Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)
Приготовление разведений. Посев в жидкую среду и регистрация результатов, исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.
Метод предельных разведений
Метод нашел широкое применение для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не развиваются на плотных питательных средах. Этим же методом пользуются при определении численности бактерий, относящихся к той или иной физиологической группе. Сущность метода предельных разведений состоит в следующем. В пробирки с жидкой средой вносят строго измеренный объем из различных разведений исследуемого субстрата.
После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают по таблице наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исходного субстрата.
Определение количества микроорганизмов методом предельных разведений включает четыре этапа: приготовление разведений исходной суспензии, посев в жидкую среду, регистрацию наличия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исходного субстрата.
а) Разведенияисходной суспензии готовят точно так же, как и для чашечного метода Коха.
б) Посев в жидкую среду разведений природной воды
Для дальнейшего расчета наиболее вероятного числа бактерий (НВЧ) в единице объема посев исходной пробы воды производят в 3—4 параллельных ряда пробирок (рис.12). Чем больше сделано параллельных посевов каждого разведения, тем точнее будет получен результат. При этом в целях экономного расходования стерильной посуды рекомендуется использовать одну и ту же пипетку для засева параллельных (только!) разведений во всех трех рядах.
После инокулирования пробирки помещают в термостат или, при отсутствии его, ставят в теплое место в лаборатории. Время инкубации может колебаться от 3 до 7 сут и зависит от интенсивности роста микробных форм, численность которых определяют.
в) После инкубации регистрируют рост микроорганизмов под контролем глаза, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде определенных продуктов метаболизма.
г)Наиболее вероятное количество клеток в единице объема рассчитывают по таблице Мак-Креди, разработанной на основании методов вариационной статистики (таблица 2). Для этого первоначально составляют числовую характеристику, которая включает три цифры. Первая цифра слева показывает число пробирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры обозначают число пробирок, в которых отмечен рост микроорганизмов при засеве их из двух последующих разведений. Если рост был в последующих больших разведениях, число таких пробирок прибавляют к последней цифре. Отсутствие роста обозначается нулями.
Затем по таблице находят наиболее вероятное число микроорганизмов, соответствующее данному значению числовой характеристики. Количество микроорганизмов в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует тому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.
Пример 1
Разведения исходной суспензии 0 10-1 10 -2 10-310--4
Число засеянных пробирок 4 4 4 4 4
Число пробирок, в которых обнаружен рост4 4 3 1 0
Числовая характеристика 431 — — ——
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов ... 16,5
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии
16,5 Х 10 (разведение) = 165
П р и м е р 2
Разведение исходной суспензии 10 -210- 310-410-510--6
Число засеянных пробирок 3 3 3 3 3
Число пробирок, в которых обнаружен рост 3 3 2 0 0
Числовая характеристика …………320— ———
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов .9,5
Количество клеток микроорганизмов в 1мл исходной суспензии
9,5-103
Таблица 2
Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема исходной суспензии( по Мак-Креди)
Ц 10⁻1 10⁻2 10⁻3 10⁻⁴ 10⁻⁵ 10⁻⁶ 10⁻⁷ 10⁻⁸ 10⁻⁹
Рис. 1 Схема посева методом последовательных разведений
Ц 10⁻1 10⁻2 10⁻3 10⁻⁴ 10⁻⁵ 10⁻⁶ 10⁻⁷ 10⁻⁸ 10⁻⁹
Рис. 2 Схема посева методом предельных разведений
- пенициллиновый флакон
- чашка Петри
Практическая работа № 4
Определение численности микроорганизмов в почве, в воздухе и на предмете.
Задания № 1. Определить число клеток микроорганизмов в 1 г почвы, используя чашечный метод Коха (рис.1).
Задание №2. Определить число микроорганизмов в 1 м3 воздуха.
Задание № 3. Определить число микроорганизмов на предмете.
Практическая работа № 5
Определение численности микроорганизмов в почве, в воздухе и на предмете (продолжение предыдущего занятия).
Задание № 1. Рассчитать численность микроорганизмов в 1 г данного образца почвы.
Практическая работа № 6.
Определение количества клеток высевом в жидкие среды (3 ч)
Задание № 1. Используя метод предельных разведений определить численность микроорганизмов в 1 мл морской воды.
Задание № 2. Получить чистую культуру морских микроорганизмов
Модуль II Методы микроскопии
Практическая работа №1. Устройство светового микроскопа. Принцип темнопольной микроскопии.
Практическая работа №2.Правила работы на люминесцентном микроскопе.
Практическая работа №3. Основные правила подготовки препаратов для электронной микроскопии и работа на электронном микроскопе.
Практическая работа №4. Конфокальная микроскопия).
Модуль III. Молекулярно-генетическая идентификация гетеротрофных бактерий.
