Инструкция по применению наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием пцр в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией hrm

Данные анализа не должны использоваться, если хотя бы один из двух контролей оказался неудачным! Значение контроля проб CT между 30.69 и 37: Результаты следует интерпретировать с осторожностью, так как очень низкий уровень мутаций может не обнаруживаться. Значение контроля проб CT между 37 и 40: В таких пробах присутствует лишь несколько пригодных к амплификации копий ДНК, и мутации можно увидеть, если большинство из них содержат мутацию. Если проба дает позднее значение CT для контроля, внутренний контроль пробы CT должен сравниваться с внутренним отрицательным контролем (ОК без матрицы). Если внутренний контроль пробы выходит на поздних циклах или отрицательный по сравнению с ОК (без матрицы), возможно, происходит ингибирование реакции. Действие ингибитора можно уменьшить разведением пробы, однако, это также разбавит ДНК. Разведение пробы: Если при контроле количества ДНК в пробах CT <23, необходимо разбавить ДНК из образцов. Концентрированные пробы должны разбавляться так, чтобы быть >23, но <30.69. Разбавление в два раза увеличит CT на 1 цикл! Протокол 2: Выявление мутаций в гене EGFR и анализ данных. Выявление мутаций EGFR и анализ данных. Для эффективного применения набора реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)», пробы должны быть собраны в группы по 7 (для заполнения 72-гнездного ротора). При проведении анализа с меньшим количеством образцов, одним набором можно будет протестировать меньшее число проб. Для каждой пробы ДНК в одном и том же ПЦР - анализе должны ставиться контроль и проба на мутации во избежание вариаций от анализа к анализу. Действия перед началом работы: Перед каждым применением все реактивы должны быть полностью разморожены, перемешаны (переворачивать пробирки 10 раз) и кратковременно центрифугированы. Перед каждым применением убедитесь, что Taq ДНК-полимераза находится при комнатной температуре (15–25°C). Кратковременно центрифугировать пробирку, чтобы собрать фермент на дне пробирки. Ход работы 1. Разморозить реакционные смеси и положительный контроль EGFR (ПК) при комнатной температуре (15–25°C). Когда реакционные смеси и положительный контроль EGFR (ПК) растают, перемешать их, переворачивая каждую пробирку 10 раз во избежание локального концентрирования солей. 2. Приготовить достаточное количество реакционных смесей (контрольная реакционная смесь (Ctrl) плюс Taq ДНК-полимераза (Taq)) для проб ДНК, одна реакция положительного контроля и одна реакция отрицательного контроля без матрицы (ОК) в соответствии с объемами, приведенными в Таблице 2. Расчет количества реагентов проводить с учетом 1 дополнительной пробы (берется на ошибку пипетирования). Реакционная смесь содержит все компоненты, необходимые для ПЦР за исключением пробы. Не встряхивать Taq ДНК-полимеразу (Taq), так как это может инактивировать фермент. Убедитесь, что Taq ДНК-полимераза перед использованием находится при комнатной температуре. Кратковременно центрифугировать флакон для того, чтобы убедиться, что весь фермент находится у дна пробирки. Отобрать пипеткой ДНК-полимеразу (Taq), размещая наконечник пипетки прямо под поверхностью жидкости во избежание обволакивания наконечника избытком фермента. Обязательно ставить реакции в правильном порядке. Таблица 2. Приготовление реакционной смеси для контроля Реакционная смесь (мастер микс) Анализ Контрольная реакционная смесь (Ctrl)* Taq ДНК-полимераза (Taq)* Контрольный анализ 19.5 мкл 0.5 мкл Анализ мутаций 19.5 мкл 0.5 мкл * При приготовлении реакционной смеси готовить на 1 пробу больше. 3. Аккуратно перемешать реакционную смесь пипетированием. Сразу же добавить по 20 мкл реакционной смеси в каждую пробирку Rotor-Gene. 4. Добавить по 5 мкл пробы, EGFR-положительного контроля (ПК) и воды, свободной от нуклеаз (H2O) для ОК в каждую пробирку Rotor-Gene. Каждая проба ДНК должна сравниваться как с контролем, так и со всеми мутационными анализами. Схема раскапывания реагентов приведена в Таблице 3. Таблица 3. Расположение контрольных (Ctrl) и мутационных анализов Контроли Пробы ПК ОК 1 2 3 4 5 6 7 Ctrl 1 9 17 25 33 41 49 57 65 790M 2 10 18 26 34 42 50 58 66 Делеции 3 11 19 27 35 43 51 59 67 L858R 4 12 20 28 36 44 52 60 68 L861Q 5 13 21 29 37 45 52 61 69 G719X 6 14 22 30 38 46 54 61 70 S768I 7 15 23 31 39 47 55 63 71 Инсерции 8 16 24 32 40 48 56 64 72 5. Закрыть пробирки Rotor-Gene Q и разместить их в соответствующих положениях в роторном диске. Если ротор загружен неравномерно, уравновесить его дополнительными пустыми пробирками Rotor-Gene Q. 6. Сразу же поместить диск Rotor-Disc в прибор Rotor-Gene Q. Проследить, чтобы запирающее кольцо прибора Rotor-Gene Q размещалось на верхней части ротора для предотвращения случайного открывания пробирок при анализе. 