Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов - страница 8

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов


НазваниеУчебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов
страница8/19
ТипУчебное пособие
rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Учебное пособие
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   ...   19
Индикаторный диагноз. Как отмечалось, основным доказательством поражения растений вирусами, фитоплазмами или вироидами следует считать выявление их инфекционности. Это можно сделать несколькими способами, например, с помощью различного рода прививок на донорские растения, при использовании повилики, переносчиков (насекомых, клещей или нематод), а для механически передающихся возбудителей также биологическим титрованием. Во всех указанных случаях перенос инфекции от анализируемого растения осуществляется на индикаторные растения - их восприимчивые виды и сорта.

Передача прививкой. Метод может применяться для всех известных возбудителей (вирусы, фитоплазмы и вироиды). Однако подбор индикаторных растений для каждого из них различен. На подвои, в качестве которых используют восприимчивые к конкретным возбудителям формы растений, прививают части органов (черешки листьев, почки, побеги, кусочки тканей и др.) с анализируемых образцов. По признакам, развивающимся на индикаторах (или их отсутствию) делают заключение о состоянии растений. В зависимости от вида растения, его возраста и размера, сроков анализа применяют различные способы прививок. К наиболее распространенным способам прививки относятся окулировка почкой, копулировка (зеленым или одревесневшим черенком, верхушкой побега, черешком листа, кусочком коры) и сближение (аблактировка) стеблей. Выбор их зависит от сроков проведения диагноза, состояния и вида привоя и подвоя.

Окулировка применяется в период после окончания роста побегов, в конце июля-начале августа. В сроки, когда кора плохо отслаивается, но ростовые процессы продолжаются, хорошие результаты дает прививка щитком. Прививка кусочком коры наиболее простой метод, который можно использовать в течение всей вегетации. Поэтому он особенно ценен при диагностических работах в условиях закрытого грунта. Широко распространен способ прививки врасщеп (копулировка зеленым или одревесневшим черенком), применяемый в период активного роста растений. Прививку черешком листа можно проводить в любое время вегетации до опадения листьев.

От способа и срока индикаторных прививок зависит длительность инкубационного периода, а следовательно, и оперативность диагностики. Резко сокращаются сроки анализа, если прививки делаются в начале вегетации. Известен ряд специальных приемов, провоцирующих и ускоряющих проявление признаков на индикаторах, например, обрезка побегов у акцепторного растения (на 2-3 почки выше прививки), использование черенков (или почек), хранившихся не менее двух месяцев при температуре 4-5о С, т.е. прошедших стадию физиологического покоя.

С помощью индикаторов значительно ускоряется (до 8 месяцев вместо 3 лет) диагноз заболеваний, признаки которых проявляются на плодах. В частности, для этого используют черенки с плодовыми почками.

По реакции на индикаторах дается заключение о состоянии проверяемых образцов. К разновидности данного метода можно отнести использование повилик - паразитических растений в качестве “биологических мостиков” между индикатором и проверяемым растением.

С помощью этого метода можно выявлять скрытые формы инфекции в анализируемых растениях, в том числе поражения фитоплазмами, которые не передаются механическим путем.

Биологическое титрование. В основе теста лежит способность некоторых вирусов и вироидов передаваться от растения к растению механически с соком. Анализ, продолжительность которого составляет от 3 до 15 дней, лучше всего проводить весной в начале вегетации. Для этого с растений берут одну весовую часть тканей (молодые листья, почки без кроющих чешуй, лепестки, соскобы камбия с побегов и др.) и гомогенезируют с раствором, содержащим стабилизирующие соединения. Их выбор, состав и концентрация зависят от конкретного возбудителя. Полученным инокулюмом с помощью кусочка поролона, марлевым тампоном, шпателем или щеткой натирают листья травянистых индикаторов, специфично реагирующих на инфицирование, предварительно опыленных порошком карборунда. В качестве индикаторов используются травянистые растения, чувствительные к определенным возбудителям. Метод позволяет выявлять скрытые инфекции, но только механически передающихся патогенов. Его целесообразно применять до начала вегетации, используя оранжереи. Продолжительность анализа около 2-3 недель (см. рис. 5).

Реакция на травянистых индикаторах, рекомендуемых для диагностики, не всегда является специфичной. Сходные симптомы способны вызывать на одном и том же индикаторе разные возбудители. Поэтому при идентификации выявленных инфекций вводят дополнительные индикаторы, обладающие характерной реакцией на заражение, и привлекают другие тесты, в том числе серологические.

