Учреждение высшего профессионального образования «курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора и. И. Иванова» На правах рукописи
|
Скачать 1.27 Mb.
|
|
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КУРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ ПРОФЕССОРА И.И.ИВАНОВА» На правах рукописи Татарников Кирилл Викторович Совершенствование средств и способов профилактики и лечения колибактериоза свиней 06.02.02.- Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание учебной степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор ветеринарных наук профессор Евглевский Ан.А. Курск – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ КАВ – Колибактериозная анатоксин – вакцина МПК – минимальная подавляющая концентрация АБП – антибактериальные препараты ПМП – постоянное магнитное поле E. coli – кишечная палочка ХТП – химиотерапевтические препараты МИК – минимальная ингибирующая концентрация МПА – мясопептонный агар МПГБ – мясопептонный глицериновый бульон ‘S – sensitive, чувствительный R – resistore, резистентный I – intermeoliate, промежуточный РНК – рибонуклеиновая кислота ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота Н – антиген - жгутиковый О – антиген – соматический К – антиген – капсульный АБК – ацидофильная бульонная культура ПАБК – пропионоацидофильная бульонная культура ПАСК – парааминосалициловая кислота ЛПС – липополисахаридный комплекс МКГ – микрограмм [одна тысячная 1 мг] АМП - аденозинмонофосфат Общая характеристика работы Актуальность темы. Кишечную палочку впервые выделил из кишечника и фекалий детей немецкий врач Теодор Эшерих в 1885 году. Разнообразный род E. coli отличается по ферментативным, серологическим свойствам, подвижности, патогенности, иммуногенности, антигенности, чувствительности к антибиотикам, образованию и свойствам токсинов, строению, выделению колицина, вызывающие гибель без лизиса родственных бактерий [Шахов А.Г, 2007; Самуйленко А.Я.,2005; Виноходов В.О., 2001; Панин А.Н., 2007]. Для специфической профилактики колибактериоза изготавливают моно и ассоциированные инактивированные вакцины путем выращивания лабораторно-производственных отечественных и зарубежных штаммов E. coli на мясогидролизатном или казеиногидролизатном бульоне с последующей детоксикацией и полимеризацией комплекса токсинов 0,5 - 0,7% раствором формальдегида [Самуйленко А.Я., 2005; Панин А.Н., 2007; Гордон А., 2006]. Наличие в бульонах балластных веществ мяса, казеина и низкое накопление биомассы микроорганизмов снижает иммуногенную и протективную эффективность анатоксин - вакцин. Поэтому возникает необходимость создания синтетических питательных средств с доступными компонентами, обеспечивающих стабильно высокое накопление кишечной палочки и высокоэффективных детоксикаторов и полимеризаторов бактериальных экзо- и эндотоксинов вместо 0,5 - 1 % растворов формальдегида. [Покровский В. И, 1999; Воробьев А. А, 1999; Федоров Ю. Н, 2005]. Протективная активность колибактериозной вакцины во многом зависит от способа и места введения с учетом роли местного иммунитета [Н. Безредка, 1925; Виноходов В. О., 2000; Урбан В. П., 1985; Королева Е. А., 2011]. Многолетнее применение противомикробных препаратов, физико-химическое воздействие привело к образованию у E. coli устойчивости ко многим антибактериальным препаратам. Соединение одних антибиотиков с другими, клавулановой и органическими кислотами, внесение в состав энрофлоксацина трилона - Б, аргинина, колимицина не обеспечило качественного прорыва в повышении биоцидного и лечебного действия лекарственных средств [Ковальчук Н. М., 2001; Девришев Д. А., 2010; Шахов А. Г., 2003]. Полимеризация антибиотиков по принципу получения анатоксин - вакцин с помощью 0,2% раствора формальдегида или 0,1% раствора глутарового альдегида и этония позволило повысить их биоцидное действие в отношении E. coli и лечения животных больных колибактериозом [Д. А. Евглевский, 2012-2013]. Актуальность разработки минеральной питательной среды, принципиально новой технологии получения и применения колибактериозной анатоксин-вакцины, повышения биоцидной и лечебной эффективности антибиотиков, определили выбор темы, цель, задачи и направление исследований. Цель работы. Целью научных исследований явилось совершенствование жидкой и плотной минеральной питательной среды для выделения и выращивания E. coli, повышение иммуногенной и протективной активности колибактериозной анатоксин-вакцины и биоцидного и лечебного действия энрофлоксацина и амоксициллина. Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:
