Pseudomonas (Burkholderia) cepacia
Повсеместно распространенный микроорганизм, экология которого имеет много общего с таковой у Pseudomonas aeruginosa, но проявляющий меньшую вирулентность. Часто контаминирует препараты для местной анестезии слизистой оболочки верхних отделов дыхательных путей, растворы, применяемые при бронхоскопии, а также различные лекарства (включая антибиотики), используемые ингаляционно. Pseudomonas cepacia — подвижная полиморфная палочка, снабженная 3-8 полярно расположенными жгутиками (лофотрихи). Окисляет глюкозу, лактозу, мальтозу и маннит; резистентна к полимиксину В. По Граму часто окрашивается биполярно. Выделение требует применения селективных сред; температурный оптимум 30°С (некоторые штаммы могут расти при 35°С); на кровяном агаре с полимиксином В образует выпуклые мутные маслянистые беловато-серые колонии. Некоторые штаммы синтезируют метиламин, придающий культурам сладковатый запах; также возможно образование желтого или зеленоватого нефлюоресцирующего феназинового пигмента, растворимого в воде и хлороформе.
Pseudomonas (Burkholderia) mallei
Возбудитель сапа — инфекционного заболевания человека и животных; заболевание известно с древнейших времен (еще Аристотель считал сап заразной болезнью). Возможность заражения человека от животных впервые описал Оскандес (1783). Возбудитель выделили Леффлер, Шютц (1882) и Васильев (1883).
Распространение
Возбудитель неустойчив к действию факторов внешней среды; прямой солнечный свет убивает его за 24 ч, но в выделениях больных может сохраняться на свету в течение нескольких недель. Термолабилен — при 100°C погибает в течение нескольких минут, при 55-60°С — за 1-2 ч. В воде сохраняется до 30 суток. Помещения, в которых находились больные животные, представляют эпидемическую опасность в течение 6 недель. Преимущественно болеют чувствительные животные — лошади, ослы, верблюды, реже – козы, собаки и кошки. Среди лабораторных животных к возбудителю чувствительны хомячки и морские свинки. Заболевание человека носит выраженный профессиональный характер; основной путь заражения — контактный (при попадании возбудителя на поврежденную кожу и слизистую оболочку конъюнктивы). Также реальную опасность представляет использование зараженной воды. Довольно часто отмечают случаи лабораторных инфекций, при которых нельзя исключить воздушно-капельное заражение. Благодаря проведенным интенсивным профилактическим мероприятиям, в настоящее время сап не представляет серьезной эпидемической угрозы. Отмечают лишь спорадические случаи в Азии, Африке, Центральной и Южной Америке.
Морфология и тинкториальные свойства
Тонкие, слегка изогнутые палочки с закругленными концами размером 2-30,5-1 мкм; при выращивании in vitro склонны к полиморфизму (образуют более мелкие формы либо цепочки); неподвижны; спор не образуют. Окрашиваются анилиновыми красителями (часто окрашиваются биполярно).
Культуральные свойства
Растет на простых средах, дополненных 4-5% глицерина; растет в интервале 20-45°С (оптимум 37°С); оптимум рН 6,5-7,2. Строгий аэроб.
На жидких средах (например, МПБ с глицерином) первоначально образует мутную взвесь, а со 2-х суток начинает формировать пристеночный осадок и пленки; затем культура выпадает в осадок, образующий при вращении пробирки тяжи, поднимающиеся кверху. С поверхностной пленки на дно спускаются пленки. При хранении среда полностью не просветляется.
На полужидких средах (например, на желатине) наблюдают поверхностный сероватый налет, прорастающий в верхнюю часть линии укола (иногда в месте укола наблюдают желтоватое окрашивание); желатин не разжижается.
На плотных средах (например, агаре с глицерином) образует плоские полупрозрачные колонии, сливающиеся в прозрачный янтарный тягучий налет. На свернувшейся сыворотке образует мелкие мутные беловатые колонии (среду не разжижает). Дает характерный рост на картофельных пластинках — через 24 ч образует полупрозрачные колонии, позднее (через 6-8 суток) они сливаются, образуя полупрозрачные массы цвета меда (пигментирование проявляется только на картофельных средах и варьирует от сероватого до буровато-красного). Независимо от цвета налета колонии сохраняют прозрачность. Пигментообразование возможно только на картофельной среде.
Биохимия
Некоторые штаммы разлагают глюкозу, маннит, левулезу, глицерин с синтезированием кислоты без газа; палочки не синтезируют индол и не восстанавливают нитраты. Синтезируют H2S и аммиак на жидких средах; каталазо-положительны. Молоко свертывают медленно (10-12 суток), образуя незначительное количество кислоты; пептонизацию молока не вызывают.
