На правах рукописи
ШЕСТАКОВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСЕЕВНА
Клинико-иммунологические особенности ответа пациентов с аллергической и неаллергической формой атопического дерматита на введение активированных Т-лимфоцитов
14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Новосибирск 2010
Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Кожевников Владимир Сергеевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна
доктор медицинских наук, профессор Климов Владимир Васильевич
Ведущая организация:
ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России
Защита состоится «____» ___________ 2010 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН
Автореферат разослан «___» _______________ 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Проблема атопического дерматита является чрезвычайно актуальной в связи с 2-3кратным увеличением заболеваемости АД в индустриальных странах за последние 30 лет. АД страдают 10-20% детей и 1-3% взрослых [Ben-Gashir M.A., 2004, Leung D.Y.M., 2004]. Многочисленные исследования показали, что АД является полиэтиологичным заболеванием. Клинически заболевание реализуется при наличии генетической предрасположенности по аутосомно-доминантному типу, нарушении барьерной функции кожи, вегетативно-сосудистых, нейроэндокринных нарушений, локальных и системных изменений реакций иммунной ситемы и провоцирующих факторов окружающей среды [Ben-Gashir M.A.,2004, Leung D.Y.M, 2004]. АД является гетерогенным заболеванием. В зависимости от общего уровня IgE сыворотки крови различают аллергическую и неаллергическую форму АД [Novak N., Bieber T., 2003]. Изучение особенностей иммунологических механизмов развития каждой из форм является актуальной задачей аллергологов и иммунологов.
Стандартные методы лечения аллергических заболеваний, используемые в настоящее время, включают применение системных и топических препаратов, которые подавляют действие медиаторов воспаления. Единственным методом, который видоизменяет характер реагирования организма на аллерген, вмешиваясь в основные патогенетические звенья аллергического процесса, является аллерген-специфическая иммунотерапия и ее модификации [Akdis C.A., 1998, Francis J.N., 2003, Gardner L.M., 2004, Алексеева Л.Г., 2007]. Однако недостаточная эффективность, а подчас и невозможность ее проведения при атопическом дерматите, является основанием для поиска новых направлений системной терапии данного заболевания.
Активное изучение регуляторных клеток при различных патологических состояниях в последнее десятилетие выявило снижение их активности при атопических заболеваниях. В частности показано, что у аллергиков при неизмененном количестве клеток в субпопуляции CD4+CD25+ преобладают не регуляторные, а активированные Т-клетки. Кроме того, в эксперименте было показано, что как естественно встречающиеся CD4+CD25+-регуляторные Т-клетки, так и индуцированные IL-10-продуцирующие аллерген-специфические Tr1-клетки снижают активность аллерген-специфических эффекторных клеток, подавляют продукцию IgE и повышают уровень IgG4 и IgA, что способствует уменьшению симптомов аллергического заболевания [Fehйrvary Z., 2004, Ling E.M., 2004, Robinson D.S., 2004, Shi H.–Z., 2005].
В зависимости от поверхностных маркеров и профиля цитокиновой секреции к настоящему времени охарактеризованы различные группы регуляторных клеток, среди которых могут находиться как антиидиотипические, распознающие клоноспецифические детерминанты, так и антиэрготипические клетки, распознающие маркеры активации (так называемые эрготопы), например, молекулу CD25, молекулу белка теплового шока 60 [Cohen I.R., 2004, Fehйrvary Z., 2004, Sarantopoulos S., Kronenberg M., 2005, Beisser, S., 2006]. Показано, например, что субпопуляция CD4+CD25+Foxp3+-регуляторных клеток содержит в себе как антиидиотипические, так и антиэрготипические клоны [DeMoraes L.V., 2003, Sakaguchi S., 2004, Buenafe A.C., 2004, Hong J., 2006]. Эти данные позволяют предполагать изменения активности регуляторных клеток в результате индукции антиэрготипического ответа, что даст возможность корригировать дисбаланс с преобладанием Th2-клеток, характерный для атопических заболеваний, и уменьшить клинические проявления аллергии.
Иммунизация, нацеленная на усиление природной антиэрготипической регуляторной сети, впервые была применена в экспериментальных моделях для лечения аутоиммунных заболеваний [Lohse A.W., 1989, 1993, Mimran A., 2004, 2005], при которых было показано снижение антиэрготипического ответа [Hafler D.A., 1985, Mimran A., 2004]. Такое воздействие оказалось успешным. Так, введение антиэрготипических клеток или иммунизация самими эрготопами или полноразмерными последовательностями ДНК, кодирующими эти молекулы, контролировало такие аутоиммунные заболевания, как адьювантный артрит и экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит.