Научная новизна. На основе сущности и механизмов физиологических процессов у микроорганизмов, способности глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлорида обеспечивать полимеризацию с образованием крупных полимерных соединений и их детоксикацию, впервые изучены и определены:
Практическая ценность. Разработанная жидкая минеральная питательная среда обеспечивает накопление до 75 – 90 млрд/мл E. coli в течение 2 – 3 суток выращивания для получения колибактериозной анатоксин-вакцины, а плотная среда с 2,5% агаром для оперативного выделения микроорганизмов. Эффективность полимеризации и детоксикации комплекса колибактериозных токсинов 0,2 – 0,3% глутарового альдегида с 0,2 – 0,3% алкилдиметилбензиламмония хлорида позволяет исключить использования канцерогенного формальдегида и ртутьсодержащего мертиолята. Установленное повышение устойчивости E. coli, выделенных в железорудных регионах Курской и Белгородской областей к энрофлоксацину и амоксициллину и температуре необходимо учитывать при терапии поросят, больных колибактериозом и проведении ветеринарно-санитарных мероприятий. Оральное введение поросятам колибактериозной анатоксин-вакцины по сравнению с подкожной вакцинацией увеличивает протективные свойства биопрепарата и подтверждает теорию и практическую ценность местного иммунитета, предложенные Безредка Н. Повышение биоцидных свойств энрофлоксацина и амоксициллина полимеризацией по принципу технологии изготовления анатоксин-вакцины позволяет снизить дозу препарата и сроки лечения желудочно-кишечных болезней поросят, вызванные полирезистентными E. coli отдельно и в ассоциации с другими микроорганизмами. Основные положения, выносимые на защиту:
Апробация работы. Результаты исследований рассмотрены на расширенном заседании кафедры эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии и представлены в трех докладах в материалах международных научно-практических конференций «Актуальные проблемы агропромышленного производства», Курск, 2013г. Публикация результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных статей, в том числе 9 в изданиях, рецензируемых ВАК РФ, получен 1 патент на изобретение №2476210 от 27.02.2013г. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и включает общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и результаты исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 7 рисунками. Список литературы содержит 213 источников, в том числе 84 иностранных. 2. Обзор литературы 2.1 Характеристика и физиология микроорганизмов и питательные среды для их выращивания Систематика микроорганизмов включает три надцарства: 1) безъядерные (акариоты) - вирусы; 2» предъядерные (прокариоты) - бактерии и 3) ядерные (эукариоты) от греч. а – нет, pro - до +karyon - ядро - это грибы, растения, животные. Вирусы являются неклеточными образованиями, содержащие один вид нуклеиновой кислоты - РНК или ДНК. Их насчитывают более 4-х тысяч видов. Для выращивания вирусов используют: 1) птичьи эмбрионы (куриные и т.д.); 2) культуры клеток из эмбрионов, органов и тканей молодых животных; 3) восприимчивые лабораторные животные. В отличие от вирусов бактерии имеют генетический аппарат, содержащий два вида нуклеиновых кислот, в целом полноценен, но не оформлен в ядро. Поэтому бактерии объединены в надцарство - предъядерные или прокариоты. Клетки грибов, растений и животных содержат два вида нуклеиновых кислот, но в отличие от бактерий их надцарственный, генетический материал сформирован в ядро клетки. Поэтому их относят к надцарству ядерные или эукариоты. На основании сходства определенных признаков возбудители инфекционных болезней подразделяются на множество видов: бактерии, вирусы, грибы, микоплазмы, хламидии, риккетсин, вибрионы, спириллы, спирохеты, нитевидные формы бактерий - актиномицеты, раньше назывались лучистыми грибами. Из актиномицетов получают более 20% всех антибиотиков (стрептомицин, тетрациклин, нистатин, эритромицин, рифампицин). Кроме того изучены вироиды, вызывающие более 100 болезней растений, вызываемые необычными вирусами, а также прионы - низкомолекулярные белки, не имеющие нуклеиновой кислоты, не вызывают ответных иммунных реакций организма, весьма устойчивы к высоким температурам и излучениям. Кроме вирусов животных, вироидов растений выделены у многих бактерий - вирусы, названные бактериофагами, вызывающие разрушение, лизис многих бактерий, в том числе бацилл сибирской язвы, стафилококков, сальмонелл и т.