Патогенез поражений
Развитие острой воспалительной реакции с формированием очагов гнойного расплавления тканей, обусловленного высвобождением эндотоксина. В редких случаях (при заражении небольшой дозой возбудителя или слабо вирулентным штаммом) в месте внедрения возбудителя наблюдают формирование гранулем и их казеозный некроз. Разрушение первичных очагов способствует лимфо- и гематогенному разносу Pseudomonas mallei по всему организму; процесс приобретает септико-пиемический характер с образованием абсцессов в мышщах и внутренних органах (наиболее часто в легких, печени, селезенке).
Клинические проявления
Инкубационный период составляет 1-5 суток; заболевание начинается остро, с подъемом температуры тела (затем она приобретает значительную амплитуду, как при сепсисе). В месте проникновения возбудителя последовательно образуются темно-красная папула, затем пустула с подрытыми краями и «сальным» дном. Часто формирование очагов сопровождает регионарный лимфангиит. Позднее (через 5-7 суток) отмечают вторичное множественное появление изъязвляющихся папул. Состояние больного резко ухудшается, обычно наблюдают проявления тяжелой плевропневмонии с кровохарканьем, реже клиническую картину обусловливают абсцедирующие поражения других органов. Летальность при острой форме достигает 100%. Хроническое течение протекает в 3 формах — кожной, легочной и носоглоточной. Наиболее распространена кожная форма, сопровождаемая множественными «холодными» абсцессами. Их самопроизвольное вскрытие ведет к образованию свищей с обильным отделяемым. При носоглоточной форме типичны слизисто-гнойное отделяемое, образование желто-зеленых корочек и распространение изъязвлений на зев и трахею. Легочные поражения проявляются ползучей плевропневмонией и мышечными абсцессами. Прогноз хронической формы также неблагоприятен; летальность может достигать 50% и выше.
Лабораторная диагностика
Основывается на выделении и идентификации возбудителя (рис. 12), а также на результатах кожных проб.
Все исследования проводят в условиях, необходимых для работы с возбудителями особо опасных инфекций. Для исследования забирают мокроту, гной, кровь и отделяемое вскрывшихся абсцессов или биоптаты закрытых абсцессов. При невозможности немедленного проведения анализа материал консервируют внесением 30% раствора глицерина (хранить следует не более 10-15 суток при температуре 4°С). Для подавления роста прочих микроорганизмов в среды вносят красители, например основной и кислый фуксин (1:100000), кристаллический фиолетовый (1:200000), бриллиантовый зеленый (1:1000000). При выделении подозрительных колоний проводят биологическую пробу на морских свинках (также можно использовать хомяков и кошек). Смешанную культуру вводят подкожно, чистую — внутрибрюшинно. На месте введения через 2-3 суток образуется опухоль-узелок, вскрывающаяся на 4-5 сутки с образованием язвы. На 3-10 сутки у морских свинок-самцов, зараженных внутрибрюшинно, развивается характерное поражение яичек (феномен Штрауса). Следует помнить, что феномен не патогномоничен для заболевания, и его можно вызвать заражением животных Pseudomonas aeruginosa, P. pseudomallei и другими микроорганизмами. Основные дифференцирующие признаки возбудителя: неподвижность, отсутствие способности образовывать газообразный азот, разжижать желатин и расти при температуре 42°С.
Аллергическая проба. В 1891 г русские ветеринарные врачи Х. Герман и О. Кальнинг предложили средство диагностики сапа – маллеин. При подозрении на сап больному внутрикожно (конъюнктивально) вводят маллеин (бактериальный аллерген, полученный из культур Pseudomonas mallei); реакция имеет больше эпидемиологическое, эпизоотическое значение, т.к. у больного положительная воспалительная реакция развивается на 2-3 неделе заболевания.
Серологические исследования. Наличие AT в сыворотке больных выявляют РА со специальным штаммом (ориентировочная концентрация микроорганизмов в суспензии не менее 1 млрд/мл), РСК (основная диагностическая реакция) и РНГА.
Рисунок 12. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителя сапа
Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei (палочка Уитмора)
Возбудитель зоонозов. У человека и животных вызывает мелиоидоз (болезнь Стэнтона-Флетчера, ложного сапа). Микроорганизм впервые выделил Уитмор (1911), в опубликованной (совместно с Кришнасвами) работе (1912) по случаям выявления мелиоидоза у морфинистов в Рангуне он указал на возможность заражения через грязные иглы и назвал его «септицемией морфинистов». Позднее Стэнтон и Флетчер (1932) изучили характер заболеваний грызунов, кошек, собак, лошадей и кроликов и показали, что основные случаи заболевания человека обусловлены употреблением пищевых продуктов, загрязненных испражнениями грызунов.