У человека стимуляция антиэрготипического ответа показана путем вакцинации антиген-реактивными Т-клетками при рассеянном склерозе, при котором отмечается его снижение [Hafler D.A., 1985, Correale J., 1997, Stinissen P., 1998, Zang Y.C., 2000]. Также стимуляция антиэрготипического ответа была получена у пациентов, страдающих диабетом I типа, при введении им пептида белка теплового шока 60 (HSP60) [Raz I., 2002, Huurman V.A., 2007].
Идея применения поликлональной Т-клеточной вакцины при атопическом дерматите заключалась в том, чтобы индуцировать именно антиэрготипический ответ, поскольку выявить антигенную специфичность клеток, участвующих в патогенезе АД, у большинства пациентов не удается. Феномен индукции антиэрготипического ответа путем введения поликлонально активированных Т-клеток ранее был показан только в эксперименте, поэтому не изучены возможные изменения клинических и иммунологических параметров больных в результате такой терапии.
Цель исследования. Изучить изменения клинических и иммунологических параметров пациентов с аллергической и неаллергической формой атопического дерматита в процессе терапии активированными аутологичными Т-лимфоцитами.
Задачи исследования:
Сравнить клинические проявления аллергической и неаллергической формы атопического дерматита, используя шкалу для оценки тяжести клинических симптомов АД (SCORAD) и индекс качества жизни (DLQI).
Исследовать особенности количественных и функциональных характеристик иммунной системы больных с аллергической и неаллергической формой атопического дерматита, включая оценку числа теломерных повторов ДНК иммунокомпетентных клеток, их линейные и активационные маркеры, продукцию регуляторных и эффекторных молекул (цитокинов, Н2О2 и иммуноглобулинов).
Исследовать фенотипические характеристики in vitro активированных аутологичных Т-клеток больных атопическим дерматитом, предназначенных для введения с целью иммунотерапии.
Изучить переносимость и клиническую эффективность применения активированных аутологичных Т–лимфоцитов в лечении больных с аллергической и неаллергической формой атопического дерматита.
В динамике оценить влияние иммунотерапии активированными аутологичными Т-лимфоцитами на количественные и функциональные параметры иммунной системы больных с аллергической и неаллергической формой атопического дерматита.
Научная новизна.
В результате выполнения работы были получены новые данные, характеризующие больных с аллергической и неаллергической формой атопического дерматита с точки зрения их общих и особенных свойств, клинических проявлений и иммунной системы.
Впервые показано, что при обеих формах заболевания наблюдаются изменения активности фагоцитоза, снижение количества NK-клеток, уменьшение числа теломерных повторов ДНК в субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов, повышение продукции лимфоцитами факторов ингибиции миграции в реакции ГЗТ и активация гуморального звена иммунной системы.
Обнаружено, что для аллергической формы атопического дерматита характерна большая тяжесть заболевания и большее число нарушений в различных звеньях иммунной системы, включая увеличение числа CD4+CD25+bright-клеток и нарушение факторов врожденного иммунитета, обусловленные снижением продукции перекиси водорода моноцитами. В патогенезе этой формы большую роль играют реакции гиперчувствительности как I, так и IV типа. Установлена важная роль в развитии этой формы заболевания популяции CD8+-лимфоцитов.
Впервые в лечении больных атопическим дерматитом для Т-клеточной вакцинации (ТКВ) были использованы поликлонально активированные аутологичные Т-лимфоциты. Обнаружено, что при аллергической форме АД положительная клиническая динамика от ТКВ сопровождается повышением числа CD8+-клеток, снижением уровня IgE и числа В-лимфоцитов периферической крови. При неаллергической форме нарастает число CD8+CD25+ Т-клеток, уменьшается количество В-лимфоцитов и повышается активность лимфоцитов в продукции факторов ингибиции миграции в реакции ГЗТ. При обеих формах заболевания в результате ТКВ восстанавливается фагоцитарная функция клеток моноцитарно-макрофагального звена иммунной системы.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные данные демонстрируют различия большего числа иммунных параметров пациентов с АД, чем только нормальное или повышенное содержание IgE в сыворотке, причем более выраженные изменения иммунной системы при аллергической форме АД могут обусловливать и ее более тяжелое течение.
Нами разработан метод лечения атопического дерматита, основанный на индукции антиэрготипического ответа путем введения поликлонально активированных аутологичных Т-клеток. Показана безопасность и высокая клиническая эффективность такого подхода в лечении пациентов, как с аллергической, так и с неаллергической формой атопического дерматита. Были выявлены изменения иммунологических параметров больных с обеими формами заболевания в процессе такого воздействия.
