Министерство здравоохранения Российской Федерации
ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет»
На правах рукописи
Гукасян Арам Лаврентьевич
ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ЛЕЧЕНИЕ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА И КРАЕВОГО ПАРОДОНТА С ПРИМЕНЕНИЕМ НИОСОМАЛЬНОГО ГЕЛЯ «РЕГЕНЕРИН»
14.03.11- восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия
14.01.14 – стоматология
Диссертация
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор
И.А. Базиков
доктор медицинских наук, профессор
В.А. Зеленский
Ставрополь – 2014
ОГЛАВЛЕНИЕ
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ…………………………………….4
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Научно-методические основы разработки регенерирующих препаратов для лечения слизистой оболочки полости рта и пародонтитов……….…11
Методы лечения слизистой оболочки
полости рта и краевого пародонта……………………………………….12
Использование микрокапсулирования
для доставки активных веществ………………………………………….21
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……….…….40
2.1. Микробиологические и молекулярно-генетические
технологии для установления и
идентифицикации патогенной микрофлоры полости рта……………….40
2.2. Методы выделения низкомолекулярных пептидов……………...………43
2.3. Технология приготовления стоматологического
ниосомального геля «Регенерин»…………………………………………45
2.3.1. Получение ниосом и инкапсулирование
низкомолекулярных пептидов…………………………...………………45
2.3.2. Физико-химическая оценка приготовленных ниосом………………….46
2.4. Экспериментальные методы исследования…………..…………………..46
2.5. Анализ эффективности применения
ниосомального геля «Регенерин»………………………………………..49
2.6. Статистическая обработка материала…………………………………….49
ГЛАВА 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС У БОЛЬНЫХ С ПОВРЕЖДЕНИЯМИ СЛИЗИСТЫХ И ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПАРОДОНТА ПО РЕЗУЛЬТАТАМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………………………………………50
3.1. Отработка оптимальных методов
экстрагирования плацентарной ткани………………………...…………..57
3.2. Оценка размеров и стабильности ниосом
кремнийорганической природы,
используемых для доставки активных субстанций………………………60
3.3. Биотехнология приготовления
ниосомального геля «Регенерин»………………..……………………….65
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ НИОСОМАЛЬНОГО ГЕЛЯ «РЕГЕНЕРИН»
4.1. Изучение токсичности ниосомального
геля «Регенерин» на экспериментальных животных…………………….70
4.2. Изучение стимуляции регенераторной способности
слизистой оболочки полости рта после химической,
ожоговой и механической травмы………………………………………..74
4.3. Результаты гистологического исследования патологии
краевого пародонта в эксперименте при применении
клеточного препарата «Регенерин»……………………………………….76
4.4. Микробиологический статус у больных
с повреждениями слизистых и заболеваниями
пародонта с помощью молекулярно-генетических
методов исследования после лечения
гелем «Регенерин»………………………………………………..…………87
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………….………………..90
ВЫВОДЫ………………………………………………………………………105
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………...………….106
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
БАВ - биологически активные вещества
ВЛТ - весы лабораторные тензометрические
ГОСТ - государственный стандарт РФ
ГИСК им. Л.А. Тарасевича - Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
Кг. - килограмм
КОЕ/мл - колониеобразующие единицы на миллилитр
МЗ СССР - Министерство здравоохранения Союза советских Социалистических республик
Мл - миллилитр
НПО - научно-производственное объединение
НУК - надуксусная кислота
Нм - нанометр
Па - паскаль
ПАВ - поверхностно-активное вещество
ПЭГ - полиэтиленгликоль
РФ - Российская Федерация
СанПиН - санитарные правила и нормы
СтГМУ - Ставропольский государственный медицинский университет
СШАСоединенные штаты Америки
ТД - терапевтическая доза
ТУ - технические условия
УРЛ - универсальный рефрактометр лабораторный
УФ - ультрафиолетовые лучи
ФКУЗ СтавНИПЧИ - Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека
ФГУН - Федеральное государственное учреждение науки
ФС - Федеральный стандарт
ФРГ - Федеральная Республика Германии
D - диаметр
GCP - GoodClinicalPractice
Н+ и ОН- - ионы водорода и гидроксигруппы
HP UV Visible ChemStation - Hewlett Packard Visible ChemStation
m - средняя квадратическая ошибка
ScCO2 - суперкритичный диоксид углерода
pH - Водородный показатель
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
Поражения слизистой оболочки рта и краевого пародонта возникают в результате действия различных местных факторов (механических, физических, химических). В результате нарушается целостность эпителия, что служит входными воротами инфекции. После образования болезненных эрозий и язв нередко присоединение вторичной микрофлоры. Это усложняет развитие воспалительного процесса слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта, особенно в тех случаях, когда существует дисбактериоз.