д. По форме бактерии подразделяются на палочковидные, кокковидные, извитые и ветвящиеся. Стафилококки (от греч. Staphyle - виноградная гроздь) представляют кокки, расположенные в виде грозди винограда, в результате деления кокков в разных плоскостях. Бактерии делятся поперечным делением на две дочерние клетки - кишечная палочка, сальмонеллы в течение 20-30 минут, а микобактерии туберкулеза в течение 20 -24 часов. Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядра (нуклеод). Некоторые бактерии имеют капсулу, микрокапсулу, слизь, жгутики, фимбрии и в неблагоприятных условиях образуют обезвоженную структуру, называемую спорой. Клеточная стенка участвует в процессе деления клетки и транспорте метаболитов. Наиболее толстая клеточная стенка у грамположительных бактерий толщиной до 50 нм, у грамотрицательных - около 15-20 нм. Клеточная стенка бактерий содержит полисахариды, липиды, белки (протеины) и основной компонент (90%) многослойный пептидокликан (муреин), обеспечивающий прочность и форму бактерий. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий связаны тейхоевые кислоты (от греч. Teichos – стенка). Строение и состав пептидной части пептидогликана у грамотрицательных бактерий стабильны, а у грамположительных бактерий аминокислоты пептидогликана отличаются по составу и последовательности [9, 32, 70, 173]. Грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают генциановиолетовый краситель, обесцвечиваются и при обработке фуксином окрашиваются в красный цвет. Это обусловлено меньшим количеством пептидогликана. У грамположительных бактерий при окраске по Граму (Грам - датский микробиолог, предложивший окраску бактерий в 1884г.) образуется сине-фиолетовая окраска из-за связывания генциацианвиолета с йодом. В состав бактерий входят вода - около 80% ее массы, в спорах количество воды уменьшается до 18-20%. Бактерии содержат более 2000 различных белков, а в целом белки составляют 40-80% сухой массы бактерий [41, 43, 45]. Белки бактерий обладают ферментативной, иммуногенной, антигенной, вирулентной активностью и имеют видовую принадлежность. Кроме белков бактерии содержат две нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), углеводы, липиды, минеральные элементы - фосфор, калий, натрий, сера, железо, кальций, магний, цинк, медь, кобальт, марганец, углерод и азот. Выход вещества из клетки, в том числе экзотоксинов происходит за счет диффузии и участия транспортных систем. Для роста микробов необходимо вносить в питательные среды аминокислоты для построения белков, пурины, пиримидины для образования нуклеиновых кислот и витамины, входящие в состав ферментов. Проникновение питательных веществ в бактериальную клетку происходит в результате простой диффузии. Ферменты макро- и микроорганизмов участвуют в процессах анаболизма (синтеза) и катаболизма (распада), т.е. метаболизма. Изучено более 2000 ферментов [45, 52, 62, 7]. У бактерий различают эндоферменты, участвующие в дыхание, питании и делении клетки и в биосинтезе различных структурных элементов клетки. В то же время экзоферменты выделяются ферментной системой клетки в окружающую среду, для расщепления макромолекул питательной среды до простых соединений, которые усваиваются клеткой. Кроме того экзоферменты бактерий выполняют защитную функцию путем инактивации антибиотиков [79, 80, 96, 98]. Некоторые экзоферменты (нейромидаза, ферменты агрессии и др.) бактерий разрушают ткань и клетки, обеспечивая проникновение микробов и их токсинов в ткани организма. Ферменты микроорганизмов используют в качестве активных веществ, в генетической инженерии и применяют в легкой и пищевой промышленности, в качестве биодобавок в стиральные порошки для расщепления и уничтожения органических загрязнений [39, 45, 82]. Ферментативное различие у бактерий используют для их идентификации. Сахаролитические свойства ферментов (расщепление сахаров) определяют по конечным продуктам образования щелочей, кислот, сероводорода, аммиака и др. Определяют Е. coli на дифференциально - диагностических средах Эндо, Гиса, Плоскирева и др. В частности пестрый ряд среды Гиса состоит из МПБ или полужидкого мясопептонного агара с добавлением углевода [лактозы, манита и