Серологическая диагностика. Иммунологические методы определения зараженности организмов начали использоваться значительно раньше в медицине, чем в растениеводстве на растениях, инфицированных вирусами, хотя их способность индуцировать в теле животных образование антител обнаружено Двораком еще в 1927 г. Таким образом, было показано, что многие возбудители и даже отдельные химические элементы структуры их частиц (обычно белковые фракции) являются активными антигенами. В 1937 г. М.Дунин, Т.Федотова и Н.Попова предложили для определения вирусов в растениях в качестве тест-анализа использовать реакцию агглютинации в капле клеточного сока после смешивания ее со специфической сывороткой (капельный метод), в основе которого лежит способность образовывать комплекс “антиген - антитело”. В результате методика, вследствие своей простоты, достаточной точности и быстроты проведения анализов, нашла широкое применение в фитопатологии, селекции и семеноводстве различных культур при решении разнообразных задач, например, при ранней диагностике поражений, в том числе и скрытой инфекции, дифференциации возбудителей, вызывающих сходные симптомы, по различиям в их антигенных свойствах, определения их концентрации и локализации в тканях и т. д. Однако использование “капельного” метода выявило целый ряд его недостатков: проявление спонтанных реакций агглютинации (даже в случаях отсутствия инфицирования), недостаточная чувствительность и специфичность (в частности, при анализах возбудителей, имеющих антигенное сродство, либо, наоборот, обладающих серологически разными белками в оболочке, например, у вирусов желтой карликовости картофеля и пожелтения салата-латука, или даже разными частицами, как у вируса некроза табака,).

В дальнейшем были разработаны более совершенные методы. Наибольшей надежностью и чувствительностью среди них отличаются иммунодиффузия в агаровом геле, агглютинация с латексом, иммуноферментный анализ и различные их модификации (см. рис. 6).

В настоящее время, благодаря простоте выполнения анализов, возможностям их автоматизации и массовых определений иммуноферментный метод (ИФА или ELISA) стал одним из самых распространенных в научных исследованиях и диагностике. Чувствительность достигает 1 нг (нанограмм) определяемого количества.

По способу выполнения анализа различают гомогенный и твердофазный варианты ИФА. Весь процесс условно можно разделить на 3 последовательные стадии. На первой - при иммунохимической реакции формируется комплекс АГ - АТ, адсорбированные на нерастворимом носителе или ковалентно связанные с ним АТ (антитело) взаимодействуют с АГ (антиген) или каким-либо другим анализируемым белком. Несвязавшиеся компоненты отмывают. На втором этапе в комплекс вводят метку – АГ (антитела), конъюгированные с ферментом и специфичные к анализируемым белкам возбудителя. Третья стадия – выявление метки с помощью индикаторной ферментной реакции. Существует несколько схем проведения анализа.

При твердофазном методе антитела (обычно фракция иммуноглобулинов из специфической сыворотки) или антигены адсорбируют в течение 18-20 ч при 4ºС на поверхности ячеек полистироловых микроплат (“твердая фаза”). Связывание происходит в результате ”пассивной адсорбции” за счет гидрофобного взаимодействия и зависит от концентрации белка в растворе и ионной силы буфера, температуры среды и времени реакции. Незафиксировавшиеся компоненты реакции удаляются многократным (обычно 3-разовым) отмыванием буферным раствором с добавлением детергента, например, тритона Х-100. Затем в лунки в зависимости от выбранного способа ИФА вносят анализируемые образцы. При “непрямом” методе - вирусные препараты, вытяжки, экстракты из растений (почек, листьев, лепестков, камбия и др.) и при “сэндвич”-методе (обычно применяется для анализа поливалентных антигенов), при котором на поверхность лунок адсорбируют при 37º 1 ч антигены, - специфические антитела (р-р иммуноглобулинов с концентрацией 3-5 мкг/мл). Далее в соответствии со схемой анализа снова отмывают ячейки плашек от веществ, не вступивших в реакцию. После этого в ячейки вносят по 0,2 мл конъюгата иммуноглобулина с ферментом (пероксидаза, галактозидаза или щелочная фосфотаза и др.) и инкубируют при 37ºС 1 ч (при непрямом способе – меченные ферменты). Платы отмывают буфером с Тритоном и добавляют в лунки для прекращения реакции и окрашивания продуктов реакции смесь 0,0015% Н2О2 (перекись водорода) и 0,08% 5-аминосалициловой кислоты (при использовании пероксидазы) или пара-нитрофенилфосфат (если берется щелочная фосфатаза).

