Цикл оксида азота и его регуляция в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности

Скачать 1.31 Mb.

Название	Цикл оксида азота и его регуляция в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности
страница	3/9
Тип	Автореферат

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Автореферат

1 2 3 4 5 6 7 8 9

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на базе клинических и научных подразделений ФГБУ «Ростовского НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России.

Обследовано 150 беременных в возрасте 20-35 лет, находившихся под наблюдением в клинических подразделениях ФГБУ «Ростовского НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России и давших информированное согласие на расширенный алгоритм обследования.

Контрольную группу составили 55 здоровых женщин с неосложненной гестацией: 10 беременных – в 15-19 недель, 12 – 20-23 нед., 13 – 24-27 нед. и 20 – 39-40 недель беременности. В основные группы вошли 95 женщин с различными осложнениями гестации: с плацентарной недостаточностью – 25 беременных в 15-27 недель и 20 – в 39-40 недель гестации; с задержкой роста плода – 16 женщин в 15-27 недель и 15 – в 39-40 недель беременности. У 19 женщин имели место преждевременные роды.

Диагнозы плацентарная недостаточность и задержка роста плода были поставлены на основании комплексного динамического обследования, в ходе которого при функциональных исследованиях использовались: анализатор Humalyzer 2000 human (Германия), ультразвуковой аппарат Toshiba SSA-340A с цветным допплеровским картированием (Япония), фетальный кардиомонитор с компьютерной обработкой Oxford Sonicaid Team Duo (США),

Критериями для включения женщины в исследование служили: снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока при допплерометрии, выявление анамнестических факторов риска, обнаружение признаков внутриутробной гипоксии плода при проведении кардиотокографии, отставание роста плода по данным ультразвуковой биометрии, гормональные исследования и определение активности специфических плацентарных изоферментов (щелочной фосфатазы и глутаматдегидрогеназы).

В исследование взяты околоплодные вода и плодные оболочки вышеуказанных женщин.

Околоплодные воды получали при их отхождении или амниотомии в I периоде родов (36-37 нед., 39-40 нед.), а так же путем проведения амниоцентеза (15-27 нед.).

Показаниями к амниоцентезу служили: изосерологическая несовместимость крови матери и плода, хроническая гипоксия плода (перенашивание беременности, гестоз, экстрагенитальные заболевания матери и т.д.), установление степени зрелости плода, антенатальная диагностика пола, необходимость кариотипирования при подозрении на пороки развития плода, микробиологическое исследование.

Для исследования брали 10-15 мл околоплодных вод. Непригодными считали пробы, загрязненные кровью или меконием.

Плодные оболочки получали путем отделения их от последа в процессе родов и затем промывали от крови и мекония физиологическим раствором.

Перед исследованием проводили пробоподготовку материала.

Околоплодные воды центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин.

Плодные оболочки после родов гомогенизировали следующим образом. Навеску ткани, отмытую от крови, быстро измельчали ножницами и затем гомогенизировали в ступке с кварцевым песком, затем центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин, в опыт брали экстракт.

Соотношение ткань/среда (вес/объем) соответствовало 10% (500 мг ткани на 4,5 мл среды) (Серебров В.Ю., 2008).

В качестве среды использовали фосфатный буфер (pH 7,4; 0,1 М) (для определения активности NO-синтазы) и физиологический раствор (NaCl 0,09%) (для остальных методик).

Все этапы и процедуры приготовления гомогената проводили максимально быстро и на холоде. Оптимальная температура составляла +2^◦С. Посуда, инструменты и растворы, используемые для получения гомогената, были предварительно охлаждены до этой температуры.
Определение содержания оксида азота (его метаболитов NO₂^-, NO₃^-.)

Уровень оксида азота (эндогенный) в форме нитрит-аниона (NO₂^-) определяли с помощью классической реакции Грисса после его энзиматического восстановления нитратов в нитриты (L. Green et al., 1982), обозначаемых в литературе NO_x.

В пробирку с 0,8 мл 10% ZnSO₄ и 0,8 мл 0,5N NaOH добавляли 0,4 мл исследуемого материала и центрифугировали 10 мин. при 3000 об/мин. После чего отбирали 1 мл надосадочной жидкости и добавляли 1 мл раствора Грисса. Регистрацию результатов проводили на спектрофотометре Varian «Саrу-50» (США) при длине волны 520 нм. Значение концентрации определяли в мкмоль/л.

Для получения 0,5н NaOH разводили 4г NaOH до 200 мл прокипяченной дистиллированной H₂O.