Распространение
Заболевания зарегистрированы в странах Юго-Восточной Азии (Индокитай, Филиппины, Шри-Ланка, Индонезия), Австралии (Северный Квинсленд) и Новой Гвинее. Эндемичные очаги выявлены на Мадагаскаре, в Центральной и Западной Африке, Иране и Турции. Спорадические случаи отмечают в Латинской Америке (Мексика, Панама, Эквадор, Гаити, Бразилия) и в США (Джорджия, Оклахома); в России достоверных случаев мелиоидоза человека не зарегистрировано. В периодической печати имеются сообщения о случаях мелиоидоза у ветеранов Вьетнамской войны, по-видимому, вдыхавших Pseudmonas pseudomallei в аэрозолях, распыляемых вертолетами ВВС США и Южного Вьетнама.
Резервуар инфекции — различные дикие (грызуны, кенгуру) и домашние (кошки, собаки, коровы, козы, овцы, свиньи, лошади) животные. В окружающую среду возбудитель попадает с мочой и испражнениями, а также с гнойным отделяемым слизистых оболочек глаз и носоглотки больных животных. Среди лабораторных животных к заражению чувствительны крысы, мыши, кролики и морские свинки.
В организм человека возбудитель проникает через слизистую оболочку ЖКТ вместе с инфицированной пищей, ингаляционно — в составе пылевого аэрозоля либо контактно, через повреждения кожных покровов. Случаи заражения от больного человека не зарегистрированы.
Морфология и тинкториальные свойства
Pseudomonas pseudomallei — полиморфная палочка размером 1,5 60,5 1 мкм; 24-48-часовые культуры представлены мелкими палочками с закругленными концами. Позднее образует цепочки клеток длиной до 20 мкм; в старых культурах преобладают кокковидные формы. Подвижна (лофотрих), снабжена 1-4 жгутиками. В мазках из чистых культур палочки располагаются одиночно, парами, короткими цепочками или «обоймами» по 5-7 штук, в мазках-отпечатках из органов — одиночно или компактными скоплениями. Анилиновыми красителями окрашивается биполярно; окраска по Ранту выявляет гранулярную цитоплазму, а по Романовскому-Гимзе — утолщенную оболочку, напоминающую капсулу.
Культуральные свойства
Факультативный аэроб, относительно неприхотлив и растет на синтетических средах с отдельными аминокислотами или аммонийными солями некоторых органических кислот. Также растет на дрожжевой воде, а в пресной воде может жить и размножаться до 18 месяцев. Оптимум рН 6,8-7,0; температурный оптимум 37°С.
На жидких средах образует выраженное помутнение (через 24-36 ч) и поверхностную пленку; последняя интенсивно окрашивается в оранжево-красный цвет после добавления нейтрального красного. Через 2-5 суток пленка грубеет, утолщается (до 5мм), среда постепенно просветляется, образуется рыхлый осадок. Культуры издают затхлый запах, напоминающий запах плесени.
На твердых средах (например, 5% глицериновом агаре) образует мелкие прозрачные, затем мутнеющие беловатые S-колонии с металлическим блеском. Также можно обнаружить и R-колонии. Сначала они прозрачны, а затем мутнеют, утрачивают правильную форму и сморщиваются. Нередко Pseudomonas pseudomallei образует М-колонии, напоминающие крупные (до 7 мм) куполообразные S-колонии. Диссоциацию наблюдают после 2-3 суток роста на питательной среде. На кровяном агаре растут быстро (через 96 ч колонии могут достигать 1 см), некоторые штаммы дают -гемолиз. На агаре с лактозой и бромтимоловым синим образуют прозрачные голубые колонии (через 48 ч), на 6-7 сутки они приобретают оранжевую окраску. Некоторые штаммы образуют золотисто-коричневый пигмент на картофельных и глицериновых средах. Отличие от возбудителя сапа — способность расти на средах без глицерина.
Биохимическая активность
Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, дульцит и декстрин, несколько отсроченно (к 7 суткам) — маннит, арабинозу, рамнозу, ксилозу, левулезу и раффинозу. Не образует индол и H2S; реакция Фогеса-Проскауэра отрицательна; медленно сворачивает и пептонизирует молоко: медленно разжижает желатин.
Патогенез
Внедрение возбудителя сопровождается незначительной воспалительной реакцией. Мигрирующие фагоциты поглощают Pseudomonas pseudomallei, однако фагоцитарные реакции носят незавершенный характер, и возбудитель диссеминирует по кровеносным и лимфатическим путям. В последующем процесс приобретает септико-токсемический характер с формированием абсцедирующих гранулем в различных органах, т.е. его проявления не имеют патогномоничных признаков и часто имитируют различные инфекции.
Клинические проявления
Инкубационный период варьирует от 2 до 14 суток; выделяют 4 основные формы инфекционного процесса — токсическую, острую, подострую и хроническую. Летальность при острых формах может достигать 50% и выше.
