Инструкция по применению наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием пцр в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией hrm
|
Скачать 406.24 Kb.
|
|
1.3.Оборудование и реактивы, приобретаемые отдельно При работе с реактивами всегда надевайте лабораторный халат, одноразовые перчатки и защитные очки. За дополнительными сведениями обращайтесь к соответствующим паспортам безопасности (MSDS), имеющимся у поставщика продукта. Набор для выделения ДНК (см. «Выделение ДНК») Специальные регулируемые дозаторы для приготовления реакционной смеси для ПЦР Специальные регулируемые дозаторы для добавления геномной ДНК* Стерильные наконечники с фильтрами для пипеток Настольная центрифуга* с ротором для 2-мл реакционных пробирок Прибор Rotor-Gene Q 5plex HRM* с каналами флуоресценции Green и Yellow Программное обеспечение для Rotor-Gene Q версия 2.0.2 Стрипованные пробирки и крышки, 0,1 мл, для использования с 72-гнездным ротором (№ по каталогу 981103 или 981106) Стерильные микроцентрифужные пробирки для приготовления реакционных смесей * Все приборы должны быть поверены и откалиброваны в соответствии с рекомендациями производителя.
Пользователь должен всегда обращать внимание на следующее: Использовать стерильные наконечники с фильтрами для дозаторов и следить за тем, чтобы дозаторы были откалиброваны в соответствии с инструкциями производителя. Хранить образцы, положительные контроли и экстрагированную из образцов ДНК отдельно от других реактивов. Добавлять в реакционную смесь контроли и экстрагированную из образцов ДНК на отдельном рабочем участке. Перед началом анализа разморозить все компоненты при комнатной температуре (15–25°C). После размораживания перемешать компоненты (переворачивая каждую пробирку по 10 раз) и затем кратковременно центрифугировать. Необходимо проявлять осторожность во избежание загрязнения ПЦР-смеси синтетическим контрольным материалом. Рекомендуется использовать отдельные дозаторы, специально предназначенные для приготовления реакционных смесей и добавления матричной ДНК. Приготовление и раскапывание реакционных смесей должно производиться в отдельном помещении, в котором не производится раскапывание образцов. Пробирки Rotor-Gene Q не должны открываться по окончании ПЦР-анализа.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» состоит из восьми аналитических систем: - Одна контрольная (Ctrl) система; - Семь мутационных систем для анализа мутаций. Все реакционные смеси содержат внутреннюю контрольную пробу (внутренний контроль), помеченную HEX™. Это контроль наличия ингибиторов в пробе, присутствие которых могут привести к ложноотрицательным результатам. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» имеет оптимальный состав и концентрацию. Не рекомендуется дальнейшее разведение реагентов, поскольку это может привести к потере производительности. Не рекомендуется ставить реакции, объемом менее 25 мкл, поскольку это может повысить риск ложноотрицательных результатов. Все реактивы, поставляемые в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» предназначены для использования только в том же наборе. Для поддержания оптимальной производительности реактивы в наборе не должны замещаться. Используйте только Taq ДНК-полимеразу (Taq), которая поставляется в наборе. Не замещайте ее Taq ДНК-полимеразой (Taq) из других наборов того же или иного типа или Taq ДНК-полимеразой (Taq) от других поставщиков. Контрольная проба Контрольная проба (Ctrl), помеченная FAM™, используется для определения суммарной ДНК в пробе. В контрольной пробе амплифицируется участок экзона 2 гена EGFR. Праймер и зонд подобраны таким образом, чтобы избежать любых известных полиморфизмов EGFR.. Мутационные анализы Каждая мутационная проба, помеченная FAM, содержит один зонд Scorpion плюс праймеры для различения дикой и мутантной ДНК. Мутантная ДНК выявляется методом ПЦР в реальном времени.
Со всем и пробами следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом. Материалом для анализа должна быть геномная ДНК человека, выделенная из фиксированных формалином и залитых в парафин проб опухолей немелкоклеточного рака легких. Образцы должны транспортироваться в соответствии со стандартными требованиями работы с патологическим материалом, обеспечивающим качество образцов. Опухолевые образцы негомогенны, срезы из одного образца опухоли могут не соответствовать срезам той же опухоли. Опухолевые пробы могут также содержать неопухолевую ткань. ДНК неопухолевой ткани не должны содержать мутации EGFR, выявляемые набором «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)».