Раствор Грисса готовили следующим образом: в 180 мл 12% CH₃COOH разводили 20 грамм коммерческого реактива Грисса (Грисса реактив; чда, ООО "Альфа-Трейд").
Определение активности нитрооксидсинтазы (NO-синтазы, NOS).

Активность NO-синтазы (КФ 1.14.13.39) оценивали по увеличению содержания оксида азота по уровню его метаболитов из L-аргинина в присутствии NADPH (Di Julio J.L. Gude N.M., 1994).

Определение активности NO-синтазы осуществляли следующим образом.

В опытные пробы, содержащие 0,5 мл пробы, добавляли 0,5 мл 0,1М раствора L-аргинина и 0,1 мл 0,05М раствора NADPH, приготовленных на 0,2М фосфатном буфере (рН 7,4). Инкубировали 30 минут при 37^оС. Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В контрольные пробы, содержащие все вышеперечисленные компоненты, сразу добавляли осаждающие реактивы (ТХУ 10%). Все пробы центрифугировали 10 минут при 3000 оборотах в минуту.

Из опытных и контрольных проб отбирали по 1 мл центрифугата. В качестве стандартной пробы использовали раствор азотистокислого натрия, содержащий в мл – 1 мкг NO. В каждую пробу приливали 1 мл 10% раствора реактива Грисса и колориметрировали на спектрофотометре Varian «Саrу-50» (США) при длине волны 520 нм.

Активность NO-синтазы выражали в мкмоль/л.

Расчет проводили по формуле:

, где

E₀ – экстинкция опытной пробы,

E_k – экстинкция контрольной пробы,

E_ст – экстинкция стандартной пробы,

30 – молекулярная масса NO,

1000 – расчет на литр исследуемого материала.
Для определения активности NO-синтазы использовали реактивы, приготовленные следующим образом:

0,1 мМ раствор L-аргинина готовили из расчета – 3,5 мг в пробе ex tempora.
0,1 мМ раствор НАДФН готовили из расчета – 4,1 мг в пробе ex tempora.
Фосфатный буфер (0,1М; pH 7,4) – путем смешивания 81 мл 0,2М р-ра Na₂HPO_4безв и 19 мл 0,2М р-ра NaH₂PO₄2H₂O, с последующим доведением до 200 мл H₂O дистиллированной.
Раствор 10% ТХУ готовили путем растворения 10 грамм сухой трихлоруксусной кислоты в 90 мл в H₂O дистиллированной.
Раствор реактива Грисса.

Определение активности аргиназы

Активность аргиназы (КФ 3.5.3.1.) определяли колориметрическим методом (Н.У. Тиц, 2003) по увеличению продукции мочевины из L-аргинина. Количественную оценку образованной мочевины проводили с помощью ферментативного определения, основанного на разложении мочевины под действием уреазы на углекислый газ и аммиак (последний в реакции с натрия салицилатом и натрия гипохлоритом в присутствии натрия нитропруссида образует окрашеный продукт, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации мочевины в пробе (Меньшиков В.В., 1987)).

Определение активности аргиназы осуществляли следующим образом.

В опытные пробы, содержащие 0,1 мл пробы, добавляли 0,35 мл глицинового буфера (0,05 М, pH 9,5) и 0,05 мл 0,007М раствора L-аргинина. Инкубировали 15 минут при 37^оС. Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 10% раствора ТХУ.

В контрольные пробы, содержащие все вышеперечисленные компоненты, сразу добавляли осаждающий реактив (ТХУ). Все пробы центрифугировали 15 минут при 3000 оборотах в минуту.

Из опытных и контрольных проб отбирали по 0,01 мл надосадочной жидкости. В каждую пробу приливали 0,25 мл рабочего реагента 1, приготовленного по инструкции коммерческого набора для ферментативного определения мочевины (ЗАО «ВекторБест», Новокарб, Россия) и термостатировали 5 минут при 37^оС, затем приливали по 1 мл рабочего реагента 2 и рабочего реагента 3, снова термостатировали 5 минут при 37^оС.

В качестве стандартной пробы использовали раствор мочевины, содержащий в милилитре 5 мкг мочевины.
В контрольную пробу добавляли все вышеперечисленные рабочие реагенты, вместо исследуемого материала добавляли соответствующее количество дистиллированной воды.

Пробы колориметрировали против контроля на спектрофотометре Varian «Саrу-50» (США) при длине волны 578 нм.