7. Для оценки проб создать температурный профиль в соответствии со следующими этапами. Установка общих параметров анализа Рис. 15, 16, 17 Первоначальная активация фермента горячего старта Рис. 18 Амплификация ДНК Рис. 19 Подгонка флуоресцентных каналов Рис. 20, 21 Запуск анализа Рис. 22 Все спецификации относятся к программному обеспечению Rotor-Gene Q версии 2.0.2. Сведения по программированию приборов Rotor-Gene Q можно найти в руководстве по применению прибора. На иллюстрациях эти установки обведены толстыми черными рамками. Иллюстрации показаны для приборов Rotor-Gene Q. 8. Дважды щелкнуть значок программы Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2 на рабочем столе компьютера, присоединенного к прибору Rotor-Gene Q. Выбрать вкладку “Advanced” («Усложненный») в появившемся диалоговом окне “New Run” («Новый запуск»). 9. Для создания нового шаблона выбрать “Empty Run” («Холостой запуск»), а затем нажать “New” («Новый»), чтобы ввести “New Run Wizard” («Мастер нового запуска»). 10. Выбрать 72-Well Rotor (72-луночный ротор) в качестве типа ротора. Отметить, что запирающее кольцо присоединено. Поставить галочку в квадрате “Locking Ring Attached” («Запирающее кольцо присоединено») и нажать “Next” («Далее») (Рис. 15). Рис. 15. Диалоговое окно «Мастер нового запуска». 11. Ввести имя оператора, объем реакции - 25 мкл, дополнительные примечания. Щелкнуть “Next (Рис. 16). Рис. 16. Установка общих параметров анализа. 12. Щелкнуть кнопку “Edit Profile” («Редактировать профиль») в следующем диалоговом окне “New Run Wizard” (Рис. 17) и запрограммировать температурный профиль в соответствии с информацией на следующих этапах. Рис. 17. Редактирование профиля. 13. Щелкнуть кнопку “Insert after” («Ввести после») и выберите “New Hold at Temperature” («Новая выдержка при температуре») (Рис. 18). Щелкнуть “60”, чтобы изменить температуру на 95°C. Рис. 18. Начальный этап инкубации при 95°C. 14. Щелкнуть “60°C” и изменить “Hold Temperature” («Температура выдержки») на 95°C, щелкнуть “1” для установки “Hold Time” («Время выдержки») на 15 мин. Щелкнуть кнопку “Insert After” («Вести после»), а затем выбрать “New Cycling” («Новая амплификация») (Рис. 19). Рис. 19. Начальная инкубация при 95°C. 15. Установить число циклов на 40, нажав число. Выбрать “95°C на 20 секунд”. Установить время на 30 секунд (Рис. 20). Рис. 20. Этап амплификации при 95°C. 16. Переместить выделенный участок на “60°C” на 20 секунд. Установить время 60 секунд. Выбрать кнопку “Not Acquiring” («Не запрашивать») (Рис. 21). Рис. 21. Этап амплификации при 60°C. 17. В панели “Available Channels” («Доступные каналы»), подсвечивая, выбрать каналы “Yellow” («Желтый») и “Green” («Зеленый») для запроса, а затем нажать “>”, чтобы перенести их в панель “Acquiring Channels” («Запрашиваемые каналы») (Рис. 22). Рис. 22. Запрос на этапе 60°C. 18. Поставить подсветку на “72°C for 20 secs” и удалить этот раздел, затем нажать “OK” (Рис. 23). Рис. 23. Этап удаления расширения. 19. Щелкнуть кнопку “Gain Optimisation” («Оптимизация результатов») (Рис. 24). Рис. 24. Оптимизация результатов. 20. Выбрать кнопку “Optimise Acquiring” («Оптимизировать запрос»), а затем щелкнуть “OK” для зеленого и желтого каналов (Рис. 25 и 26). Рис. 25. Оптимизация автоматического получения результатов с зеленого канала. Рис. 26. Оптимизация автоматического получения результатов для желтого канала. 21. Поставить галочку напротив “Perform Optimisation before 1st Acquisition”, («Провести оптимизацию перед 1-м сбором данных»), а затем щелкнуть кнопку “Close” («Закрыть»), чтобы вернуться к Мастеру (Рис. 27). Рис. 27. Выбор зеленого и желтого каналов. 22. Щелкнуть “Next” для сохранения шаблона, выбрать “Save Template” («Сохранить шаблон»), а затем сохранить шаблон в папку шаблонов. 23. Проверить сводку и затем щелкнуть “Start Run” («Запустить анализ») для сохранения файла анализа и его запуска (Рис. 28). Рис. 28. Запуск анализа. 24. После запуска анализа появляется новое окно, в котором можно либо ввести название проб, либо щелкнуть “Finish” («Закончить»), а пробы ввести позже. 