др.] и индикатора РН (меняющего цвет при расщеплении углевода с кислотообразованием и пузырьков газа). Среды Эндо и Левина представляют собой МПА с лактозой и индикатором РН (фуксин и пр.) На этих средах бактерии расщепляющие лактозу с образованием кислоты окрашены в красный цвет с металлическим блеском (среда Эндо для кишечной палочки) или в темно-синий цвет на среде Левина. В то же время бактерии (сальмонеллы, дизентерийные палочки) не расщепляющие лактозу на этих средах образуют неокрашенные колонии. Протеолитические свойства бактерий определяют по разжижению желатина и разложению белка с образованием индола, сероводорода и аммиака. По отношению к молекулярному кислороду бактерии подразделяются на три группы: 1) облигатные (обязательные аэробы), растущие на средах с доступом кислорода; 2) облигатные (строгие анаэробы), растущие на средах без кислорода, который для них токсичен; 3) факультативные бактерии, растущие как при наличии, так и отсутствии кислорода. Размеры бактерий колеблются от 0,2 до 10 мкм (1 мкм равняется 1000 нанометров), а вирусов от 20 до 400 нм. В настоящее время, известно около 7000 видов бактерий и 4-х тысяч вирусов. Бактерии размножаются бинарными делением на две одинаковые клетки. При оптимальных условиях роста бактерии делятся через 20 - 40минут. Рост палочковидных бактерий происходит в длину, а у кокков во всех направлениях. Для выращивания бактерий используют жидкие, плотные и полужидкие питательные среды [11, 38, 217]. Жидкие среды готовят на основе водных растворов бульонов и гидролизатов мяса, казеина, крови. Для получения плотных сред к ним добавляют агар, желатин или силикогель. Агар представляет собой сложный полисахарид из морских водорослей, который растворяется при 90 - 100° и сохраняет жидкое состояние до 45°С. Для приготовления плотных сред агар добавляют в бульон в концентрации 2 - 3%, а в полужидкие до 0,5 - 0,7 % [126, 83, 207]. В качестве универсального источника азота и углерода в питательные среды добавляют пептоны - продукты неполного расщепление белков (протеинов) с помощью ферментов (пепсина, дрожжей и т.д.). Различают универсальные среды – мясопептонный бульон (МПБ = мясная вода + 1% пептона + 0,5% NaCL) и мясопептонный агар (МПА = МПБ + 2 - 3% агара). В настоящее время проводятся исследования с использованием синтетических сред вместо МПБ. Кроме универсальных сред для выращивания микробов используют дифференциально - диагностические, селективные, избирательные, обогатительные, а также дифференциально - селективные; специальные, например для выделения микобактерий – среда Левенштейна - Йенсена и синтетические, приготовленные из известных химических ингредиентов и полусинтетические с добавлением продуктов природного происхождения [79, 80, 52, 194]. Повышение эффективности биопрепаратов требует от исследователей разработки питательных сред, отличающихся постоянством состава и свободных от продуктов неопределенного химического характера - белков, экстрактивных веществ мяса, пептонов, продуктов растительного происхождения. Такими являются питательные среды, составленные из различного набора химически чистых солей, аминокислот, микроэлементов. В 1893 г., благодаря работам русского ученого К.В. Ушинского, была впервые установлена возможность культивирования патогенных микроорганизмов без утраты присущих им свойств на растворах солей, не содержащих продуктов животного и растительного происхождения. Автор приготовил среду следующего состава: глицерина – 50 мл, хлористого натрия – 5 – 7 г, хлористого кальция – 0.1 г, сернокислого магния – 4 г, двузамещенного фосфорнокислого – 1,0 г и молочнокислого аммония – 10 г на 1 л дистиллированной воды. В другом варианте своей среды он ввел 3,4 г аспарагиновокислого натрия. На описанных вариантах сред автор с успехом выращивал холерный вибрион, бактерии рожи свиней, Е. coli, сальмонеллы. Рассматривая, предложенную автором, среду с позиций современных знаний биохимии питания микроорганизмов, необходимо указать, что она содержит все жизненно необходимые минеральные элементы: магний, калий, ионы серной и фосфорной кислоты и источник углерода, глицерин. Полученные результаты стали прообразом большинства синтетических питательных сред. В последующем была изучена роль в физиологии микроорганизмов серы, кальция, меди, железа, кобальта, витаминов и аминокислот. Следует указать, что фосфор и калий постоянно составляют самое большое количество минерального остатка. Они входят в состав нуклеиновых кислот, некоторых липидов и ферментов. Кроме того, ионы фосфора и калия наряду с ионами натрия необходимы для поддержания осмотического давления среды, для выполнения функций буфера в среде. Ионы кальция, магния и серы необходимы для функции внутриклеточных энзимов. Ион серы при этом активно включается в клеточные белки. Ион магния активирует почти все энзимы, требующие наличия двухвалентных катионов. Краткий отбор литературы дает основание утверждать, что минеральные питательные среды с аспарагином, глицерином, и с ионами железа, цинка и т.