Ведущая роль в развитии воспалительных заболеваний краевого пародонта принадлежит мягкому бактериальному налету, располагающемуся на минерализованной поверхности зубного камня, аккумулирующего эндотоксины и являющегося основанием для продолжения собственного роста.
Полученный и систематизированный за последние годы материал доказывает ведущую роль в формировании воспалительного процесса в полости рта резидентной облигатной анаэробной и микроаэрофильной микрофлоры. Из более 700 видов, выделенного с помощью современных технологий генетического материала микроорганизмов, заселяющих полость рта при патологии краевого пародонта, доказана роль только незначительного числа микроорганизмов.
Необходимость изучения корреляционных связей между степенью выраженности морфологических изменений и количественными параметрами резидентной и пародонтопатогенной микрофлоры с помощью микробиологического и молекулярно-генетического методов детекции продиктована повышением эффективности восстановительного лечения слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта.
Клеточные препараты в форме геля оказывают непосредственное влияние на заживление ран (Ross А., 1968), в частности, на их эпителизацию (Coulomb В., et al., 1998). Многие факторы роста и биологически активные вещества, продуцируемые низкомолекулярными пептидами, выделенными из плацентарных клеток, стимулируют пролиферацию и миграцию эпителиальных кератиноцитов, ускоряя процессы регенерации и эпителизации поврежденных тканей. Использование низкомолекулярных пептидов в форме геля является перспективным методом восстановления целостности эпителия слизистой оболочки рта и патологии пародонта для предупреждения образования рубцовых деформаций.
Необходимость разработки нанопрепаратов местного действия для лечения заболеваний пародонта, появилась в связи с новыми подходами к созданию носителей лекарственных веществ. Новая область наномедицины - применение системы доставки лекарств, с помощью наночастиц различной природы, открыла возможности использования инновационных подходов и для лечения ряда заболеваний пародонта. Принцип адресной доставки – сокращение общего количества вводимого препарата в сочетании с оптимизацией его активности, является перспективным и для лечения таких заболеваний, как повреждения слизистой оболочки полости рта и пародонтита.
Наиболее изученными переносчиками в области лекарственной терапии являются липосомы и ниосомы. С 1990-х годов, неионогенные везикулы ПАВ рассматриваются в качестве альтернативы липосомам как носители лекарств (Manconi et al., 2006). Преимущества ниосом включают:
1) более высокую чистоту и стабильность неионногенных поверхностно-активных веществ по сравнению с фосфолипидами, (т.е. деградацию путём окисления и гидролиза) (Vora et al., 1998), 2) возможность массового производства без использования органических растворителей (Fang et al., 2001), 3) контроль скорости высвобождения лекарственных препаратов и адресация лекарств (Tabbakhian et al., 2006) путём модификации их состава или поверхности (Alsarra et al., 2005; Schreier and Boustra, 1994).
Таким образом, представляет интерес совершенствование лечения заболеваний пародонта и повреждений слизистой оболочки полости рта с применением разработанного ниосомального геля «Регенерин» при изучении микробиоценоза.
Результаты корреляционного анализа с помощью микробиологического и ПЦР-методов, как интегрального показателя микробиоценоза, позволят объективно оценить стоматологический статус и обосновать целесообразность применения разработанного препарата.
Цель исследования - повышение эффективности восстановительного лечения слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта с помощью разработанного ниосомального геля «Регенерин».
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Выявить основные пародонтопатогенные виды резидентной облигатной анаэробной и микроаэрофильной микрофлоры полости рта помощью микробиологического и ПЦР-методов.
2. Отработать оптимальные методы выделения низкомолекулярных пептидов из клеток плаценты.
3. Изучить размеры и стабильность ниосом кремнийорганической природы.
4. Разработать технологию получения ниосомального геля «Регенерин»
5. Изучить токсичность геля на лабораторных животных.
6. Оценить стимуляцию регенераторной способности слизистой оболочки рта после применения геля «Регенерин».
7. Изучить гистологические особенности патологии пародонта в эксперименте при применении геля «Регенерин».
8. Провести количественную оценку содержания пародонтопатогенной, а также резидентной микрофлоры в биоплёнке десневой борозды при восстановительном лечении разработанным гелем «Регенерин».
