ТЕМА 5.
Основы электрофореза.
Указания к изучению темы.
Электрофорез — это перемещение частиц дисперсной фазы в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Впервые был открыт профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.
Электрофорез является одним из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии. Этот метод находит широчайшее применение для разделения смесей биомолекул на фракции или индивидуальные вещества. Он используется в биохимии, молекулярной биологии, клинической диагностике, популяционной биологии.
В биохимии и молекулярной биологии электрофорез используется для разделения макромолекул — белков и нуклеиновых кислот, а также их фрагментов. Различают множество разновидностей этого метода.
Электрофорез белков — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка и определения его молекулярной массы. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли.
Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются в различных областях:
электрофорез в свободных средах;
электрофорез с подвижной границей;
зональный электрофорез без поддерживающей среды;
капиллярный электрофорез;
зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой;
электрофорез на фильтровальной бумаге;
электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране;
электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды;
электрофорез белков в ПААГ;
электрофроез белков в крахмальном геле;
электрофорез белков в агарозном геле.
Методы электрофореза белков подразделяются на одномерный и двумерный электрофорез, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков и электрофорез в присутствии детергента. Разновидностью метода электрофореза являются изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез. В случае использования иммунологических методов для выявления разделённых белков говорят про иммуноэлектрофорез.
В начале 70-х годов было показано, что с помощью гель-электрофореза можно определить длину и чистоту молекул ДНК, а также разделить и выделить нужные фрагменты. Этот метод прост, так как каждый нуклеотид в молекуле нуклеиновой кислоты обладает отрицательным зарядом, который под действием приложенного электрического поля заставляет молекулы двигаться к положительному электроду. Чтобы разделить молекулы ДНК, исходя из их размера, электрофорез проводят в гелях. Были разработаны специальные гели, с помощью которых удается разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающиеся всего лишь на несколько нуклеотидов.
Поскольку поры в полиакриламидном геле для больших молекул ДНК слишком малы, то для разделения молекул ДНК по размеру были разработаны специальные гели на основе агарозы (полисахарида, выделяемого из морских водорослей). Оба эти метода разделения ДНК (в полиакриламидном геле и агарозном геле) широко используются для аналитических и препаративных целей.
В 80-х годах была предложена модификация гель-электрофореза в агарозном геле, названная электрофорезом в пульсирующем электрическом поле или пульс-электрофорез. С ее помощью удается разделять очень большие молекулы ДНК. Обычный гель-электрофорез не позволяет разделить молекулы размером более 20000 пар оснований ввиду постоянства электрического поля, которое придает молекулам змеевидную конфигурацию. Обладающие такой конфигурацией молекулы движутся в гелях с постоянной скоростью вне зависимости от длины молекул. Если же направление электрического поля будет часто меняться, скорость движения молекул будет определяться их способностью переориентировываться согласно этому изменению. Такой процесс у больших молекул занимает значительно больше времени, вследствие чего они заметно будут отставать. Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК. Он же используется для приготовления агарозного геля.
Электрофорез в агарозном геле – стандартный метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техники можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте плотности.
Кроме того, при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, так как полосы ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим в ДНК красителем – бромистым этидием в низкой концентрации. Просматривая прокрашенный гель в ультрафиолетовом свете, можно заметить даже 1 нг ДНК.
Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяется следующими пятью главными параметрами: размером молекул ДНК, конформацией ДНК, концентрацией агарозы, напряженностью электрического поля, используемым буфером.
Литература к теме 5:
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007.
Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007.
Сова В.В.,Кусайкин М.И. Методическое пособие к практическим занятиям по очистке белков. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2006.
Биохимия: Учеб. для вузов / Под ред. Е.С. Северина, Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2003.
Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М. Мир, 1982.
Elliott. – Oxford : University Press, 2002.
Michaux S., Pallisson J., Garles-Nurit M.-J, Bourg G., Allerdet-Servent A., Ramuz M. Presence of two independent chromosome in the Brucella melitensis 16 M genome // J. Bacteriol. 1993. V. 175. ‹ 3. P. 701–705.
Вопросы для самоконтроля.
Что понимают под электрофорезом биологических молекул?
В каких разделах биологических исследований применяется электрофрорез?
Для каких целей в биологии используется электрофорез?
Какие физические и химические механизмы лежат в основе электрофореза?
Назовите используемые разновидности электрофореза биологических макромолекул.
Для каких целей используют электрофорез белковых молекул?
Охарактеризуйте методику электрофореза белков в полиакриламидном геле по Лэммли.
Перечислите и охарактеризуйте разновидности и модификации методики электрофореза белков в полиакриламидном геле по Лэммли.
Для каких целей используют электрофорез нуклеиновых кислот?
В каких случаях используют электрофорез ДНК в полиакриламидном геле, а в каких случаях в агарозном геле?
Охарактеризуйте метод электрофореза в пульсирующем электрическом поле.
Опишите алгоритм проведения гель-электрофореза ДНК.
Какими способами можно определить положение различных фрагментов ДНК в гелях после проведения электрофореза?
Какими параметрами определяется скорость миграции ДНК в геле при электрофорезе?
ТЕМА 6.
Выделение и очистка ДНК.
Указания к изучению темы.
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) – одна из важнейших для живых существ молекула, в которой содержится вся генетическая информация о них. Живое существо – это сложная система, а ДНК – это архив, в котором хранятся инструкции по созданию этой системы и ее функционированию. Молекулы ДНК есть в каждой клетке любого организма. Чтобы понять особенности функционирования клеток различных организмов, проводят исследование их ДНК, первым шагом которого является ее выделение и очистка. Впервые ДНК была выделена Ф. Мишером в1869 году.
