«УТВЕРЖДАЮ»
Зам. руководителя Департамента государственного
контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ
________________________ Д.В. Рейхарт
«23» мая 2001 г.
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО ТРИЙОДТИРОНИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
(ИФА-ТТ3-1)
Рекомендована Комиссией по наборам реагентов для иммуноферментного (неинфекционные), радиоиммунологического и других видов иммунохимического анализа Комитета по новой медицинской технике Минздрава РФ (протокол № 4 от 16 апреля 2001 г.).
Взамен инструкции, утвержденной Минздравом РФ 24 марта 1997 г.
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Набор ИФА-ТТ3-1 предназначен для количественного определения концентрации общего трийодтиронина (Т3) в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Набор рассчитан на проведение анализа в дубликатах 41 неизвестного образца, 6 калибровочных проб и 1 пробы контрольной сыворотки, всего 96 определений.
Количественное определение трийодтиронина в сыворотке крови человека может быть использовано для оценки функционального состояния щитовидной железы.
2. ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА
Принцип метода определения основан на конкуренции трийодтиронина из измеряемой пробы и трийодтиронина, меченного пероксидазой, за центры связывания специфичных к трийодтиронину антител, иммобилизованных на поверхности лунок полистиролового планшета. Количество связавшегося конъюгата выявляют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Интенсивность окраски продуктов ферментативной реакции обратно пропорциональна концентрации трийодтиронина, содержащегося в анализируемом образце.
3. СОСТАВ НАБОРА
В состав набора входят:
- планшет 96-луночный полистироловый, стрипованный, покрытый поликлональными антителами к трийодтиронину - 1 шт.;
- калибровочные пробы на основе буферного раствора, содержащего компоненты крови, содержащие известные количества трийодтиронина: 0; 0,5; 1,5; 3,0; 6,0; 12,0 нмоль/л; концентрации трийодтиронина в калибровочных пробах могут незначительно изменяться от серии к серии, точные значения концентраций указаны на этикетках флаконов, готовые для использования – 6 фл. (по 0,5 мл);
Калибровочные пробы приготовлены добавлением в буферный раствор, содержащий компоненты крови, рассчитанного количества химически чистого трийодтиронина производства фирмы SIGMA (США).
- контрольная сыворотка на основе сыворотки крови человека с известным содержанием трийодтиронина, готовая для использования - 1 фл. (0,5 мл);
- конъюгат трийодтиронина с пероксидазой из корня хрена, готовый для использования - 1 фл. (12,5 мл);
- фосфатно-солевой буферный раствор с добавлением твин-20, рН 7,0+0,5, концентрированный - 1 фл. (15 мл);
- раствор субстрата на основе тетраметилбензидина (ТМБ) с добавлением перекиси водорода, готовый для использования - 1 фл. (12,5 мл);
- стоп-реагент, готовый для использования - 1 фл. (15 мл);
- пленка для заклеивания планшета - 1 шт.
4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Специфичность. Использование высокоаффинных антител к трийодтиронину обеспечивает высокую специфичность анализа. Процент перекрестной реакции с L-тироксином (Т4) составляет 0,6 %.
Чувствительность. Минимальная концентрация общего трийодтиронина, определяемая с помощью набора, составляет не более 0,15 нмоль/л.
Воспроизводимость результатов. Коэффициент вариации результатов определения содержания трийодтиронина в одном и том же образце сыворотки крови не превышает 8 %.
Тест на открытие. Процент открытия составляет 90 – 110 %.
Линейность. Линейность определения в диапазоне концентраций 0,5-12 нмоль/л составляет 90 – 110 %.
Клиническая проверка набора. При определении концентрации трийодтиронина с помощью набора ИФА-ТТ3 в сыворотке крови, взятой с 9 до 11 часов у 195 здоровых лиц в возрасте от 20 до 50 лет, концентрация гормона составила 1,0 – 3,0 нмоль/л.
Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора уточнить значения концентраций трийодтиронина, соответствующие нормальным для обследуемого контингента.
5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Потенциальный риск применения набора - класс 2а.
Все компоненты набора, за исключением стоп-реагента, в используемых концентрациях являются нетоксичными.
Стоп-реагент действует на кожу и слизистые прижигающим образом, вызывая раздражение и ожоги, поэтому в случае попадания на кожные или слизистые покровы его следует немедленно тщательно смыть большим количеством проточной воды.
При работе с набором и утилизации отходов следует соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва, 1981 г.).
При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита и другие возбудители вирусных инфекций.
6. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ
- Фотометр вертикального сканирования одно- или многоканальный, позволяющий измерять оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 450 нм;
- термостат суховоздушный, поддерживающий температуру +(37+1)оС;
- пипетки полуавтоматические одноканальные с переменным объемом со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 2-20 мкл, 200-1000 мкл;
- пипетка полуавтоматическая многоканальная с переменным объемом со сменными наконечниками, позволяющая отбирать объем жидкости 50-250 мкл;
- секундомер;
- шейкер;
- пакет полиэтиленовый;
- стаканы химические или колбы мерные вместимостью 300 мл;
- бумага фильтровальная;
- вода дистиллированная;
- перчатки резиновые или пластиковые.
7. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре +(20-25 о С) не менее 30 минут
7.1. Приготовление рабочего раствора фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР).
Содержимое одного флакона с концентратом фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР) перенести в мерный стакан вместимостью 300 мл, дважды ополоснуть флакон дистиллированной водой, все промывные воды объединить с разведенным ФСБР и довести общий объем раствора до 300 мл дистиллированной водой.
Полученный рабочий раствор ФСБР можно хранить не более 7 дней при температуре +2-8оС.
Примечание. При хранении ФСБР могут образовываться кристаллы, поэтому перед отбором аликвоты ФСБР необходимо слабо подогреть флакон с буферным раствором, поместив его в водяную баню или термостат на температуру +37оС до полного растворения кристаллов.
8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Внесение реагентов следует проводить согласно схеме на рис. 1.
8.1. Вставить в свободную рамку необходимое количество лунок для калибровочных проб, исследуемых образцов и контрольной сыворотки для постановки в дубликатах. Неиспользуемые стрипы необходимо тщательно заклеить пленкой для заклеивания планшетов и хранить в упаковке при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности набора.
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
A
|
КП1
|
КП1
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
B
|
КП2
|
КП2
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
C
|
КП3
|
КП3
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
D
|
КП4
|
КП4
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
E
|
КП5
|
КП5
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
F
|
КП6
|
КП6
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
G
|
КС
|
КС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
H
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
ИС
|
Рис. 1. Схема заполнения лунок планшета.
8.2. В два ряда лунок планшета внести в дубликатах по 0,02 мл калибровочных проб (КП), начиная с минимальной концентрации.
8.3. Внести в две лунки планшета по 0,02 мл контрольной сыворотки (КС).
8.4. В оставшиеся лунки внести в дубликатах по 0,02 мл исследуемых образцов сывороток крови (ИС).
8.5. Во все лунки планшета внести по 0,1 мл конъюгата. Конъюгат вносить в лунки планшета в той же последовательности, что и калибровочные пробы, контрольную сыворотку и исследуемые образцы. Процедуру внесения следует выполнять как можно быстрее. Продолжительность операции не должна превышать 15 минут.
8.6. Тщательно перемешать содержимое лунок, встряхивая планшет на шейкере при комнатной температуре (+20-25оС) в течение 2-3 минут.