9. Оценить клиническую эффективность применения геля «Регенерин» у больных пародонтитом и повреждениями слизистой оболочки полости рта.
Научная новизна исследования.
1. Впервые применение молекулярно-генетических технологий в лабораторной диагностике, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью, позволило установить и идентифицировать патогенную микрофлору при достоверной и объективной оценке эффективности восстановительного лечения ниосомальным гелем «Регенерин».
2. Впервые в эксперименте отработаны оптимальные методы получения низкомолекулярных пептидов и разработана технология их инкапсулирования в кремнийорганические нановезикулы, а также дана оценка их свойств.
3. Впервые разработаны фазы приготовления и рецептура ниосомального геля «Регенерин» для восстановительного лечения повреждений слизистой оболочки рта и краевого парадонта различной этиологии.
4. Разработанные в эксперименте модели механической, химической и физической травм слизистой оболочки полости рта и пародонта для оценки эффективности разработанного геля, являются основой для дальнейших исследований особенностей течения патологических процессов в слизистой оболочке рта и способов их лечения с применением клеточных технологий.
5. Впервые в эксперименте и в клинических исследованиях продемонстрирован терапевтический эффект восстановительного лечения гелем «Регенерин» при заживлении различных поражений слизистой оболочки рта и краевого пародонта.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Отработана технология получения низкомолекулярных пептидов из клеток плаценты. На основании проведённых исследований разработана технология инкапсулирования полученных пептидов в кремнийорганические нановезикулы. Разработаны фазы приготовления и рецептура стоматологического ниосомального геля для восстановительного лечения различных поражений слизистой оболочки рта и заболеваний пародонта. Эффективность препарата изучена на больных. Результаты исследований внедрены в работу практического здравоохранения стоматологических учреждений Ставропольского и Краснодарского краев, а также используются в учебном процессе на кафедрах стоматологии СтГМУ. Разработаны технические условия (ТУ) для производства препарата на базе ООО НПО «Клеточные технологии», г. Ставрополь.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Адекватным показателем, отражающим интенсивность морфологических и функциональных нарушений при поражениях слизистой полости рта и краевого пародонта является увеличение частоты выявления генетических маркеров наиболее вирулентных пародонтопатогенов (Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus) в десневой жидкости.
2. Факторы роста и биологически активные вещества, продуцируемые низкомолекулярными пептидами, выделенными из плацентарных клеток, стимулируют пролиферацию и миграцию эпителиальных кератиноцитов, ускоряя процессы регенерации и эпителизации поврежденных тканей. Эти свойства позволили использовать выделенные пептиды для получения ниосомального геля.
3. Разработанная технология иммобилизации низкомолекулярных пептидов в кремнийорганические нановезикулы позволила получить ниосомальный гель с высокой регенерирующей способностью.
4. Экспериментальные данные, полученные при изучении морфологических изменений после сравнительного восстановительного лечения поражений слизистой оболочки рта и краевого пародонта с использованием ниосомального геля «Регенерин», продемонстрировали ускорение регенерации, оптимизации процесса заживления и препятствие возникновению возможных осложнений.
5. Ниосомальный гель «Регенерин» не обладает токсичностью, а результаты проведенных клинических исследований свидетельствуют о его эффективности по сравнению с другими препаратами, предназначенными для восстановительного лечения поражений слизистой оболочки рта и краевого пародонта.
6. Существенное снижение диагностических показателей анаэробной пародонтопатогенной микрофлоры при наличии генетических маркеров пародонтопатогенов в десневой жидкости при лечении стоматологическим ниосомальным гелем «Регенерин» является информативным, диагностически значимым тестом в оценке эффективности восстановительного лечения слизистой оболочки полости рта и краевого пародонта.
Апробация работы.
Результаты работы докладывались на международных, всероссийских и региональных конференциях, конгрессах и симпозиумах: 8 итоговая конференция молодых учёных с международным участием, СтГМА, Ставрополь, 2010 г.; 17-я ежегодная Неделя медицины Ставрополья, 19-21 сентября 2013 г.; II международная конференция «Инновационные разработки молодых ученых – развитию агропромышленного комплекса», Ставрополь 20-21 сентября 2013г.; V Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», г.Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013г.;
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 6 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.
Объем и структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 132 страницах компьютерного текста и включают введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, три главы собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы и практические рекомендации, список литературы, включающий 113 отечественных и 121 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 45 рисунками и 11 таблицами.
|