Полученные данные позволяют рекомендовать внедрение иммунотерапии активированными аутологичными Т-лимфоцитами в клиническую практику, что позволит расширить возможности патогенетической терапии аллергических заболеваний, повысить ее эффективность и улучшить качество жизни таких больных.
Основные положения, выносимые на защиту
Более тяжелое течение аллергической формы атопического дерматита, в отличие от неаллергической, обусловлено как активацией гуморальных эффекторных функций и дисбалансом в моноцитарно-макрофагальном звене иммунной системы, характерных для обеих форм заболевания, так и участием в патогенезе заболевания реакций гиперчувствительности I и IV типов, активным участием CD4+- и CD8+-субпопуляций Т-лимфоцитов и более глубокими нарушениями факторов врожденного иммунитета.
Использование активированных аутологичных Т-лимфоцитов в терапии атопического дерматита коррегирует дисбаланс в иммунной системе: подавляет гуморальный, активирует клеточный иммунный ответ и функции монофитарно-макрофагального звена. При аллергической форме заболевания положительная клиническая динамика сопровождается повышением числа CD8+-клеток и прогрессивным снижением уровня общего IgE, при неаллергической - нарастанием числа CD8+CD25+ Т-клеток.
Использование активированных аутологичных Т-лимфоцитов в терапии больных атопическим дерматитом является безопасным и клинически высокоэффективным как при аллергической, так и при неаллергической форме заболевания и позволяет рекомендовать его в качестве метода патогенетической терапии.
Апробация результатов. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (г. Омск, 2007, г. Томск, 2008), на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008), на научном семинаре НИИ КИ СО РАМН (г. Новосибирск, 2009). Работа выполнена на базе лаборатории клинической иммунопатологии отдела клинической иммунологии и отделения аллергологии Клиники иммунопатологии НИИ КИ СО РАМН.
Публикации. По материалам исследования опубликовано 9 печатных работ, из них 6 статей, в том числе 1 статья в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей учёной степени кандидата наук, и 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 115 страницах машинописного текста, включающего 23 таблицы. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 253 литературных источника, в том числе 242 иностранных.
Автор выражает искреннюю признательность участникам совместных исследований – научному руководителю, зав. лаб. клинической иммунопатологии д.м.н., профессору В.С. Кожевникову и всем сотрудникам лаборатории, зав. отд. аллергологии В.М. Непомнящих и всем врачам отделения.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Объект исследования. В исследование было включено 42 пациента, страдающих АД (15 мужчин и 27 женщин) в возрасте от 17 до 49 лет (средний возраст 22,5±1,13 года), находящихся на лечении в аллергологическом отделении НИИ КИ СО РАМН в период с апреля 2006 по февраль 2008 года. В зависимости от уровня IgE пациенты были разделены на 2 группы. У больных первой группы уровень IgE находился в пределах нормативных значений, у второй – был повышен. Так аллергическая форма заболевания была выявлена у 74%, неаллергическая – у 26% обследованных нами пациентов. В исследование были включены пациенты с площадью поражения кожи более 10% с умеренными и выраженными клиническими проявлениями заболевания. Характеристика пациентов с АД, включенных в исследование, представлена в таблице 1. Все пациенты получали стандартную терапию в виде мембраностабилизирующих препаратов. При необходимости назначались антигистаминные препараты II поколения и топические глюкокортикостероиды.
Таблица 1
Характеристика обследованных больных
Показатели
|
Неаллергическая форма АД
N=11 (26%)
|
Аллергическая форма АД
N=31 (74%)
|
Возраст (годы)
|
20±1,1
|
23±1,4
|
Длительность
заболевания (годы)
|
20±1,6
|
22±1,5
|
Пол:
мужчины
женщины
|
4
7
|
13
18
|
Степень тяжести:
средняя
тяжелая
|
8
3
|
17
14
|
Степень выраженности клинических проявлений:
умеренные
выраженные
|
7
4
|
16
15
|
SCORAD (баллы)
|
43±4,6
|
64±3,5
|
DLQI (баллы)
|
8±1,7
|
12±1,3
|
В качестве экспериментального метода лечения у больных АД проводилась иммунотерапия активированными аутологичными Т-лимфоцитами. Протокол клинических исследований «Иммунотерапия с использованием аутологичных активированных Т-клеток в лечении больных атопическим дерматитом» утвержден на ученом совете НИИ КИ СО РАМН №9 от 29.11.05. В группу, получивших клеточную терапию, было включено 29 пациентов (10 мужчин и 19 женщин) в возрасте от 17 до 49 лет (средний возраст 23±1,3 года). Длительность заболевания колебалась от 7 до 48 лет (средняя длительность заболевания 21±1,3 год). Обследуемые больные характеризовались средней (19 человек – 66%) и тяжелой степенью тяжести (10 человек – 34%) заболевания. Значения индекса SCORAD исходно составляло 51±4,2 балла, индекс качества жизни (DLQI) был 9,5±1,5 баллов. С неаллергической формой заболевания было 6 пациентов (21%), с аллергической формой - 23 (79%).