25. Сохранить все данные в соответствующей папке. 26. По окончании анализа проанализировать данные. Информацию об анализе данных см. в Приложении A. Руководство по устранению неисправностей Руководство по устранению неполадок может помочь в решении проблем, которые могут возникнуть. Подробнее см. также страницу «Часто задаваемые вопросы» в Центре технической поддержки: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx. Комментарии и советы Нет сигнала с положительным контролем EGFR (ПК) на флуоресцентном канале Cycling Green. a) Выбранный флуоресцентный канал для анализа данных ПЦР не соответствует данному протоколу Для анализа данных выберите канал флуоресценции Cycling Green для проведения аналитической ПЦР и флуоресцентный канал Cycling Yellow - для ПЦР внутреннего контроля. b) Неверное программирование температурного профиля прибора Rotor-Gene Сравнить температурный профиль с протоколом. c) Неверная конфигурация ПЦР Проверить свою работу пошагово с помощью схемы расположения образцов. При необходимости повторить ПЦР. d) Условия хранения для одного или нескольких компонентов набора не соответствует инструкциям, данным в разделе «Доставка и хранение» на стр. 5. Проверить условия хранения и дату окончания срока хранения (см. этикетку набора) реактивов. При необходимости использовать новый набор. e) Срок хранения набора истек Проверить условия хранения и дату окончания срока хранения (см. этикетку набора) реактивов. При необходимости использовать новый набор..

Похожие:

	Инструкция по применению Наборы реагентов для определения соматических... Набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене braf «braf rgq pcr kit (24)»		Методические рекомендации по применению наборов реагентов для выявления... Проведение амплификации, анализ и учет результатов при помощи приборов rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) и Rotor-Gene...
	Прайс-лист наборы реагентов для пцр-диагностики Оборудование и расходные материалы Обращаем Ваше внимание на то, что наборы реагентов для диагностики урогенитальных инфекций в качественном frt/fep формате и папилломавирусной...		Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований «in vitro», а также для культивирования туляремийного микроба для научных работ
	Инструкция по применению набора реагентов для определения тромбинового времени Набор предназначен для определения тромбинового времени при диагностике нарушений конечного этапа свертывания крови		Цкп «Генетический полиморфизм» обн ран Разработка тест-систем для определения пола и идентификации особей амурских тигров по любому биологическому материалу методом пцр...
	Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований Питательная среда предназначена для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным...		Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических... Агар Клиглера-грм» предназначен для бактериологических исследований в санитарной и клинической микробиологии с целью идентификации...
	Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллёза сухой...		Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения тироксина Набор реагентов «Тироидифа-тироксин-01» предназначен для количественного определения концентрации тироксина в сыворотке крови человека...
	Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения свободного тироксина Набор реагентов Тироидифа-свободныйТ4 предназначен для количественного определения содержания свободного тироксина (Т4) в сыворотке...		Инструкция по применению набора реагентов для выявления генов металло--лактамаз... Внутренний контрольный образец для наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
	Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения... Рекомендована Комиссией по наборам реагентов для иммуноферментного (неинфекционные), радиоиммунологического и других видов иммунохимического...		Документация об открытом аукционе в электронной форме на поставку... ...
	Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований «грм-агар» предназначен для культивирования различных микроорганизмов, таких как: энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки,...		Инструкция по применению набора реагентов для определения активности... Набор реагентов «щф-uts» предназначен для определения активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке или плазме крови человека в...