Большая часть нуклеиновых кислот в клетках находится в соединении с белками. Поэтому, кроме разрушения клеточных оболочек гомогенизацией биологического материала, необходимо отделить нуклеиновые кислоты от белков. Этого можно достичь обработкой образца крепким раствором соли, например 10%-ным раствором NaCl. После удаления нерастворимой фазы нуклеиновые кислоты можно осадить из охлажденного до 00 С раствора этанолом или раствором трихлоруксусной кислоты. Осадок нуклеиновых кислот отделяют центрифугированием, тщательно промывают и высушивают.
Часто применяют фенольный метод выделения нуклеиновых кислот, с помощью которого можно получить нативные препараты. Для этого гомогенизированный охлажденный биологический материал заливают водонасыщенным раствором фенола. Полученную смесь перемешивают и центрифугируют. При этом содержимое центрифужной пробирки разделяется на четыре четко отличающихся друг от друга разных по консистенции и цвету слоя. В верхнем водном слое и подстилающем его вязком слое белого цвета находится основная масса нуклеиновых кислот. В третьем желеобразном прозрачном, желтоватом слое находится фенол с растворенными в нем белками. Четвертый, самый нижний, слой коричневого цвета содержит остатки ткани, денатурированные белки и мизерную примесь нуклеиновых кислот. Процесс выделения нуклеиновых кислот данным методом называют также фенольной депротеинизацией.
Освободить препараты, содержащие нуклеиновые кислоты от белка возможно и путем обработки их солевого экстракта двойным объемом смеси хлороформ-изоамиловый спирт. Далее смесь центрифугируют, отделяют верхнюю водную фазу, содержащую нуклеиновые кислоты. Их осаждают двойным объемом охлажденного этилового спирта.
Полученные суммарные препараты нуклеиновых кислот можно разделить на фракции, используя такие методы как хроматография, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, распределение в двухфазных системах, ультрацентрифугирование и электрофорез.
Высокоэффективным методом разделения нуклеиновых кислот, является ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия. В этом случае высокая ионная сила буферного раствора в центрифужных пробирках способствует разрушению комплексов белков и нуклеиновых кислот, разделение макромолекул происходит на основании их различий в плавучей плотности. Перемещение макромолекул во время центрифугирования происходит до тех пор, пока они не достигнут зоны раствора CsCl с плотностью, равной их плавучей плотности. В этой зоне происходит их концентрирование. Метод центрифугирования в градиенте плотности CsCI в присутствии бромистого этидия используется в генной инженерии для получения плазмид в препаративных количествах. Он позволяет отделять суперскрученные молекулы ДНК от кольцевых и линейных, так как их плавучие плотности заметно различаются из-за разного количества молекул бромистого этидия, интеркалированного в эти топологические изомеры плазмидной ДНК. В целях обычного применения рекомбинантных ДНК, в том числе для молекулярного клонирования, построения рестрикционных карт и секвенирования, разработаны методы минипрепаративного выделения. В одном из них суперскрученные молекулы рекомбинантных плазмидных ДНК легко отделяются от линейных молекул хромосомной и плазмидной ДНК в процессе щелочной денатурации с последующей быстрой нейтрализацией раствора. При этом в основном успевают ренатурировать только суперскрученные молекулы ДНК, так как две их цепи остаются физически связанными друг с другом в процессе денатурации. Образовавшийся комплекс денатурированной ДНК и белков отделяется от плазмидной ДНК центрифугированием.
ДНК освобождаются от основной массы РНК переосаждением смеси нуклеиновых кислот в присутствии высокой концентрации LiCl. Также для освобождения препаратов ДНК от примесей РНК часто применяют высокоочищенные препараты РНКаз без примесей ДНКаз. После обработки смеси нуклеиновых кислот РНКазой, белковый компонент смеси удаляется с использованием смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1). После последующего центрифугирования ДНК из отобранного верхнего водного слоя можно выделить осаждением охлажденным этанолом или изопропанолом.
Вопросы для самоконтроля.
Охарактеризуйте роль ДНК в клетках живых организмов.
В каком виде находится большая часть нуклеиновых кислот в клетках?
Как разъединить нуклеиновые кислоты и белки в гомогенатах биологического материала?
Охарактеризуйте фенольный метод выделения ДНК.
Опишите хлороформ-изоамиловый метод выделения ДНК.
Перечислите способы фракционирования смеси нуклеиновых кислот.
Что называется фенольной депротеинизацией?
Опишите метод разделения нуклеиновых кислот ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия.
Перечислите методы минипрепаративного выделения и охарактеризуйте их.
Какие приемы применяются для освобождения препаратов ДНК от примесей РНК?
Для каких целей используют электрофорез ДНК?
Литература к теме 6:
Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007.
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007.
Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия : краткий курс с упражнениями и задачами. 3-е изд., Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2005.
Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика : учеб. пособие / И. Ф. Жимулев. – Новосибирск, 2005.
Коничев, А. С. Молекулярная биология: учеб. / А. С. Коничев,Г. А. Севастьянова. – М. : Академия, 2005.
Ченцов, Ю. С.Введение в клеточную биологию : учеб. для вузов / Ю. С. Ченцов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М. : Академкнига, 2005.
Кларк, Д. Молекулярная биология / Д. Кларк, Л. Рассел. – М., 2004.
Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – 4-е издание, перераб. и доп. - М: изд-во "Агар", 1999.
Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
|
