывая существующие проблемы при выделении и исследовании клеточных компонентов и разработаны соответствующие щадящие биохимические методы выделения отдельных компонентов. Например, при выделении лабильных (легко денатурируемых) белков, необходимо использовать низкие температуры, буферы, не влияющие на нативность данного белка и специальные добавки-стабилизаторы. Литература к теме 1:
Вопросы для самоконтроля. 1. Перечислите проблемы выделения в индивидуальном виде компонентов из живых организмов. 2. Что понимают под нативностью белков и нуклеиновых кислот? 3. Физико-химические свойства белков: молекулярная масса, заряд белковых молекул, оптические свойства, растворимость, денатурация. 4. Каковы основные принципы выделения и очистки белков? 5. Физико-химические свойства нуклеиновых кислот: молекулярная масса, заряд молекул, оптические свойства, растворимость, денатурация. 6. Каковы основные принципы выделения и очистки нуклеиновых кислот? ТЕМА 2. Разделение макромолекул методом гель-фильтрации. Указания к изучению темы. Метод гель-фильтрации занимает особое положение в обширной семье методов колоночной хроматографии. В нем используется весь набор хроматографической аппаратуры, но принципиальное отличие от всех остальных членов этого семейства состоит в том, что разделяемые при гель-фильтрации молекулы не сорбируются внутри гранул и вообще ни физически, ни химически не взаимодействуют с их материалом. Весь процесс фракционирования основывается только на соотношении размеров молекул фильтруемой смеси и пор в гранулах. Термин «гранулы» расшифровывается, как малые частицы сферической формы, изготовленные из пористого материала. Подадим сверху на эту колонку,заполненную гранулами, ток раствора, в котором сосуществуют молекулы разного размера. Он будет свободно протекать между гранулами — вниз к выходу из колонки. Если крупные молекулы настолько велики, что совершенно не проникают в пределы гранул (поры для них слишком малы), то эти молекулы вместе с током раствора без задержки будут двигаться к выходу из колонки. Пусть мелкие молекулы настолько малы, что все ячейки внутри гранул будут для них легкодоступны. Тогда (если скорость протекания раствора не слишком велика) эти малые молекулы в результате диффузии быстро займут весь объем жидкости во внутренних ячейках гранул. Конечно, диффузия будет идти и в обратном направлении так, что концентрация малых молекул в гранулах и в свободной жидкости между ними поначалу окажется одинаковой. Однако вскоре малые молекулы, которые окажутся вне гранул, током раствора продвинутся немного вниз по колонке. Здесь они встретят слой еще «пустых» гранул и будут диффундировать внутрь них. В то же самое время в слое, откуда эти молекулы ушли, нарушится равновесие диффузии и малые молекулы из гранул станут преимущественно выходить наружу, в раствор (элюент). Процессы эти будут происходить в течение всего хода элюции. За это время каждая из мелких молекул успеет (и не один раз) побывать в каких-нибудь гранулах и выйти из них. Для слоя мелких молекул в целом это будет означать большую потерю времени с точки зрения продвижения этого слоя вниз к выходу из колонки. В результате слой мелких молекул сильно отстанет от слоя крупных молекул. Для молекул среднего размера некоторые ячейки близ поверхности гранул окажутся доступными. Они туда будут «заходить». Но диффундировать глубоко внутрь гранул им, как правило, не удастся, они быстрее будут выходить наружу и равновесие диффузии будет в пользу свободной жидкости между гранулами. Поэтому молекулы среднего размера в целом, как слой, будут двигаться вниз по колонке быстрее, чем мелкие молекулы, но все же значительно медленнее, чем крупные. Колоночная гель-фильтрация широко применяется для решения двух основных задач: 1. Быстрого освобождения крупных молекул от находящихся в том же растворе солей или низкомолекулярных предшественников синтеза: 2. Фракционирования (разделения) смеси макромолекул не очень значительно различающихся по своим размерам. Например, различных белков. Здесь следует использовать длинные (1-1,5 м) колонки, диаметром не более 1 см. Следует загружать их объемом исходного препарата, составляющем не более 1-2% от объема колонки. Если смесь содержит 2-3 компонента, то их нередко удается разделить полностью — они выходят в виде довольно широких, но не перекрывающихся друг с другом пиков. Литература к теме 2:
Вопросы для самоконтроля.
10.Объясните, что называется гель-фильтрационными диаграммами элюирования веществ? 11.Как определить молекулярную массу молекул методом гель-фильтрации? 12.Каковы основные принципы выбора типа геля, размеров колонки, условий элюирования? 13.Какова разрешающая способность метода гель фильтрации? |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 |
Тема современные методы системных исследований Основные направления социологических исследований. Методы, используемые в рамках социологических исследований. Методологическая стратегия... |
 |
Документация об открытом аукционе в электронной форме на поставку... На поставку реагентов для иммунохимических (иха) и биохимических исследований на анализаторах Cobas, и для гематологических исследований... |
|
Программа дисциплины «Методы научных исследований в менеджменте» Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления подготовки/ специальности... |
|
Правила сбора мочи для биохимических гормональных исследований С-пептид, метанефрины и норметанефрины, адреналин, норадреналин, дофамин, серотонин, гистамин и др |
|
Методические рекомендации по изучению дисциплины «Методы исследований... Целью освоения дисциплины «Методы исследования в социальной работе» является формирование целостной системы знаний об основных общенаучных... |
|
Отдел биохимических, микологических, химико-токсикологических исследований... Пнд ф 14. 1 98-97 Методика выполнения измерений жесткости в пробах природных и очищенных сточных вод титриметрическим методом |
|
Рефератов по дисциплине «психологический практикум» Методы быстрой, не требующей специальных исследований диагностики существенных индивидуальных |
|
Методы исследования в биологии (10 класс) Цель: создать условия для осмысления информации об основных методах биологических исследований |
|
Рабочая программа для студентов направления подготовки 44. 03. 01 Педагогическое образование Содержание: умк по дисциплине Методология и методы психолого-педагогических исследований |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Методы маркетинговых исследований» ... |
|
Программа дисциплины «Методы научных исследований в менеджменте» Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления 38. 03. 02 «Менеджмент»... |
|
Вопросы "А" Связь физиологии с другими науками. Методы физиологических исследований и история их развития (наблюдение, исследование биоэлектрических... |
|
Методы исследования в природе с учащимися Для этих целей используются как традиционные средства полевых исследований (бинокль, видеокамеры), так и сложное лабораторное оборудование... |
|
Область аккредитации испытательной лаборатории (центра) производственно-аналитической... Правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора проб |
|
Институт ядерных исследований учёный совет Институт ядерных исследований Российской академии наук образован в 1970 году для создания экспериментальной базы и проведения фундаментальных... |
|
Законодательством Российской Федерации Государственного университета – Высшей школы экономики (далее по тексту – гу-вшэ), работающего по должности аналитика Лаборатории... |