Через 30 мин на абсорциометре определяют (обычно при длине световой волны 405 – 490 нм) оптическую плотность продуктов окисления (концентрацию возбудителя в пробе) с учетом фоновой плотности контрольных образцов.

В ряде случаев по чувствительности “непрямой” метод превосходит “сэндвич” - вариант в 2-6 раз. Кроме того, с его помощью удается одновременно диагностировать более широкий спектр штаммов вирусов, используя одну штаммоспецифическую сыворотку. Более того, наличие родственных антигенов у разных возбудителей позволяет использовать сыворотки, приготовленные к одному из них, для выявления зараженности другими вируами. Однако идентификация по серологическим свойствам в этих случаях, при которой, в первую очередь, учитываются индивидуальные особенности возбудителей, затрудняется. Анализу растений на зараженность вирусами “непрямым” методом иногда препятствует иммобилизация их антигенов на твердом носителе под воздействием компонентов клеточного сока, приводящая к неспецифическим реакциям. В свою очередь, “сэндвич”-вариант отличается большей специфичностью, хотя и не позволяет определять серологически неидентифицированные штаммы вирусов при использовании одной штаммоспецифической сыворотки. В настоящее время разработаны и предложены модификации методов, в частности “непрямого”, для ингибирования влияния компонентов сока на протекающие реакции. Это достигается использованием твердых носителей (полистироловых плат), уже предварительно сенсибилизированных фрагментами кроличьих АТ или протеина А золотистого стафилококка с интактными иммуноглобулинами, полученных путем специальной обработки, например пепсином, и содержащим активные группы в молекуле, ориентированные наружу и способные специфически связываться с вирусом. Нормальные клеточные компоненты в этом случае не сорбируются и легко удаляются из ячеек при их отмывании.

Для специальных исследований, например, при определении фракционного состава вирусных белков, при изучении комплексных инфекций, иммунологические процедуры сочетаются с различными физико-химическими методами – электрофорезом, электронной микроскопией и центрифугированием. Так, широко распространенный метод “вестерн-блот” позволяет с высокой разрешающей способностью, чувствительностью и специфичностью анализировать персистирующие в растениях вирусы. Метод включает три этапа. На первом – проводится электрофоретическое разделение вирусных белков в полиакриамидном геле в присутствии детергента - додецилсульфата натрия. Под действием электрополя белковые молекулы движутся к катоду со скоростью обратно пропорциональной их молекулярной массе. В результате исходный образец (растительные экстракты или вирусный препарат) разделяется на фракции с одинаковыми молекулами, молекулярную массу которых определяют с помощью стандартных маркеров (стабильные белки с известной молекулярной массой от 12 до 200 кД), разгоняемых в том же гелеевом блоке и тех же условиях. Вторая стадия – электрофоретический перенос (электроблотинг) разделенных белков из геля на твердую нитроцеллюлозную подложку и на третьей – полученную реплику (блот) подвергают иммуноферментному анализу. Следует иметь в виду, что в присутствии ДДС-Na часть белков может изменять и даже утрачивать свои антигенные свойства, которые частично денатурируют в ходе переноса их из геля на нитроцеллюлозу в присутствии метанола и после обработок блота неионными детергентами.

В основе иммуносорбентной электронной микроскопии лежит способность вирусных частиц специфически сорбироваться из капли анализируемого клеточного сока или вирусосодержащих растворов на покрытые антителами сетки-подложки. С помощью этого метода удается обнаруживать в 100-1000 раз большее количество вирусных частиц.

Традиционные серологические методы оказались малопригодны в случаях с вироидной инфекцией, поскольку последние представлены низкомолекулярной одноцепочечной РНК, не обладающей достаточной собственной иммуногенностью. Поэтому для получения точной информации об их видовой принадлежности привлекают иные диагностические показатели: характер проявления на индикаторах, физико-химические свойства и др.

При анализах фитоплазменных инфекций, наряду с указанными методами, используют реакцию ингибирования их роста в условиях культивирования на искусственных средах с помощью специфических сывороток. В частности, после наложения бумажных дисков, пропитанных антисывороткой, на твердую питательную среду, на которую высеваются тестируемые виды, наблюдается подавление развития родственных организмов.