После получения информированного согласия, пациентам подкожно вводили активированные аутологичные Т-лимфоциты с кратностью 1 раз в неделю – 4 инъекции, далее 1 раз в месяц, всего 10 инъекций. Протокол обследования и клеточной иммунотерапии соответствовал этическим стандартам и был разрешен Локальным этическим комитетом НИИ КИ СО РАМН.
Оценка состояния пациентов в процессе лечения проводилась по клиническим и лабораторным показателям. Отслеживалось возникновение местных и общих побочных реакций.
Для разных целей из венозной цельной или гепаринизированной крови выделяли стандартными методами лейковзвесь, мононуклеарные клетки и сыворотку. Количество лейкоцитов считали в камере Горяева.
Для поверхностного маркирования иммунокомпетентных клеток использовались моноклональные антитела к CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25, CD28, HLA-DR, CD45RO, СD45RA, меченные флюоресцеином изотиоцианатом (FITC), фикоэритрином (PE), перидинин хлорофилл протеином (PerCP) и аллофикоцианином (APC) в количестве, рекомендуемом производителем (Сорбент и МедБиоСпектр, Москва, Россия; BD Biosciences Pharmingen, USA). Процент лимфоцитов определяли с помощью проточного цитометра FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) в программе CellQuest (Becton Dickinson, USA), используя параметры прямого (FSC), бокового (SSC) светорассеяния и канала флюоресценции (FL-2).
Для определение внутриклеточных цитокинов в субпопуляцих Т-лимфоцитов МНК периферической крови культивировали в течение 4 часов в присутствии стимулятора РМА (30 нгр/мл), кальциевого ионофора иономицина (1 мкгр/мл) и ингибитора белковой секреции брефелдина А (10мкгр/мл) при 37С в атмосфере, содержащей 5% СО2. После окончания культивационного периода производилось поверхностное маркирование клеток моноклональными анти-СD4-PerCP или анти-CD8-PerCP антителами. Затем клетки фиксировались 1% раствором параформальдегида, и пермеабилизировались 0,02% раствором Твин-20. Далее производилось внутриклеточное маркирование моноклональными анти-IFN--FITC и анти-IL-4-РЕ антителами. Фиксация производилась 5% раствором формалина. Относительное количество цитокин-продуцирующих клеток определяли методом трехцветной проточной цитометрии.
Исследование фагоцитоза и продукции перекиси водорода использовался латекс, нагруженный гамма глобулином (Биопрепарат, Санкт-Петербург), меченный FITC. Иммуноцитометрию проводили с помощью проточного цитометра FACSCalibur (Becton Dickinson, USA).
Исследование продукции перекиси водорода фагоцитами проводили в 96-луночных планшетах для иммуноферментного анализа. Стимуляцию продукции перекиси водорода выражали как показатель активации нейтрофилов (ПАН) в пробах с лейкоцитами и показатель активации моноцитов (ПАМ) в пробах с мононуклеарами с помощью ИФА-ридера Multiscan MS (Labsystems, Финляндия).
Активность эффекторов ГЗТ оценивали разработанными в лаборатории иммунопатологии НИИКИ СО РАМН методами. Лейковзвесь после образования осадка при 4°С инкубировали с антигенами или митогенами при 37°С с последующим удалением неприлипших клеток и учетом миграции по количеству прилипших клеток в опыте (субоптимальная доза - опыт I, оптимальная доза - опыт 2) и контроле (без антигена или митогена). Отношение количества клеток в опыте I к контролю оценивает ответ лейкоцитов на антиген усилением миграции (индекс миграции), отношение количества клеток в опыте 2 к контролю - торможение миграции (индекс ингибиции миграции), отношение количества клеток в опыте I к таковому в опыте 2 составляет показатель эффекторных функций ГЗТ в ответ на данный стимул (ПЭФ) in vitro [Кожевников В.С., 1990, Лозовой В.П., 1990].
