МАТЕРИАЛЫ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ
по дисциплине «Большой практикум»
Специальность — 020209.65 микробиология
Форма подготовки очная
г. Владивосток
2012
Модуль I. Методы отбора проб для микробиологических исследований. Методы посева на плотные питательные среды и результаты его учета.
Занятие 1. Отбор проб для микробиологических исследований Способы отбора проб. Транспортировка проб и хранение. Экскурсия на объекты .
.Рис. 1. Контейнеры для отбора проб (а) – воды, (б) - грунта
Посев материала в лаборатории: 1) Приготовление питательных сред 2) посев на среды.
Рецепты приготовления сред для определения индикаторных групп бактерий
Среда для морских микроорганизмов (СММ)(питательная среда, адаптированная для морских гетеротрофов) –(г/л): CaCO3 – 1.0, MgSO4 – 1.0, пептон – 5.0, дрожжевой экстракт – 5.0, K2HPO4 – 0.2, глюкоза – 0.2, агар – 15.0, H2O искусственная морская* – 500 мл, H2O дистиллированная – 500 мл; pH – 7.8–8.1 (YouchimizuKimura, 1976).
Среда для микроорганизмов пресноводных водоемов (СПМ) - (г/л): CaCO3 – 1.0, MgSO4 – 1.0, пептон – 5.0, дрожжевой экстракт – 5.0, K2HPO4 – 0.2, глюкоза – 0.2, агар – 15.0, H2O дистиллированная – 1л; pH – 7.8–8.1 (YouchimizuKimura, 1976).
Минеральная среда для культивирования морских бактерий МКД (г/л): NH4Cl – 1, К2НРО4 – 1, дрожжевой экстракт – 0.05, Н2О искусственная морская – 1 л, pH – 7.2–7.5 (NaOH) (Руководство по методам…, 1980).
Примечание* - если исследуется пресная вода, то вместо морской воды используют дистиллированную воду
Искусственная морская вода (г/л):NaCl – 27.5, MgCl2 – 5.0, MgSO4·7H2O – 2.0, CaCl2 – 0.5, KCl – 1.0, FeSO4 – 0.001 (YouchimizuKimura, 1976).
Занятие 2 Методы посева и индикации микроорганизмов из разных сред обитания.
2.1. Посевы на плотные и жидкие среды. Изучение техник посева (по Дригальскому, Шукевичу, методы получения изолированных колоний)
Методы получения чистой культуры бактерий:
Для получения чистой культуры бактерий осуществляют посев материала (проба воды или грунта) на чашку Петри с питательным агаром. С целью получения изолированных колоний на поверхности агара посев осуществляют: методом Дригальского, методом истощающего штриха, методом «решетки» /«площадки» или методом последовательных разведений.
1.1. Метод Дригальского заключается в том, что посевной материал распределяют по поверхности чашки Петри с помощью шпателя, затем, не обжигая шпатель, переносят его на поверхность второй чашки Петри, растирая по поверхности. Повторяют эту операцию третий раз (не обжигая шпатель). Материал на поверхности шпателя истощается и на последней (третьей) чашке Петри можно получить изолированные колонии.
Рис. Посев на плотную среду по методу Дригальского
1.2.Метод истощающего штриха выполняется с помощью бактериологической петли. Материал отбирается большой петлей и распределяется по поверхности чашки последовательно зигзагами без обжига петли, т.е. с каждым новым зигзагом число клеток бактерий на поверхности петли уменьшается. Последний зигзаг получится самым истощенным, что даст возможность получить изолированные колонии.
Рис. Посев на плотную среду методом «истощающего штриха»
1.3. Метод «площадки» или «решетки» выполняется с помощью бактериологической петли. Материал отбирается петлей и сбоку чашки Петри ( площадь 2 – 3 см) делается сплошная штриховка петлей. Затем петлю обжигают, остужают и «протягивают » из штрихованного поля перпендикурярно ему вниз полосу петлей, затем рядом вторую.
Обжигают петлю второй раз, и проводят ею полосы перпендикулярно предыдущим полосам. На пересечении полос вырастут изолированные колонии.
Рис. Посев на плотную среду методом «площадки»
2.2. Получение накопительной и чистой культуры микроорганизмов.
Методы выделения накопительных культур микроорганизмов: обогащения, нагревания, выделения подвижных форм бактерий (метод Шукевича)(37 ч)
Практическая работа № 1
Получение накопительных культур микроорганизмов
Задание № 1. Получить накопительную культуру аэробных спорообразующих бактерий
Задание № 2. Приготовить накопительную культуру маслянокислых бактерий.
Задание № 3. Приготовить накопительную культуру молочнокислых бактерий.
Задание № 4. Приготовить накопительную культуру свободноживущих аэробных азотфиксирующих бактерий.
Задание № 5 . Приготовить накопительную культуру подвижных форм бактерий.
Практическая работа № 2
Получение накопительных культур микроорганизмов ( продолжение предыдущего занятия
Задание № 1. Просмотреть пробирки с накопительными культурами сенной палочки и отобрать те, в которых на поверхности сенного настоя образовалась тонкая пленка. Провести микроскопическое исследование полученных культур в препаратах «раздавленная капля» и выбрать пробирки, где преобладают мелкие одиночные палочки, образующие споры.
Задание № 2. Проверить присутствие маслянокислых бактерий в накопительной культуре по следующим признакам:
помутнение раствора;
выделение газа;
наличие характерного запаха масляной кислоты;
микроскопически, приготовив живой окрашенный раствором Люголя препарат накопительной культуры.
Задание № 3. Просмотреть пробирки с накопительными культурами молочнокислых бактерий. Отобрать из них те, на поверхности которых нет пленки. Пленку дают дрожжи, а в этом случае молочнокислые бактерии выделить трудно. Провести микроскопическое исследование полученных культур.
Задание № 4. Определить присутствие в исследуемом образце почвы аэробных азотфиксаторов Azotobacterchroococcum по показателям.
Задание № 5. Рассмотреть пробирки с засеянным гниющим мясом. Отметить особенности роста подвижных форм бактерий.
Методы выделения чистых культур микроорганизмов
Метод Пастера (метод предельных разведений. Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотныхпитательных сред. Метод Коха (метод глубинного посева).Метод Дригальского. Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ. Биологические методы выделения чистых культур патогенных микроорганизмов.
Практическая работа № 3
Выделение чистой культуры микроорганизмов
Задание № 1. Получить изолированные колонии споровых аэробных бактерий.
Задание № 2. Получить чистую культуру протея.
Определение численности микроорганизмов высевом на плотные питательные среды (Чашечный метод Коха)
Метод последовательных разведений
В отличие от подсчета клеток под микроскопом, этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, одинаково пригодных для роста различных микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить число клеток микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, но не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растут или растут крайне медленно, что важно иметь в виду при анализе таких естественных субстратов как вода, ил, почва.
Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную среду в чашки Петри и подсчете выросших после инкубации колоний. Принято считать, что каждая колония — потомство одной клетки.
Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.
Приготовление разведений
Численность популяции микроорганизмов обычно достаточно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений (рис. 11). Разведения готовят в водопроводной воде или 0,85% -ном растворе NaC1, используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный 10. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии (проба морской воды) стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды, перемешивают новой стерильной пипеткой. Это первое разведение 1:10. Полученную в первом разведении пробу с помощью новой стерильной пипетки тщательно перемешивают, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3—5 раз, что обеспечивает перемешивание пробы и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения из первой пробирки и переносят его во вторую пробирку — это второе разведение, 1 : 100. Таким же образом готовят и последующие разведения.
Для приготовления каждого разведения следует обязательноиспользовать, отдельную пипетку. Пренебрежение этой предосторожностью может привести к получению ошибочного результата, иногда в 100 и более раз превышающего истинный. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при каждом разведении. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной завышенного результата.
Проведение посева
а) Поверхностный посев. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную, агаризованную, питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15 — 20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхность araризованных сред перед посевом подсушивают для удаления конденсационной воды. С этой целью чашки Петри открывают и застывшей средой вниз помещают на 20 — 30 мин в сушильный шкаф, нагретый до 70 — 80°. Предварительно шкаф необходимо простерилизовать.
После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем 0,1 мл соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делали 2 — 4 параллельных высева. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.
Колонии бактерий подсчитывают через день, колонии грибов и дрожжей — через 5 — 7, а колонии актиномицетов — через 7 — 15 суток инкубации в термостате.
Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки.
Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле
а х 10
М = -----------
V
где М — количество клеток в 1 мл, а — среднее
число колоний при высеве данного разведения, 10 — коэффициент разведения, n порядковый номер разведения, из которого сделан высев, V объем суспензии, взятый для посева, в мл.
б) Глубинный посев. При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1, 0,5 или 1 мл) суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 48—50° агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри. Среде дают застыть. В случае глубинного посева обычно пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом. По 1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2—4 стерильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15—20 мл расплавленной и остуженной до 48—50° плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет, чашки Петри помещают в термостат.
|