Для выделения геномной ДНК из фиксированных формалином и залитых в парафин образцов опухолей немелкоклеточного рака легких рекомендуется использовать набор реагентов QIAamp® DNA FFPE (QIAGEN, кат.№ 56404). Выделение геномной ДНК проводить согласно инструкции к набору реагентов QIAamp® DNA FFPE: - Поместить срезы, фиксированные формалином и залитые в парафин, на покровные стекла; - удалить избыток парафина вокруг срезов ткани, используя свежий стерильный скальпель; - срезы тканей перенести в микроцентрифужные пробирки, используя свежий скальпель для каждой пробы, предназначенной для выделения ДНК; - добавить протеиназу К (протеолиз в течение 1 часа); - очищенную геномную ДНК растворить в 50 - 200 мкл буфера ATE (входит в состав набора реагентов QIAamp® DNA FFPE). Очищенную геномную ДНК хранить при температуре минус 15–30°C. 1.8. Внутренние контроли. Определение количества ДНК в пробе должно основываться на ПЦР и может отличаться от количественного определения, основанного на значениях поглощения. Смесь для дополнительной контрольной реакции (Ctrl) поставляется для определения качества и количества ДНК в пробах перед анализом с использованием набора реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)». Все пробы в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» генерируют короткие продукты ПЦР. Набор реагентов не подходит для работы с тяжелыми фрагментами ДНК. Все аналитические системы содержат внутренний контроль (см. «Анализ данных»). Если контроли оказываются неудачными, данные следует автоматически отбросить, поскольку присутствовавшие ингибиторы могли привести к ложноотрицательным результатам. Разведение пробы может снизить действие ингибиторов, однако следует отметить, что это также разбавит ДНК. Все экспериментальные анализы должны содержать контроли. 1.9. Внутренний контроль суммарной ДНК в пробе. Рекомендуется применение дополнительной контрольной реакционной смеси (Ctrl), поставляемой с набором реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» для определения суммарной ДНК в пробе. В контрольном анализе амплифицируется участок экзона 2 гена EGFR. Мы рекомендуем постановку проб только с контрольной пробой, используя положительный контроль EGFR (ПК) в качестве положительного контроля и воду (H2O) в качестве отрицательного контроля (ОК). Для оптимального использования реактивов в наборе для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» пробы следует обрабатывать партиями. Если пробы тестируются индивидуально, это требует большего количества реактивов и снижает количество проб, которые можно протестировать данным набором. 1.10. Анализ данных При проведении анализов в режиме реального времени с помощью праймеров Scorpions используется количество циклов ПЦР, необходимое для выявления флуоресцентного сигнала выше фонового в качестве меры молекул-мишеней, присутствующих в начале реакции. Точка, в которой сигнал получается выше фоновой флуоресценции, называется пороговым циклом (CT). Значения ∆CT пробы вычисляются как разница между значением CT для мутации и значением CT для контрольного измерения от той же пробы. Пробы классифицируются как положительные (наличие мутации), если они дают ∆CT меньше, чем вычисленное значение ∆CT для данной анализируемой пробы. Если значение ∆CT выше, то проба либо содержит очень низкий процент мутантной ДНК, которая не может быть обнаружена с помощью данного набора (за аналитическим пределом), либо проба отрицательна по мутациям. Значения CT для мутаций, равные 40 или выше будут считаться отрицательными или находящимися за пределами чувствительности набора. При использовании праймеров ARMS может происходить некоторое неэффективное праймирование, давая запоздалый фоновый CT от ДНК, не содержащей мутации. Все значения ∆CT, рассчитанные от фоновой амплификации, будут выше вычисленных значений ∆CT, проба оценивается как отрицательная по мутациям. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» предназначен для использования на приборе для амплификации в реальном времени QIAGEN Rotor-Gene Q 72-луночного формата. 1.11. Протоколы Протокол 1: Оценка проб Определение суммарной ДНК в пробах Перед началом работы прочтите «Важные замечания». Перед тем, как начать работу по протоколу ознакомьтесь с инструкцией к прибору Rotor-Gene Q. Действия перед началом работы: Перед каждым применением все реактивы должны быть полностью разморожены, перемешаны (переворачивать 10 раз) и кратковременно центрифугированы. Перед каждым применением необходимо убедиться, что Taq ДНК-полимераза находится при комнатной температуре (15–25°C). Кратковременно центрифугировать пробирку для того, чтобы собрать фермент на дно пробирки. Ход работы 1. Разморозить контрольную реакционную смесь (Ctrl) и положительный контроль (ПК) EGFR при комнатной температуре (15–25°C). Когда контрольная реакционная смесь (Ctrl) и положительный контроль (ПК) EGFR растают, перемешать их, переворачивая каждую пробирку 10 раз во избежание локализованного скопления солей. 