В организме животных антитела (после введения антигена) вырабатываются в основном лимфацитами и плазматическими клетками лимфатических узлов, селезенки и костного мозга. Они представляют собой сывороточные белки глобулиновой фракции. Их можно обнаружить во всех циркулирующих жидкостях тела животного. Свойством связываться с антигеном, вызвавшим их образование, обладают сравнительно небольшие молекулы иммуноглобулинов с трехмерной структурой (коэффициент седиментации 6,6S и мол. вес – 1,5·105).

Приготовление сывороток. При получении сывороток используют препараты достаточно высокой степени чистоты и однородности, свободные от различных антигенно-активных примесей. Для иммунизации (введение антигена) можно брать любых здоровых животных (позвоночных) лошадей, баранов, крыс, мышей и т.д. Однако чаще в этих целях используются кролики, которые при однократном отборе крови могут дать от 20 до 40 мл сыворотки. Ее титр зависит от дозы вводимого антигена (она обычно колеблется в пределах 500-1000 мкг), его чистоты, способа иммунизации (внутривенное, внутримышечное, подкожное или их сочетания), числа инъекций, срока взятия крови, применения веществ, стимулирующих образование антител (адьювантов). Внутривенно препараты вводятся без адьювантов. Иммунизация, как правило, проводится дробно в течение 2-4 нед. возрастающими дозами антигена. Интервал между инъекциями, в зависимости от первичной дозы, составляет 3-7 дней. Часто применяют комбинированные схемы иммунизации, особенно в случаях, когда антигенные свойства возбудителя недостаточно изучены. Например, для ряда вирусов практикуются дробные способы иммунизации: чередование подкожных и внутрикожных инъекций малыми дозами антигена. Через 10 – 14 дней после последней иньекции проводят отбор крови (при использовании кроликов - из ушной вены). Для увеличения титра антител иногда через 40 - 150 дней проводят реиммунизацию животных тем же антигеном. Однако в этом случае возможно снижение специфичности образующихся антител.

В диагностических сыворотках независимо от способа их приготовления обычно содержится смесь антител, различающихся по специфичности (и чувствительности). Вследствие этого, для повышения объективности анализов используют моноклональные антитела, которые готовят путем инкубирования сыворотки с бесконечно размножающимися опухолевыми (миеломными) клетками мышей в смеси с их В-лимфацитами. В результате чего формируется новая популяция плазматических клеток (гибридом), которые приобретают способность сами самостоятельно продуцировать специфические антитела. После отделения последние используются при производстве диагностикумов.

Исследование серологических взаимоотношений между различными видами (штаммами) является одним из объективных критериев определения таксономической принадлежности фитоплазм. Для получения антисыворотки используют бульонную культуру возбудителей в логарифмической фазе роста. При анализах, наряду с универсальными (латекс-тест, связывание комплемента, иммунноферментный анализ и др.) применяется метод, основанный на реакции ингибирования роста. Причем наибольшее практическое распространение получила методика наложения бумажных дисков, пропитанных иммунной сывороткой, на твердую питательную среду непосредственно после высева на нее тестируемых объектов. Микроорганизмы (вид, штамм), рост которых прекращался в местах соприкосновения с дисками, тестировались с учетом специфичности антисыворотки, использованной для их пропитки.

В последнее время для диагностики (и идентификации) вирусов рекомендуется использовать в качестве антигенов их рекомбинантные белки, что значительно удешевляет технологию получения антисывороток и исключает трудоемкие операции по выделению вирусных препаратов и очистке их от различных примесей (белки растений, близкородственные вирусы). Процесс приготовления сывороток включает 3 этапа: клонирование генов, кодирующих структуру белковых оболочек и их экспрессия в E. сoli; очистку получаемых рекомбинантных белков на хромотографических колонках с Ni-нитрилотриацетатной агарозой (Ni-NTA) и приготовление к ним сыворотки.

Гистологический анализ. При некоторых инфекциях в клетках пораженного растения, различных тканях переносчика (слюнных железах, жировом теле, эпителии кишечника и др.) образуются включения. Их легко обнаружить в световом микроскопе после специальной обработки или окрашивания. Включения могут иметь форму паракристаллов (вирус закукливания овса, вирус мозаики турнепса), нитевидных (вирус желтухи свеклы), игловидных (ВТМ) или аморфных (вирус Х-картофеля) образований. Они не всегда специфичны, в частности, при поражениях ВТМ наблюдается формирование игловидных и гексагональных паракристаллов наряду с аморфными включениями.

Характерное образование в тканях больных растений включений различного типа, в том числе видимых в световом микроскопе, часто используется в диагностических целях. Так, обнаружение в пульпе, мацерированной мякоти плодов томата игловидных паракристаллов свидетельствует о зараженности образцов ВТМ. При анализах для выявления включений готовят препараты (временные или постоянные) из тканей растений (нижнего или верхнего эпидермиса листьев, тонких срезов разных органов, наружных листовых или стеблевых волосков и.т.д.), которые окрашивают, например, кислым фуксином, для контрастирования и лучшего наблюдения. При экспресс-диагностике поражений вирусом мозаики озимой пшеницы применяют 0,1 н раствор HCl, под действием которого в клетках высечек из листьев, помещенных в каплю реактива, выпадают игловидные кристаллы.

При диагностике фитоплазм, для изучения их морфологических признаков также достаточно широко применяются различные методы световой микроскопии: просмотр препаратов в темном поле из жидкой среды, анализ микротомных срезов зараженных тканей, в частности флоэмных, на основе флюоресценции ДНК при ее окрашивании специфическим красителем 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (см. рис. 3).

Электронная микроскопия. C помощью электронного микроскопа (просвечивающего или сканирующего) возможно изучение морфологии возбудителей болезней, определение их размеров и внутреннего строения, особенностей взаимодействия с клеткой, этапов репродукции. Способы приготовления препаратов для этих целей различаются в зависимости от вида возбудителя и растения-хозяина. В частности, применяются разные приемы стабилизации частиц, препятствующие процессам агрегации или деградации, и их контрастирования солями тяжелых металлов (золото, платина, уран) путем напыления в вакууме или специальной химической обработки, при которой используются такие соединения, как фосфорно-вольфрамовая кислота (1-2%), уранилацетат (1%), молибдат аммония (2%), вольфрамат натрия и др. При негативном контрастировании объект обрабатывается веществами с высокой электронной плотностью, которые очерчивают его контуры, а в некоторых случаях и внутренние структуры (белковые субъединицы, центральный канал, например, у палочковидных, нитевидных и бацилловидных вирусов). В качестве объектодержателя (подложки) применяется специальная медная сеточка, на которую наносится коллодиевая, формваровая или угольная пленка. Последняя обладает наибольшей прочностью под электронным пучком. Препараты контрастируют, например, напылением металлов (платина, золото). Метод сравнительно дорог.

После разработки упрощенных методов приготовления вирусных препаратов, в частности метода погружения и использовании эксудативных выделений, появилась возможность получать экспресс-информацию о наличии возбудителя в тканях анализируемого растения с помощью электронной микроскопии. Этим методом легко удается диагностировать заболевания, вызываемые вирусами с нитевидной, палочковидной и бацилловидной формой частиц. При анализах сферических вирионов иногда возможны некоторые трудности из-за примесей неспецифических структур, близких по размерам и оптическим свойствам вирусным частицам, например различных клеточных фрагментов, при использовании недостаточно очищенных растительных препаратов. Более того, поскольку размеры частиц у разных вирусов со сферической формой достаточно близки, данные электронномикроскопического анализа при идентификации возбудителей выступают как дополнительные показатели.

Из-за присутствия примесей неспецифических структур анализ поражений возбудителями со сферической формой частиц проводят, как правило, после предварительной очистки препаратов. Операции по выделению и очистке, в частности с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сульфата цезия, электрофореза в ПААГ или хроматографии, являются обязательными при подготовке и просмотре вироидных препаратов.

При оценке же зараженности образцов, когда не имеет значение определение вида возбудителя, диагноз с привлечением этого метода может проводиться. Оптимальный срок отбора образцов для анализа - листьев и побегов - приходится на начало вегетации и плодов - на период их созревания.

От собранных частей растений (листьев, черешков, побегов и др.) получают срезы (2-3 шт.), которые для контрастирования помещают в каплю 2% фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7,0). Затем оттянутой пипеткой переносят небольшое количество вытяжки на подложки-сетки с пленкой, подсушивают, удаляя избыток суспензии фильтровальной бумажкой, и просматривают под микроскопом.