Уровень иммуноглобулиров A, M, G в сыворотке крови определялся на многоканальном спектрофотометре с использованием набора реагентов для определения содержания иммуноглобулинов A, M, G, (ЗАО «НПО СИНТЭКО», Россия) согласно инструкции. Уровень IgE определялся методом ИФА, используя набор реагентов согласно инструкции (ООО «Хема-Медика», Россия).
Определение длины теломерных районов ДНК проводили методом Flow-FISH. В качестве клеток внутреннего контроля и стандарта гибридизации были использованы спленоциты мышей линии C57BL/6 (Питомник «Рассвет», г. Томск). Клетки после инкубации с мышиными биотинилированными анти-CD4 и анти-CD8 антителами (Becton Dickinson, США), отмывали ЗФР-БСА, затем проводили последовательные инкубации со стрептавидином, меченым флуорохромом Cy5 и 4 мМ раствором BS3 (Bis(sulfosuccinimidyl)suberat, Pierce, USA). Для остановки реакции в суспензию клеток добавляли 1 M Tris в конечной концентрации 20 мМ реакции, отмывали ЗФР-БСА. Сначала определяли относительную длину теломерных повторов ДНК на клетку, для чего 500х103 лейкоцитов смешивали с таким же количеством спленоцитов мыши и проводили гибридизацию с 300 мкл раствора, состоящего из 70% формамида (Sigma, США), 20мМ Tris (pH=7,1) (Sigma, США) и 1% БСА. Добавляли 0,3 мкг/мл флуоресцин-(СССТАА)3 Peptide Nucleic Acid (PNA) зонд (EUROGENTEC Ltd, Belgium), комплементарный к теломерной последовательности ДНК. Затем клетки переносили в пробирки для цитометрии (Falcon 2058), дважды отмывали 70% формамидом, содержащим 0,1% БСА, 0,1% Tween 20 (Sigma, США) и 10мМ Tris (pH=7,1), и однократно ЗФР-БСА, содержащим 0,1% Tween 20. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл ЗФР-БСА, содержащем 25мкл/мл РНКазы и 2мкл/мл 7-Аминоактиномицина D (7-AAD) (ICN Biomedicals Inc, США). Пробы анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США). Сигнал флуоресценции теломер определяли как средний уровень флуоресценции клеток, находящихся в G0/G1 фазе клеточного цикла, вычитанием фоновой аутофлуоресценции. Относительные значения определяли как отношение MFI исследуемого образца к MFI спленоцитов мыши. Оценка абсолютной длины теломерных повторов ДНК на клетку проводилась пересчетом по формуле y = 2042 + 28099*x («у»–абсолютная длина в парах нуклеотидов, «х»–длина теломерных повторов ДНК относительно клеток внутреннего контроля) [Борисов В.И., 2007].
Способ получения активированных аутологичных Т-лимфоцитов. Лейковзвесь, полученную из 200 мл периферической крови собирали, разбавляли забуференным физиологическим раствором с ЭДТА (ЗФР-ЭДТА), содержащим на 100 мл раствора 2 мг тиенама (MSD, Швейцария), 125 мкл гентамицина (KRKA) и 500 мкл FBS (Fetal Bovine Serum, HyClone); центрифугировали в градиенте фиколл-верографин (Sigma, Швеция). Образовавшееся кольцо мононуклеарных клеток собирали и отмывали трижды ЗФР-ЭДТА. Клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл полной среды RPMI 1640 (ФГУП ГНЦ ВБ Вектор) (с добавлением 2 мг тиенама, 125 мкл гентамицина и 30 мг L-глутамина (ФГУП ГНЦ ВБ Вектор) на 100 ml среды) и подсчитывали количество клеток в камере Горяева. Полученные МНК садили в культуральные матрасы (NUNC, Италия) из расчета 2 млн клеток на 1 мл полной среды с 10% FBS и активаторами (1 мкл/мл антиCD3 антител (НПЦ МедБиоСпектр) и 50 ед/мл IL-2 (ООО Биотех)). На 5-6 день (по состоянию культуры) заменяли 70% среды на новую с таким же составом. На 10-14 день клетки собирали, после осаждения фасовали 30 млн клеток на 1 мл в криопробирки, содержащие FBS и 10%DMSO (Riedel-deHaёn, Германия). Хранили при -800 С. Перед введением к клеткам добавляли 10 мл физиологического раствора, осаждали в течение 5 минут при 1 тыс. об/мин, ресуспендировали в 2 мл физиологического раствора и в таком виде вводили пациентам.
Статистические исследования проводили по общепринятым математическим алгоритмам с использованием пакетов программ “Statistica V. 6.0” [Боровиков В.П., 1997].
|