2. Приготовить достаточное количество реакционных смесей (контрольная реакционная смесь (Ctrl) плюс Taq ДНК-полимераза (Taq)) для ДНК образцов, для одного положительного контроля и одного отрицательного контроля (ОК) в соответствии с объемами, приведенными в Таблице 1. Добавить в расчет реактивы для 1 дополнительной пробы. Реакционная смесь содержит все компоненты, необходимые для ПЦР за исключением образца. Не перемешивать Taq ДНК-полимеразу (Taq) на вортексе, так как это может инактивировать фермент. Убедиться, что Taq ДНК-полимераза перед использованием находится при комнатной температуре. Кратковременно центрифугировать пробирку с Taq ДНК-полимеразой. Убедиться, что весь фермент находится на дне пробирки. Пипеткой отобрать ДНК-полимеразу (Taq), размещая наконечник пипетки прямо под поверхностью жидкости во избежание обволакивания наконечника избыточным ферментом. Таблица 1. Приготовление контрольной реакционной смеси
* При приготовлении реакционной смеси готовить так, чтобы хватило еще на 1 пробу. 3. Аккуратно перемешать реакционную смесь пипетированием. Сразу же добавить по 20 мкл реакционной смеси в каждую пробирку Rotor-Gene. 4. В пробирки немедленно добавить по 5 мкл образца, EGFR-положительного контроля (ПК) и воды, свободной от нуклеаз (H2O) для отрицательного контроля (ОК). 5. Закрыть пробирки и разместить их в диске Rotor-Disc™ в соответствующих положениях. Если ротор загружен неравномерно, необходимо уравновесить его дополнительными пустыми пробирками Rotor-Gene Q. После переноса пробирок в ротор рекомендуется визуально проверить, все ли пробирки содержат одинаковый объем. 6. Установить диск Rotor-Disc в прибор Rotor-Gene Q. Проследить, чтобы запирающее кольцо прибора Rotor-Gene Q размещалось на верхней части ротора для предотвращения случайного открывания пробирок при анализе. 7. Для оценки проб создать температурный профиль в соответствии со следующими этапами.
Все спецификации относятся к программному обеспечению Rotor-Gene Q версии 2.0.2. Подробные сведения по программированию приборов Rotor-Gene Q смотреть в руководстве по применению прибора. На иллюстрациях установки обведены толстыми черными рамками. Иллюстрации показаны для прибора Rotor-Gene Q. 8. Дважды щелкнуть значок программы Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2. На рабочем столе компьютера, присоединенного к прибору Rotor-Gene Q, выбрать вкладку “Advanced” («Усложненный») в появившемся диалоговом окне “New Run” («Новый анализ»). 9. Для создания нового шаблона выберать “Empty Run” («Холостой запуск»), а затем нажать “New” («Новый»), чтобы ввести “New Run Wizard” («Мастер нового запуска»). 10. Выбрать 72-Well Rotor (72-гнездный ротор) в качестве типа ротора. Отметить, что запирающее кольцо присоединено. Поставить галочку в квадрате “Locking Ring Attached” («Запирающее кольцо присоединено») и нажать “Next” («Далее») (Рис. 1).  Рис. 1. Диалоговое окно «Мастер нового запуска. 11. Ввести имя оператора, объем реакции - 25 мкл и дополнительные примечания. Щелкнуть “Next” (Рис. 2).  Рис. 2. Установка общих параметров анализа. 12. Щелкнуть кнопку “Edit Profile” («Редактировать профиль») в следующем диалоговом окне “New Run Wizard” (Рис. 3) и запрограммировать температурный профиль в соответствии с информацией на следующих этапах.  Рис. 3. Редактирование профиля 13. Щелкнуть кнопку “Insert after” («Ввести после») и выбрать “New Hold at Temperature” («Новая выдержка при температуре») (Рис. 4). Щелкнуть “60”, чтобы изменить температуру на 95°C.  Рис. 4. Первоначальный этап инкубации при 95°C. 14. Щелкнуть “60°C” и изменить “Hold Temperature” («Температура выдержки») на 95°C, щелкнуть “1” для замены “Hold Time” («Время выдержки») на 15 мин. Щелкнуть кнопку “Insert After” («Ввести после»), а затем выберать “New Cycling” («Новое циклирование») (Рис. 5).  Рис. 5. Начальный этап инкубации при 95°C. 15. Установить число циклов на 40, нажав число. Выбрать “95°C на 20 секунд”. Установить время “30 secs” («30 с») (Рис. 6).  Рис. 6. Этап амплификации при 95°C. 16. Выделить следующую позицию “60°C for 20 secs”. Установить время 60 секунд. Выберать кнопку “Not Acquiring” («Не запрашивать») (Рис. 7).  Рис. 7. Этап амплификации при 60°C. 17. В панели “Available Channels” («Доступные каналы») выбрать каналы каналы “Yellow” («Желтый») и “Green” («Зеленый»), подсвечивая их, а затем нажмите “>”, чтобы перенести их в панель “Acquiring Channels” («Запрашиваемые каналы») (Рис. 8).  