Электронная микроскопия относится к наиболее достоверным методам идентификации фитоплазм. При анализах ультратонких срезов пораженных тканей определяют и особенности их локализации. Для получения срезов с растений, имеющих специфические признаки заболеваний типа карликовости, реверсии цветков и хлороза листьев, выбирают участки тканей, где концентрация возбудителей наибольшая (жилки листьев, цветоножки, флоэма стеблей). Кусочки тканей (около 1 мм) фиксируют в 5% растворе глютаральдегида (по Миллонигу), промывают в буфере (рН 7,2) и обрабатывают 2% четырехокисью осмия в течение 2-3 ч. После повторной промывки тканей и их обезвоживания (путем проводки через спирт, ацетон и их смесь) объект пропитывают и заливают специальными смолами (эпоны или аралдиты) и после полимеризации в желатиновых капсулах используют для приготовления срезов на ультрамикротоме, например, фирмы LKB. Полученные срезы контрастируют (цитрат свинца и др.), помещают на сеточки (с большими ячейками), покрытые формваровой пленкой и просматривают под электронным микроскопом.

Широкое применение, особенно при изучении морфологии спироплазм, получил Transfer - метод, основанный на технике переноса микроорганизмов из жидкой культуры на агар и затем после инкубации на препаративную сетку для просмотра в электронном микроскопе.

Для большей эффективности выявления антигенно-активных структур, а также дифференциации морфологически сходных возбудителей, иногда применяется дополнительная обработка (“активация”) специфической антисывороткой подложек перед их погружением в анализируемую суспензию.

В последнее время для исследования морфологии возбудителей используется сканирующий электронный микроскоп, разрешающая способность которого составляет около 50 нм. С его помощью частицы образца просматриваются объемно под разными углами зрения.

Физико-химические тесты. При идентификации возбудителей сведения об их свойствах, на основании которых проводится определение видовой принадлежности, получают при изучении очищенных препаратов. В качестве исходного материала для их выделения обычно используются растительные экстракты из восприимчивых видов, способных накапливать в своих тканях вирусы и вироиды в высоких концентрациях, но в которых отсутствуют (или содержатся в минимальных количествах) вещества, ингибирующие их репродукцию или непосредственно разрушающие их частицы. Такие растения-доноры выращиваются в условиях изоляции для предотвращения их заражения посторонними патогенами.

При очистке препаратов применяют разные методы - химические, физические, иммунологические, инструментальные. При химических технологиях концентрирование и выделение вирусов проводят, осаждая их специфическими реагентами, например, этанолом, сульфатом аммония и др. При очистке для разрушения балластных белков и нуклеиновых кислот используют некоторые ферменты - трипсин, нуклеазу и др. Денатурации нормальных компонентов клетки, увеличению выхода вирусной массы, в частности стабильных возбудителей, способствуют термическая обработка суспензий, вытяжек и глубокое замораживание растительного материала. Удаление посторонних белковых примесей достигается также эмульгированием экстрактов с различными неполярными растворителями. При получении препаратов лабильных возбудителей используют более мягкие приемы избирательной адсорбции вирусов на специфических сорбентах и гель-фильтрации на молекулярных ситах (сефадексы, агароза и др.), позволяющие проводить фракционирование суспензий в зависимости от размера молекул. В результате из смеси удаляются низкомолекулярные примеси. При использовании хроматографии на агаровых колонках удается добиться высокой степени очистки вирусных препаратов на завершающих этапах их производства. Для удаления низкомолекулярных фракций и солей может применяться и диализ через различные мембраны. Очистку вирусных препаратов от рибосом и сопутствующих растительных белков часто проводят с помощью бентонита или этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).

Для стабильных вирусов иногда применяют метод осаждения их в изоэлектрической точке, в основе которого лежит способность вирусных белков образовывать с солями обратимые комплексы. Растворение последних в нейтральных растворах с последующим переосаждением позволяет удалять из экстрактов основные белки растений, отличающиеся по своим электрохимическим свойствам от вирусных.

На всех этапах выделения и производства очищенных вирусных препаратов соблюдаются условия, способствующие сохранению инфекционности и интактного состояния вирионов (рН среды, низкие температуры). Для этого используются буферные системы разной ионной силы и солевые добавки, обеспечивающие в среде присутствие дивалентных катионов, например, Са2+ или Мg2+. Величина ионной силы буферного раствора и его рН - фактор специфичный, варьирующий в зависимости от свойств вируса. Для ингибирования инактивирующего действия различных соединений (фенольных, фенолоксидазы и др.) используют вещества, относящиеся к восстановителям, например, сульфит и тиогликолят натрия. При очистке некоторых вирусов (мозаики яблони, огурца, некротической кольцевой пятнистости сливы и др.) для этих целей применяются вещества из группы хелатов, реагирующих с катионами меди, входящей в состав полифенолоксидазы, такие как диэтилдитиокарбамат натрия. Нейтрализация действия таннинов осуществляется добавлением синтетических полимеров, например поливинилпирролидона, или соединений никотина.