д. обеспечивают сохранение морфологических и биологических свойств микроорганизмов, а лимонная кислота цикла Кребса, растворение ингредиентов. При сочетании различных веществ необходимо помнить, что они могут взаимодействовать друг с другом, образуя при этом различные соединения Особенно важно создавать такие условия для роста бактерий, при которых не происходило бы осаждения углекислых и фосфорнокислых солей. Поэтому необходимо учитывать совместимость, стабильность и нестабильность вносимых ингредиентов среды. В питательных средах при культивировании микроорганизмов, так называемые несущественные элементы для жизнедеятельности клетки, могут оказывать косвенное влияние, или могут создавать благоприятные физико-химические условия среды, способствовать полному растворению основных ингредиентов в питании бактерий. Разделение элементов питательной среды на основные, или существенные, и на дополнительные, или несущественные метаболиты является условным и ориентировочным [96, 122, 126, 217, 218]. Достигнутые успехи в конструировании минеральных питательных сред создают перспективу совершенствования существующих, и поиска новых, более эффективных, экологически безопасных, технологически доступных и выгодных ингредиентов в составе питательных сред, обеспечивающих высокое накопление бактериальной массы при изготовлении вакцины и анатоксинов. |
Похожие:
 |
Использование хелатных форм микроэлементов в рационах высокопродуктивных коров «курская государственная сельскохозяйственная академия» имени профессора и. И. Иванова |
 |
Г. Курске, Россия Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора Н. А. Грачева, канд экон наук, доцент, профессор кафедры бухгалтерского учета, анализа и аудита юзгу– отв редактор |
|
Г. Екатеринбург 20. 12. 2010 Рф 1 класса Родиной А. Н. (с 24. 11-26. 11. 2010) проведена проверка финансово-хозяйственной деятельности в Федеральном государственном... |
|
Бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования... Факторы вирулентности Pseudomonas aeruginosa |
|
Российской федерации фгбоу впо «белгородская государственная сельскохозяйственная... «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». Материалы международной научно производственной... |
|
Российской федерации фгбоу впо «белгородская государственная сельскохозяйственная... «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». Материалы международной научно производственной... |
|
Профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский... |
|
Нижегородская государственная медицинская академия Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
|
Аннотация к рабочей программе по дисциплине «Организационно-правовые... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная... |
|
Российской федерации фгбоу впо «белгородская государственная сельскохозяйственная... «Проблемы и перспективы инновационного развития животноводства». Материалы международной научно производственной конференции. Белгород,... |
|
Российской федерации фгбоу впо «белгородская государственная сельскохозяйственная... «Актуальные вопросы экономической науки и практики» Материалы международной научно производственной конференции. Белгород, 20 – 21... |
|
Ижевская государственная медицинская академия Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Эпизоотология и инфекционные болезни животных» Фгбоу впо «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия имени В. Р. Филиппова» |
|
Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное... «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии -мва имени К. И. Скрябина» |
|
Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное... «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии -мва имени К. И. Скрябина» |
|
Инструкция по делопроизводству утверждено ... |