Рис. 8. Запрос на этапе амплификации при 60°C 18. Поставить подсветку на “72°C for 20 secs” и удалить этот раздел, затем нажать “OK” (Рис. 9).  Рис. 9. Этап устранения элонгации. 19. Щелкнуть кнопку “Gain Optimisation” («Оптимизация результатов») (Рис. 10).  Рис. 10. Оптимизация результатов. 20. Выберать кнопку “Optimise Acquiring” («Оптимизировать запрос»), а затем щелкнуть “OK” для зеленого и желтого каналов (Рис. 11 и 12).  Рис. 11. Оптимизация автоматического получения результатов с зеленого канала.  Рис. 12. Оптимизация автоматического получения результатов для желтого канала. 21. Поставить галочку напротив “Perform Optimisation before 1st Acquisition”, («Провести оптимизацию перед 1-м сбором данных»), а затем щелкнуть кнопку “Close” («Закрыть»), чтобы вернуться к Мастеру настройки (Рис. 13).  Рис. 13. Выбор по зеленому и желтому каналам. 22. Щелкните “Next” для сохранения шаблона, выберите “Save Template” («Сохранить шаблон»), а затем сохраните шаблон в папку шаблонов. 23. Проверьте программирование и затем щелкните “Start Run” («Запустить анализ») для сохранения файла анализа и его запуска (Рис. 14).  Рис. 14. Запуск анализа. 24. После запуска анализа появляется новое окно, в котором можно или ввести названия проб, или щелкнуть “Finish” («Закончить») и ввести названия проб позже. 25. Сохранить все данные в соответствующей папке. 26. По окончании анализа проанализировать данные. 27. Определить значения CT отрицательного контроля (ОК) для того, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения - положительная амплификация в канале FAM (CT меньше 40) или возможные на проблемы с постановкой – не прошел внутренний контроль в канале HEX (без CT). Положительный контроль EGFR (ПК) должен давать контрольные значения CT по каналу FAM между 26.26 и 30.95. Подробнее об анализе данных см. в Приложении А. |
|||||||||||||||||||
Похожие:
 |
Инструкция по применению Наборы реагентов для определения соматических... Набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене braf «braf rgq pcr kit (24)» |
|
Методические рекомендации по применению наборов реагентов для выявления... Проведение амплификации, анализ и учет результатов при помощи приборов rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) и Rotor-Gene... |
|
Прайс-лист наборы реагентов для пцр-диагностики Оборудование и расходные материалы Обращаем Ваше внимание на то, что наборы реагентов для диагностики урогенитальных инфекций в качественном frt/fep формате и папилломавирусной... |
|
Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований «in vitro», а также для культивирования туляремийного микроба для научных работ |
|
Инструкция по применению набора реагентов для определения тромбинового времени Набор предназначен для определения тромбинового времени при диагностике нарушений конечного этапа свертывания крови |
|
Цкп «Генетический полиморфизм» обн ран Разработка тест-систем для определения пола и идентификации особей амурских тигров по любому биологическому материалу методом пцр... |
|
Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований Питательная среда предназначена для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным... |
|
Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических... Агар Клиглера-грм» предназначен для бактериологических исследований в санитарной и клинической микробиологии с целью идентификации... |
|
Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллёза сухой... |
 |
Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения тироксина Набор реагентов «Тироидифа-тироксин-01» предназначен для количественного определения концентрации тироксина в сыворотке крови человека... |
|
Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения свободного тироксина Набор реагентов Тироидифа-свободныйТ4 предназначен для количественного определения содержания свободного тироксина (Т4) в сыворотке... |
|
Инструкция по применению набора реагентов для выявления генов металло--лактамаз... Внутренний контрольный образец для наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией |
|
Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения... Рекомендована Комиссией по наборам реагентов для иммуноферментного (неинфекционные), радиоиммунологического и других видов иммунохимического... |
|
Документация об открытом аукционе в электронной форме на поставку... ... |
|
Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований «грм-агар» предназначен для культивирования различных микроорганизмов, таких как: энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки,... |
|
Инструкция по применению набора реагентов для определения активности... Набор реагентов «щф-uts» предназначен для определения активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке или плазме крови человека в... |