Лабораторная диагностика
Включает выделение (рис. 13), серологическое выявление Аг возбудителя, постановку биологической пробы и кожных проб с маллеином. Материалы для бактериологического исследования — кровь, мокрота, моча,
Рисунок 13. Принципиальная схема бактериологического выделения Pseudomonas pseudomallei
гнойное отделяемое из абсцессов и секционный материал (из органов, где имеются очаги поражения). Образцы, контаминированные сопутствующей микрофлорой (выявляют при микроскопии), обрабатывают пенициллином (1000 ЕД на 1 мл). Характерные особенности — медленный рост на кровяном агаре с образованием М-, S- и R-колоний кремово-оранжевого цвета; подвижность; способность к росту при температуре 42°С; способность гидролизовать желатин, аргинин и окислять глюкозу, мальтозу и лактозу. Биологическую пробу проводят на крысах (резистентны к возбудителю сапа) и морских свинках, заражаемых внутрибрюшинным введением соответственно 0,5 и 1 мл суспензии материалов; у самцов морских свинок может развиться феномен Штрауса. В зависимости от вирулентности штамма животные погибают на 3-15 сутки; их вскрытие выявляет характерные поражения внутренних органов и наличие микроорганизмов, которые следует изолировать и определить их биохимические свойства. Серологические исследования включают постановку РСК, РНГА, РА с сывороткой пациента; диагностическими титрами для РА считают разведение 1:640, для РСК — 1:20, для РНГА — 1:4 и выше.
Питательные среды для культивирования и идентификации псевдомонад
Среда Кинга А. Пептон — 20,0 г, глицерин — 10,0 г, калий сернокислый — 10,0 г, магний хлористый — 1,4 г, агар — 20,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл.
Среда Кинга В. Пептон — 20,0 г, глицерин - 10,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный — 1,5 г, магний сернокислый — 1,5 г,агар — 15,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл (рН 7,2).
Среда Мак-Конки. Пептон — 20,0 г, лактоза — 10,0 г, натрий хлористый — 5,0 г, таурохолат натрия — 5,0 г, нейтральный красный — 0,03 г, агар — 20,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл (рН 7,4).
Среда Хью-Лейвсена. Пептон — 2,0 г, агар - 3,0 г, натрий хлористый — 5,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный — 0,3 г, 0,2 %-ный водный раствор бромтимолового голубого — 15,0 мл, глюкоза — 10,0 г, дистиллированная вода — до 1000,0 мл.
Цетримидный агар. Пептон — 20,0 г, агар —13,0 г, магний хлористый — 1,4 г, калий сернокислый — 10,0 г, цетримид (цетилтриметиламмония бромид) - 0,3 г, глицерин — 10,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл (рН 7,2).
Селективная среда (Мороз, Бекбергенов, Афиногенов). Пептон — 20,0 г, агар — 10,0 г, калий сернокислый — 7,0 г, магний хлористый — 15,0 г, магний сернокислый — 1,5 г, цетилпиридиния хлорид — 2,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл (рН 6,8-7,0).
Среда с ацетамидом. Агар — 15,0 г, натрий хлористый — 5,0 г, магний сернокислый — 0,2 г, аммоний фосфорнокислый однозамещенный — 1,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный — 1,0 г, ацетамид — 20,0 г, вода дистиллированная — до 1000,0 мл (рН 6,7).
Среда Паллерони—Дудорова. Хлористый аммоний — 1,0 г, магний сернокислый — 0,5 г, железо аммоний цитрат — 0,05 г, хлористый кальций — 0,005 г, 0,33 М Na-К фосфатный буфер (рН 6,8) — до 1000 мл. Первые два ингредиента добавляют к буферному раствору и автоклавируют при 115°С 30 минут. Железа аммонийцитрат и хлористый кальций стерилизуют путем фильтрации и вносят в основной раствор асептически (перед засевом среды).
Картофельно-глицериновая среда. Вырезанные из очищенного картофеля цилиндры диаметром 1 см и длиной 4-5 см разрезают по диагонали для получения клиньев. Клинья выдерживают 2 ч в 1%-ном растворе бикарбоната натрия, после чего подсушивают и в течение 2 суток вымачивают в 5-6%-ной глицериновой воде или бульоне. Опускают основанием вниз в пробирки с 5%-ной глицериновой водой. Для того чтобы картофель не касался глицериновой воды, используют пробирки с перетяжкой в нижней части или в них опускают короткие стеклянные палочки. Среду автоклавируют при 115-120°С 20 минут.
Пробирки со средой хранят в наклонном положении плоской поверхностью картофеля вниз (с целью сохранения поверхности для посева влажной).
|