Для анализа белков фитоплазм иногда используют метод электрофореза в полиакриламидном геле.

Вироиды, как известно, обладают способностью к самогибридизации вследствие высокой степени внутренней комплементарности (до 70%). Поэтому при их диагностике используют методы гибридизации (dot – spot) на нитроцеллюлозной бумаге, где тестируемая в соке анализируемого растения или очищенных препаратах РНК вироида гибридизируется с РНК из больных растений с известной этиологией, меченной Р32. Для гибридизации с РНК вироида может также использоваться комплементарная кДНК, техника получения которой предусматривает вначале выделение и клонирование рекомбинантной ДНК. Данная методика впервые была апробирована для диагноза болезни «каданг-каданг» и вироида веретеновидности клубней картофеля.
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   ...   19

Похожие:

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconУчебное пособие Москва Издательство Российского Университета дружбы народов 1998
...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconУчебное пособие Издание третье, исправленное и дополненное Москва...
Б 17 Литературное редактирование: Учеб пособие., изд. 3 – М.: Рудн, 2010. – 249 с

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconБалыхина Т. М. Методика преподавания русского языка как неродного...
Методика преподавания русского языка как неродного (нового): Учебное пособие для преподавателей и студентов. М.: Издательство Российского...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов icon3 альтернативные вопросы для текущего контроля, проводимого на каждом...
Перед вами учебное пособие, составленное на основе многолетнего опыта работы преподавателей кафедры биологической химии медицинского...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconУчебное пособие Больничная гигиена Москва Российский университет...
В пособии представлены основные разделы больничной гигиены. Учебное пособие подготовлено в соответствии с программой по специальности...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconЖурналистика
Рецензенты: кафедра печати, радиовещания и телевидения историко-филологического факультета Российского университета дружбы народов...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconОбразовательная программа магистерской подготовки по направлению 030900 «Юриспруденция»
Образовательная программа одобрена решением ученого совета Юридического факультета Российского университета дружбы народов

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconУчебное пособие «Основы современной социологии» Год издания: 2001...
Григорьев С. И., Растов Ю. Е. Основы современной социологии. Учебное пособие. Барнаул: Издательство Алтайского государственного университета,...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconУчебное пособие Москва 2008
Юдин В. П. Профсоюзная работа в школе. Учебное пособие. Москва, Издательство мгоу, 2008. 126 с

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconУчебное пособие Часть 1
Р89 Русский язык и культура речи для студентов-нефилологов. Ч. 1: учебное пособие/ Колпакова Л. В., Максименко Е. В., Михайлова О....

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconУчебное пособие Москва Издательство Московского государственного...
Рекомендовано к изданию Редакционно-издательским советом университета в качестве учебного пособия для студентов направления 230100...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconУчебное пособие Москва Издательство Московского государственного...
Рекомендовано к изданию Редакционно-издательским советом университета в качестве учебного пособия для студентов направления 230100...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconГотовность специалистов к эффективной опытно-конструкторской и производственно-технологической...
Миссия рудн утверждена на Общеуниверситетской конференции научно-педагогических работников, преподавателей, сотрудников и учащихся...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования
Мосейкина Марина Николаевна назначена приказом Ректора Российского университета дружбы народов от 06 мая 2014 года №1743-к на должность...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов icon2006 философия вводный курс лекций москва Российский университет дружбы народов
Гречко П. К. (Введение, Тема 7), Волгин О. С. (Темы 11, 12, 15, 18), Орехов А. М. (Темы 13, 16), Рудановская С. В. (Темы 6, 8), Курмелева...

Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов iconУчебное пособие Издательство Иркутского государственного технического университета 2014
Курышова И. В. История и теория местного самоуправления : учеб пособие. – Иркутск : Изд-во Иргту, 2014. – 112 с


Руководство, инструкция по применению




При копировании материала укажите ссылку © 2018
контакты
rykovodstvo.ru
Поиск