Активность аргиназы выражали в мкмоль/(мин•мг)

Расчет проводили по формуле:

Удельная активность фермента

, где

ΔС – количество образованной мочевины;

t – время инкубирования;

С – количество общего белка в (пробе), которое определяли по методу Лоури (Lowry O.H. et al., 1951).
Для реализации методики использовались следующие реактивы:

1. Глициновый буфер (0,05 М; pH 9,4), приготовленный путем смешивания 50 мл 0,2 М р-ра глицина и 19,6 мл 0,2 М NaOH с последующим доведением до 200 мл H₂O дистиллированной.

2. Раствор аргинина 0,007 М (доведение 74 мг сухого вещества до 50 мл мл H₂O дистиллированной).

3. Раствор 10% ТХУ.

4. Рабочие реагенты готовили из прилагающихся готовых реагентов, согласно прописанной методике коммерческого набора:

4.1. Рабочий реагент 1 готовили путем объединения Реагента 1 (раствора уреазы в фосфатном буфере) и Реагента 4 (фосфатного буфера) с последующим доведением смеси до 100 мл H₂O дистиллированной.

4.2. Рабочий реагент 2 – путем разведения Реагента 2 (раствора натрия салицилата и натрия нитропруссида) до 400 мл H₂O дистиллированной.

4.3. Рабоий реагент 3 – разведением Реагента 3 (натрия гипохлорита и натрия гидроокиси) до 400 мл H₂O дистиллированной.

Определение содержания аминокислот (L-аргинина, L-пролина, L-цитруллина)

Аминокислотный состав плодных оболочек и околоплодных вод определяли методом капиллярного электрофореза с помощью системы «Капель-105».

Идентификацию и количественное определение свободных форм аргинина, пролина и цитруллина выполняли методом капиллярного электрофореза с использованием немодифицированного кварцевого капилляра («Капель-105», «Люмэкс», С.-Петербург, Россия).
Принцип метода.

Капиллярный электрофорез – это метод анализа сложных смесей (зачастую, смесей биомолекул), основанный на использовании электрокинетических явлений (возникающих в растворах при помещении их в электрическое поле высокого напряжения) – электромиграцию ионов и других заряженных частиц и электроосмос – для разделения и определения компонентов.

В целом, капиллярный электрофорез основан на тех же принципах, что и классический вариант, но имеет особенность в разделении веществ, связанную с наличием электроосмотического потока (ЭОП). Эта величина сильно зависит от значений рН буфера и от свойств поверхности капилляра.

На заряженную частицу в простейшем случае действуют две противоположно направленные силы – электростатического притяжения и сопротивления движению частицы. Заряженные частицы под действием электрического поля обычно перемещаются в растворе с различной скоростью.

Для проведения анализа тонкий кварцевый капилляр длиной от 20 до 100 см заполняется раствором ведущего электролита и опускается концами в два сосуда, содержащих тот же электролит. В сосуды вводятся электроды, к которым может прикладываться разность потенциалов.

Со стороны анода вводят небольшой объем (несколько нл) раствора пробы, после чего к буферным растворам прикладывают напряжение (до 30 кВ), ЭОП начинает переносить зону пробы к катоду. При этом проба некоторое время находится в капилляре под воздействием возникающего электрического поля высокой напряженности, вызывающего миграцию зоны пробы. В течение этого времени компоненты пробы, имеющие заряды и отличающиеся от компонентов рабочего буфера, перемещаются в соответствии с присущими им электрическими подвижностями, специфичными для каждого компонента.

Зарегистрированное на записи с помощью детектора появление компонентов на выходе из капилляра называется электрофореграммой и может служить основой для качественного и количественного анализа смеси.
Перед проведением анализа образцы амниотической жидкости и гомогената плодных оболочек обрабатывали 10% раствором трихлоруксусной кислоты с целью депротеинизации. Далее пробы центрифугировали в течение 15 минут при 5500 об/сек. Полученный надосадочный раствор использовали для проведения анализа.

Перед началом работы капилляр последовательно промывали 1М раствором соляной кислоты, дистиллированной водой, 0,5 М раствором гидроксида натрия, и буферным раствором (20мМ боратный буфер, рН 9,15). Время ввода пробы 15 сек при давлении 30 мбар, рабочее напряжение – 20 кВ. Использовали прямое спектрофотометрическое детектирование при 200 нм. Все исследования проводили при температуре 30 С.

Обработку данных проводили при помощи IBM PC с программным обеспечением «Мультихром» (АО «Амперсенд»).