8.7. Заклеить планшет пленкой для заклеивания планшетов (либо закрыть его крышкой и поместить в полиэтиленовый пакет, плотно закрыв пакет). Инкубировать в термостате при температуре +37оС в течение 1 часа, избегая попадания прямого солнечного света
8.8. По окончании инкубации удалить содержимое лунок планшета декантированием и затем отмыть планшет. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,25 мл рабочего раствора ФСБР (см. п. 7.1.), встряхнуть 1 минуту на шейкере, после чего удалить его содержимое декантированием. Процедуру повторить еще 2 раза. При автоматической промывке необходимо вручную удалить содержимое лунок планшета, только после этого приступить к отмывке с помощью прибора, внося в каждую лунку планшета 300–350 мкл рабочего раствора ФСБР. По окончании промывки тщательно удалить остатки жидкости из лунок, несколько раз резко вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.
8.9. Во все лунки планшета внести по 0,1 мл раствора субстрата в той же последовательности, что и конъюгат. Инкубировать планшет в течение 10-15 минут при температуре +37оС в темном месте.
8.10. Внести во все лунки планшета с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата, по 0,1 мл стоп-реагента и тщательно перемешать содержимое лунок на шейкере при комнатной температуре в течение 1 минуты.
8.11. Измерить оптическую плотность в лунках планшета при длине волны 450 нм. Процедура измерения оптической плотности не должна превышать 15 мин.
9. РАСЧЕТЫ
Построение калибровочной кривой необходимо проводить для каждого независимого эксперимента.
9.1. Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности от концентрации трийодтиронина в калибровочных пробах. Образец калибровочной кривой приведен на рис. 2.
9.2. Рассчитать средние арифметические значения показателей оптической плотности контрольной сыворотки и исследуемых образцов и по калибровочной кривой определить в них концентрацию трийодтиронина.
9.3. При построении калибровочной кривой и определении содержания общего трийодтиронина в исследуемых образцах с помощью автоматического анализатора иммуноферментных реакций рекомендуется использовать кусочно-линейный метод аппроксимации.
 
Рис.2. Типичный калибровочный график, полученный с
помощью набора реагентов ИФА-ТТ3-1.
10. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
10.1. Набор реагентов ИФА-ТТ3-1 должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности - 12 месяцев. Допускается хранение набора при температуре до +25оС не более 5 суток.
10.2. Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре (+20-25оС) не менее 30 минут.
10.3. Калибровочные пробы, контрольную сыворотку и конъюгат после вскрытия флаконов можно хранить при температуре +(2-8)оС не более 2 месяцев, остальные компоненты набора – в течение всего срока годности.
10.4. Рабочий раствор ФСБР можно хранить при температуре +(2-8)оС в закрытой емкости не более 7 дней.
10.5. В случае дробного использования набора реагентов ИФА-ТТ3 построение калибровочной кривой необходимо проводить для каждого независимого эксперимента, а также рекомендуется определение концентрации Т3 в контрольной сыворотке.
10.6. До проведения анализа возможно хранение образцов сывороток крови в течение 3 дней при температуре +(2-8)оС или в замороженном состоянии при температуре минус 20оС в течение 2 месяцев.
Допускается только однократное замораживание и размораживание образцов сывороток крови.
10.7. Исключается использование для анализа гемолизированных и мутных образцов сывороток крови.
10.8. Для отбора и добавления реагентов необходимо использовать полуавтоматические пипетки со сменными наконечниками, аттестованные на точность по значению средней дозы и воспроизводимость результатов пипетирования.
10.9. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
10.10. Не допускается использование стоп-реагента из наборов, производимых другими фирмами.
По вопросам, касающимся качества набора ИФА-ТТ3, следует обращаться в ЗАО «НВО Иммунотех». Почтовый адрес: 119991, Москва, Ленинские Горы, МГУ, д. 1, строение 11А, тел. 939-46-83, факс 932-88-96; электронный адрес: support@immunotek.ru; http://www.immunotek.ru;
и в Институт государственного контроля лекарственных средств НЦ ЭГКЛС МЗ РФ по адресу: 117246, Москва, Научный проезд, д.14а, тел. 120-60-95, 120-60-96.
|