Выделение суммарной ДНК/РНК:с помощью набора РИБО-сорб (Амплисенс, Москва), методом ферментативного лизиса, методом цетавлоновой очистки. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Анализ продукта электрофорезом в 1% агарозном геле.СеквенированиеПЦР-продукта на автоматическом секвенатореBeckmanCoulterCEQ 8800 GeneticAnalysisSystem.
Пробоподготовка к флуоресцентной гибридизации insitu. Приготовление 4% ПФА. Приготовление 1× фосфатного буфера (1×PBS) (Amann, 1995.)
Флуоресцентная гибридизация insitu с групп специфичными зондами.
Выделение ДНК из чистых культур микроорганизмов
Для выделения ДНК используют суточные культуры микроорганизмов. На рисунке 13 представлена кривая роста бактериальной массы. Необходимо помнить, что в середине логарифмической фазы роста клеточная стенкабактерий максимально чувствительна к действию внешних лизирующихферментов и химических детергентов, клетка не содержит никакихоколоклеточных структур: капсул, чехлов и др.
Рис. Кривая роста культуры при периодическом культивировании
Спорообразованиеграмположительных спорообразующих бактерий начинается в концестационарной фазы роста. Поэтому отбирать клетки для выделения геномнойДНК лучше всего именно в середине логарифмической фазы роста культуры.Клетки из жидкой среды осаждают центрифугированием, а если биомассунаращивали на твердом агаре, смывают трис-солевым буфером и осаждаютцентрифугированием. Бактериальный осадок промывают и суспендируют в400 мклтрис-солевого буфера, содержащего 1 мг/мл лизоцима. Лизис ведут30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют SDS до конечнойконцентрации 1% SDS в растворе и инкубируют 10 мин при комнатнойтемпературе. в
Ведут дальнейшую обработку фенолом:хлороформом и осаждениебактериальной ДНК.
Практическая работа №1
Приготовление рабочих растворов и растворов хранения для молекулярно-генетической идентификации микроорганизмов: Среда LB,трис-HCl, TFB буфер, TAE буфер.
Практическая работа №2
Выделение ДНК из чистых культур водных микроорганизмов с помощью набора для выделения ДНК «РибоСорб».
Практическая работа №3
Выделение суммарной ДНК из донных осадков с помощью рабочих растворов.
Практическая работа № 4
Идентификация микроорганизмов на основании полученной ДНК методом секвенирования.
Пробы воды должны быть профильтрованы через бактериальные фильтры, диаметр пор которых 0,45 или 0,22 мкм. Для фильтрации воды лучше всего использовать стерильные фильтры компании Millipore маркировка SterivexTM-GV с диаметром пор 0,22 мкм, каталожный номер SVGV01015 (рис. 2, А). Фильтры представляют собой пластмассовый пенал, в который упакован нитроцеллюлозный фильтр. Они стерильны. Пробы можно фильтровать с помощью перистальтического насоса мягко, с небольшим давлением. Кроме того, можно использовать пластмассовые, стеклянные или металлические фильтровальные установки с диаметром подложки 25 или 45 мм (рис. 2, Б, В). В этом случае используют фильтры нитроцеллюлозные или поликарбонатные с соответствующим диаметром фильтра. Если после фильтрации предполагается смывать бактериальный материал, тогда необходимо использовать поликарбонатные фильтры, имеющие ровную поверхность фильтра (рис. 3, А). Фильтрование через такие фильтры быстро затрудняется даже небольшим объемом осажденного бактериального материала. Нитроцеллюлозные фильтры состоят из волокон целлюлозы (рис. 3, Б), поэтому через фильтры такой структуры можно отфильтровать бόльший объем водной пробы. Фильтрование необходимо проводить до тех пор, пока фильтр полностью не забьется бактериальным материалом. Объем воды может варьировать от 200 мл до 5 л. Для фильтрации в этом случае используют вакуумный, перистальтический или ручной насос. Фильтры до дальнейшей обработки либо замораживают в жидком азоте, либо фиксируют 70–80% этанолом. Пробы почвы или осадков сразу после пробоотбора замораживают в жидком азоте и хранят при –40°С. Пробы бактериальных матов и любой материал, содержащий ассоциированных микроорганизмов, должен быть немедленно либо фиксирован 70% этанолом, либо обработан лизирующими буферами. Хранить такие пробы можно при 4°С.
Рис..Фильтры и фильтровальные установки, используемые для фильтрации бактериального материала: А – кассетные фильтры Sterivex, Б – пластмассовая и В – стеклянная фильтровальные установки.
А
Б
В
Рис. .Тонкая структура поликарбонатного (А) и нитроцеллюлозного (Б) фильтра под сканирующим электронным микроскопом.
А
Б
Выделение суммарной бактериальной ДНК
Процедура выделения суммарных нуклеиновых кислот включает три основные стадии: (1) лизис клеточных стенок, (2) денатурация и удаление таких макромолекул клеток как белки, полисахариды, липиды и (3) собственно осаждение нуклеиновых кислот. Лизис клеточных стенок может быть проведен химическими детергентами (химический), ферментами (ферментативный) или механически с помощью гомогенизатора. Химическимидетергентами могут бытьхлоргидратгуанидина,СТАБ, додецилсульфат натрия (SDS) или щелочи (рис. 4).Основным ферментом, используемым для разрушения клеточных стенок, является лизоцим, а дополнительную обработку проводят протеиназой К. Иногда перед проведением ферментативного или химического лизиса необходимо механически разрушить клетки, тщательно растирая материал в фарфоровой ступке пестиком или гомогенизируя пробу в механическом гомогенизаторе (рис.5).
Рис. 4.Структурные формулы основных химических детергентов.
СТАБ
H
N+HCl
||
H2N
С
NH2
Хлоргидратгуанидина
CH3 Br‒
|
H3C(H2C)15
N+
CH3
|
CH3
O
||
H3C(H2C)11
O
S
O‒ Na+
|
O‒ Na+
SDS
Рис.. Гомогенизаторы, используемые для разрушения клеток. А – лабораторный ультразвуковой гомогенизатор LABSONIC, Б – Mikro-Dismembrator U – шаровая мельница.
А
Б
Для изучения разнообразия природных микробных сообществ рекомендуется одновременно использовать разные методики выделения суммарной ДНК. Эти методики отличаются между собой по стадиям выделения ДНК, поэтому, не смотря на то, что доминирующие генотипы микроорганизмов могут быть одинаковыми, разнообразие сопутствующей микрофлоры часто варьирует.
Обработка проб. Суспензию клеток, фиксированную 80% этанолом, центрифугируют на настольной центрифуге на максимальных оборотах (12000 об/мин). Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 100 мклтрис-солевого буфера для выделения ДНК методом ферментативного лизиса (Белькова, 2004) или в 50 мкл ТЕ-буфера для выделения ДНК методом цетавлоновой очистки (Грачев и др., 2006).
Приготовление буферных растворов. В ежедневной работе удобно использовать растворы хранения и рабочие растворы основных буферов. Растворы хранения – концентрированные растворы, имеющие определенную рН, хранят при комнатной температуре или в холодильнике при 4°С. Рабочие растворы готовят непосредственно перед использованием.
Молекулярные веса основных компонентов:
трис-основной Мвес=121,2 г/моль
NaClМвес= 58,4 г/моль
ЭДТА (динатриевая соль) Мвес= 336,2 г/моль
Ацетат натрия(безводный) Мвес= 82,0 г/моль
Приготовление раствора хранения 1М трис-HCl, pH 7,5. Навеску 12,1 г трис-основного растворить на магнитной мешалке в 80 мл дистиллированной воды. Оттитровать рН раствора до 7,5 1Nсоляной кислотой, после чего довести окончательно объем в мерной колбе до 100 мл. Профильтровать через 0,22-микронный фильтр в стерильную стеклянную посуду, хранить при 4°С.
Приготовление раствора хранения 1М трис-HCl, pH8,0. Навеску 12,1 г трис-основного растворить на магнитной мешалке в 80 мл дистиллированной воды. Оттитровать рН раствора до 8,0 1Nсоляной кислотой, после чего довести окончательно объем в мерной колбе до 100 мл. Профильтровать через 0,22-микронный фильтр в стерильную стеклянную посуду, хранить при 4°С.
Приготовление раствора хранения 5М NaCl. Навеску 29,0 г хлорида натрия растворить на магнитной мешалке в 95 мл дистиллированной воды, после чего довести окончательно объем в мерной колбе до 100 мл. Хранить при комнатной температуре.
Приготовление раствора хранения 0,5М ЭДТА, рН 8,0. Навеску 168 г ЭДТА растворить на магнитной мешалке в 400 мл дистиллированной воды. Оттитровать рН раствора до 8,0 ледяной уксусной кислотой (работать в вытяжном шкафу), после чего довести окончательно объем в мерной колбе до 500 мл. Хранить при комнатной температуре.
Приготовление раствора хранения 3М ацетата натрия, рН 5,0. Навеску 24,6 г ацетата натрия растворить на магнитной мешалке в 80 мл дистиллированной воды. Оттитровать рН раствора до 5,0 ледяной уксусной кислотой (работать в вытяжном шкафу), после чего довести окончательно объем в мерной колбе до 100 мл. Профильтровать через 0,22-микронный фильтр в стерильную стеклянную посуду, хранить при 4°С.
|