Использовались следующие реактивы:

Стандарты аминокислот коммерческие (L-arginine monohydrochloride, Sigma®, Reagent Grade ≥ 98%), L-Proline, Sigma®, ReagentPlus™, L- Citrulline, Sigma®, ReagentPlus™);
Соляная кислота, х.ч. ГОСТ 3118-77;

3. 0,5 М раствор гидроксида натрия;

4. Натрий тетраборнокислый, стандарт-титр ТУ 6-09-2540-87 и натрий тетраборнокислый десятиводный, х.ч. ГОСТ 4199-76

Определение содержания пероксинитрита, NO-глутатиона, NO-тирозина

О степени инактивации NO судили по количественному содержанию пероксинитрита, которое определяли спектрофотометрически (Лобышева и др., 1999).

Оксид азота способен взаимодействовать с супероксид-анион радикалом (О₂^-) и О₂^* с образованием пероксинитрита (ONOO^-), который является относительно долгоживущей молекулой.
В опытных пробах определяли количество общего белка методом Лоури (Lowry O.H. et al., 1951). Исходя из полученного результата, разводили опытные пробы из расчета 1 мг белка на 1 мл исследуемого материала.

Далее определяли содержания пероксинитрита, NO-глутатиона и NO-тирозина спектрофотометрически против физиологического раствора при длинах волн 302 нм, 338 нм и 438 нм соответственно.
Статистическая обработка данных.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 5.1, фирмы StatSoft.Inc.) и Excel -2002. Достоверность различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990) и его аналогу для непараметрических распределений – критерию Манна-Уитни (U-критерий). Однородность дисперсий проверяли по критерию Фишера. Контроль статистической значимости полученных результатов осуществлялся комплексом современных статистических методов, включая методы рандомизированного тестирования. Достоверными считались различия при р < 0,05. Корреляционный анализ выполнен методом Спирмена c расчетом коэффициента ранговой корреляции (r) и вычислением его средней ошибки.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

	Профилактика стоматологических заболеваний у женщин с физиологической... Работа выполнена в гоу впо «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»		Инструкция по применению назначение для in vitro диагностики Тест-набор «Amnioquick» для диагностики подтекания околоплодных вод при разрыве плодных оболочек
	Инструкция по применению назначение для in vitro диагностики Тест-набор «Amnioquick» для диагностики подтекания околоплодных вод при разрыве плодных оболочек		Ooo "св-робот" Компьютерные курсы рабочая программа Переменные, операции, выражения в php. Типы переменных. Изменение типа переменной. Динамические переменные. Константы. Комментарии....
	Препарата: Азота закись Итак, речь пойдет о проектировании, создании и установке системы впрыска мокрой закиси азота с нуля как в буквальном смысле, так...		Периферическое кровообращение и его регуляция у мужчин с артериальной... Работа выполнена в гоу дпо «Российская медицинская академия последипломного образования Минздравсоцразвития России»
	Конспект уроков по теме "Алюминий" Обучающая ознакомление с физическими и химическими свойствами алюминия, его оксида и гидроксида; доказательство их амфотерности		Руководство по эксплуатации мрбп. 413347. 014 Рэ Газоанализатор предназначен для автоматического, непрерывного измерения концентрации кислородa (О2), оксидa углерода (CO), сероводородa...
	Практическая работа №6 9 класс Тема «Получение оксида углерода (... Цель: Получить оксид углерода (IV) и изучить его свойства. Научиться распознавать карбонаты		Роль цитокинов и иммуно-эндокринные взаимодейстВиЯ при воспалительных... Работа выполнена в Государственном учреждении «Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней» Академии наук Республики...
	С каждым годом все актуальнее встают вопросы лечения бесплодия, а... Функциональная диагностика и терапия бесплодия и патологии беременности с применением модели беременности в эпд, врт и брт		Урока Тема: «Практическая работа по теме «Получение оксида углерода(IV) и изучение его свойств» Программа: Новошинский И. И., Новошинская Н. С., Программа курса, тематическое и поурочное планирование. 9 класс:—М.: Русское слово,...
	618. 51. 8-06-089 Тоноян Лиана Агабеки тактика ведения родов при... ...		Органические вяжущие вещества, физико-химические основы их производства и применения У составу это либо сложные смеси высокомолекулярных углеводородов и их неметаллических производных серы, азота, кислорода (битумы...
	26. 04. 2012 в фгу «нцаги п им. В. И. Кулакова» при поддержке компании... Фгу «нцаги п им. В. И. Кулакова» при поддержке компании AmniSure® International состоялся очередной телемост, посвященный проблеме...		17. 05. 2012 в фгу «нцаги п им. В. И. Кулакова» при поддержке компании... Фгу «нцаги п им. В. И. Кулакова» при поддержке компании AmniSure® International состоялся очередной телемост, посвященный проблеме...

Цикл оксида азота и его регуляция в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Похожие: