Инструкция по применению наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием пцр в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией hrm

Комментарии и советы: Сигналы с отрицательными контролями в канале Cycling Green для аналитической ПЦР. а) В ходе подготовки ПЦР произошло загрязнение Повторить ПЦР с новыми реактивами в нескольких повторах. По возможности закрывайте пробирки для ПЦР сразу после добавления пробы, предназначенной для тестирования. Следить, чтобы загрязнение рабочего пространства и инструментов устранялось регулярно. b) При экстракции произошло загрязнение Повторить экстракцию и ПЦР пробы, предназначенную для тестирования, с использованием новых реактивов. Следить, чтобы загрязнение рабочего пространства и инструментов устранялось регулярно. Приложение А: Анализ данных на приборе Rotor Gene Q Следует проверить графики на Rotor-Gene Q во всех реакциях. Иногда наблюдается усиление флуоресцентного сигнала в отрицательном контроле без матрицы (ОК) и отрицательных пробах. При встрече с подобной ситуацией и при наличии значения CT пользователю нужно отличить истинный случай амплификации, который указывает на загрязнение отрицательного (без матрицы) от линейного роста флуоресценции, который может возникнуть из-за флуоресцирующего артефакта. Анализ отрицательного контроля (без матрицы) На Рис. 29 и 30 представлены графики кривых для отрицательного контроля. На Рис. 29 представлена нелинейная, т.е. истинная амплификация, возникшая из-за загрязнения. Такой анализ следует отбросить, а пробы протестировать повторно. На Рис. 30 показана линейная амплификация для отрицательного (ОК). В этом случае должна проверяться исходная флуоресценция. Соответствующий график исходной флуоресценции показан на Рис. 31, демонстрируя линейный рост флуоресценции, а не истинную амплификацию. Данные анализа могут использоваться, если прошли положительный и внутренний контроли. По сравнению с Рис. 31, Рис. 32 показывает исходные данные флуоресценции, где присутствует истинная амплификация. В этом случае данные должны отбрасываться, а пробы тестироваться заново, так как это указывает на наличие контаминации. Рис. 29. Загрязнение ОК Рис. 30. Пример линейного роста флуоресценции в пробирке с ОК. Рис. 31. Исходная флуоресценция Рис.30. Рис. 32. Исходные данные флуоресценции, показывающие, что в пробирке с отрицательным контролем (ОК) амплификация происходит правильно. Анализ проб и положительного контроля На Рис. 33 и 34 показаны два примера амплификации проб. На Рис. 33 представлен анализ пробы с истинной амплификацией. Если анализ показывает такой тип сигмоидальной амплификационной кривой, то это истинная амплификация, и данные этого анализа могут быть использованы, при условии, что прошли положительный и внутренний контроли. На Рис. 34 показана линейная амплификация в реакции с пробой. При этих условиях должны проверяться исходные данные флуоресценции: соответствующий график исходной флуоресценции показан на Рис. 35, указывая, что линейный рост на Рис. 33 соответствует линейному росту исходной флуоресценции. При условии, что прошли положительный и внутренний контроли, могут быть получены результаты анализов для этих проб. Рис. 33. Истинная амплификация пробы в анализируемой группе. Рис. 34. Пример линейного роста флуоресценции в двух пробирках с пробами. Рис. 35. Исходная флуоресценция для графика Рис. 34. 1.3 Анализ проб на приборе Rotor-Gene Q с использованием программного обеспечения Rotor Gene серии 2.0.2 Используя программное обеспечение Rotor-Gene Q series (2.0.2), открыть соответствующий файл. Выделить пробы. Находясь на странице исходного канала для каждого детектируемого канала, щелкнуть “Options” («Возможности») и введите “Crop start cycles” («Урезать стартовые циклы»). На странице анализа для значения «Remove data before cycle» («Удалить данные перед циклом») введите 15 и щелкните «OK». Щелкнуть “Analyse” («Анализировать»). На странице анализа щелкнуть “Cycling A (from 15), Yellow” (Амплификация А (с 15), Желтый») для канала HEX. Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкнуть “Slope correct” («Корректировка наклона») и “Linear scale” («Линейное масштабирование»). Установить порог для канала Yellow 0.02 и отметьте значения CT. На странице анализа щелкнуть “Cycling A (from 15), Green” («Амплификация А (с 15), Зеленый») для канала FAM. Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкнуть “Slope correct” («Корректировка наклона») и “Linear scale” («Линейное масштабирование»). Установите порог для канала Green 0.075 и отметьте значения CT. Анализ проб: отрицательный контроль (ОК) и внутренний контроль 1. Определить значения CT для отрицательного контроля, чтобы удостовериться в отсутствии контаминации, дающей положительную амплификацию по каналу FAM - CT меньше 40. См. Приложение А. В пробирках с отрицательным контролем сигнал HEX для анализа внутреннего контроля должен давать положительный результат во всех 8 образцах (CT ≤37). Если в канале FAM есть положительная амплификация, а в канале HEX амплификация > 37, результаты должны быть исключены! 2. То же для всех других образцов. Необходимо проверить, чтобы в каждой пробирке для внутреннего контроля был сигнал в канале HEX. Возможно 3 варианта: Внутренний контроль дает положительный результат - можно продолжить анализ. Если внутренний контроль (HEX) оказался неудачным, но реакция по каналу FAM идет хорошо можно продолжить анализ, так как реакция по каналу FAM вытесняет реакцию внутреннего контроля. Если реакция в канале FAM и внутренний контроль (HEX) не прошли, данные должны быть отброшены, поскольку в реакционной смеси могли присутствовать ингибиторы, приведшие к ложноотрицательным результатам. Разведение пробы может снизить действие ингибиторов, но следует отметить, что ДНК также будет разбавлена. 3. Значение CT контроля должно быть выше 23 во избежание перегрузки анализа. Анализ образцов: положительный контроль 1. Вычислите значение ΔCT следующим образом, удостоверившись в том, что значения CT как мутации, так и контроля от одной и той же пробы: [мутационный CT] – [контрольный CT] = ΔCT Значения ΔCT положительного контроля EGFR (ПК) должны попадать в интервалы значений, приведенные в Таблице 4. Таблица 4. Ожидаемые значения ΔCT для положительного контроля (ПК) для программы Rotor-Gene Q (2.0.2) Анализ Значение ΔCT для положительного контроля (ПК) 790M от –2.88 до 3.01 Делеции от –6.71 до 4.16 L858R от –2.41 до 0.90 L861Q от –4.61 до 1.48 G719X от –2.89 до 1.03 S768I от –3.37 до 2.31 Инсерции от –2.93 до 1.28 Анализ проб: образцы пациентов 1. Вычислить значение ΔCT, убедившись, что значения CT для мутации и контроля от одной и той же пробы. См. Приложение А. [мутационный CT] – [контрольный CT] = ΔCT 2. Сравните значение ΔCT для пробы с точкой отсечения для каждой аналитической системы (Таблица 5), удостоверившись, что для каждого анализа применена правильная точка отсечения. Точка отсечения расположена выше точки, в которой положительный сигнал мог быть благодаря фоновому сигналу праймера ARMS для ДНК дикого типа. Если значение ΔCT пробы выше точки отсечения, оно классифицируется как отрицательное или за пределами чувствительности набора. Если значение ΔCT для пробы ниже точки отсечения, оно классифицируется как положительное для мутации, выявленной этим анализом. См. Приложение А. Таблица 5. Значения точки отсечения для программы Rotor-Gene Q (2.0.2). Анализ Усеченное значение ΔCT 790M 6.38 Делеции 9.06 L858R 8.58 L861Q 9.26 G719X 9.31 S768I 9.26 Инсерции 7.91 Приложение В: Дополнительная информация о мутациях Номера COSMIC взяты из Каталога соматических мутаций при раке (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Таблица 6. Перечень мутаций и номера по COSMIC Анализ Экзон Замена основания Номер по COSMIC 790M 20 2369C>T 6240 L858R 21 2573T>G 6224 L861Q 21 2582T>A 6213 S768I 20 2303G>T 6241 G719A 18 2156G>C 6239 G719S 18 2155G>A 6252 G719C 18 2155G>T 6253 Инсерции 20 2307_2308ins9 2319_2320insCAC 2310_2311insGGT 12376 12377 12378 Делеции 19 2235_2249del15 2235_2252>AAT (комплексная) 2236_2253del18 2237_2251del15 2237_2254del18 2237_2255>T (комплексная) 2236_2250del15 2238_2255del18 2238_2248>GC (комплексная) 2238_2252>GCA (комплексная) 2239_2247del9 2239_2253del15 2239_2256del18 2239_2248TTAAGAGAAG>C (комплексная) 2239_2258>CA (комплексная) 2240_2251del12 2240_2257del18 2240_2254del15 2239_2251>C (комплексная) 6223 13551 12728 12678 12367 12384 6225 6220 12422 12419 6218 6254 6255 12382 12387 6210 12370 12369 12383

Похожие:

	Инструкция по применению Наборы реагентов для определения соматических... Набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене braf «braf rgq pcr kit (24)»		Методические рекомендации по применению наборов реагентов для выявления... Проведение амплификации, анализ и учет результатов при помощи приборов rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) и Rotor-Gene...
	Прайс-лист наборы реагентов для пцр-диагностики Оборудование и расходные материалы Обращаем Ваше внимание на то, что наборы реагентов для диагностики урогенитальных инфекций в качественном frt/fep формате и папилломавирусной...		Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований «in vitro», а также для культивирования туляремийного микроба для научных работ
	Инструкция по применению набора реагентов для определения тромбинового времени Набор предназначен для определения тромбинового времени при диагностике нарушений конечного этапа свертывания крови		Цкп «Генетический полиморфизм» обн ран Разработка тест-систем для определения пола и идентификации особей амурских тигров по любому биологическому материалу методом пцр...
	Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований Питательная среда предназначена для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным...		Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических... Агар Клиглера-грм» предназначен для бактериологических исследований в санитарной и клинической микробиологии с целью идентификации...
	Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллёза сухой...		Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения тироксина Набор реагентов «Тироидифа-тироксин-01» предназначен для количественного определения концентрации тироксина в сыворотке крови человека...
	Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения свободного тироксина Набор реагентов Тироидифа-свободныйТ4 предназначен для количественного определения содержания свободного тироксина (Т4) в сыворотке...		Инструкция по применению набора реагентов для выявления генов металло--лактамаз... Внутренний контрольный образец для наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
	Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения... Рекомендована Комиссией по наборам реагентов для иммуноферментного (неинфекционные), радиоиммунологического и других видов иммунохимического...		Документация об открытом аукционе в электронной форме на поставку... ...
	Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований «грм-агар» предназначен для культивирования различных микроорганизмов, таких как: энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки,...		Инструкция по применению набора реагентов для определения активности... Набор реагентов «щф-uts» предназначен для определения активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке или плазме крови человека в...