2.2 Учебно-методический комплекс документов учебного курса по дисциплине «Молекулярная биология митохондрий»
(Направление 020501 «Биоинженерия и биоинформатика»)
Цели и задачи учебного курса.
Митохондрии – клеточные органеллы, возникшие в результате симбиоза свободноживущих бактерий и предков эукариотических клеток. Митохондрии являются полуавтономными органеллами, и ряд основных процессов молекулярной биологии этих органелл существенно отличается от такового в цитоплазме клетки. Поэтому фундаментальные знания об устройстве митохондриального генома, передаче и реализации наследственной информации, закодированной в митохондриальной ДНК, абсолютно необходимы для исследования любого клеточного процесса, находящегося во взаимосвязи с любой из этих многочисленных функций. Кроме того мутации в митохондриальном геноме вызывают тяжелые наследственные заболевания, для лечения которых актуальна разработка методов генной терапии.
Целью учебного курса «Молекулярная биология митохондрий» является приобретение студентами базовых знаний в области молекулярной биологии митохондрий.
Основными задачами изучения учебного курса являются:
Получение знаний о митохондриальных геномах, их строении, уникальных особенностях и разнообразии.
Получение представлений о митохондриальном протеоме, его основных изменениях в ходе эволюции.
Получение представлений об основных моделях репликации миохондриальной ДНК, структуре и функциях основных ферментов репликации.
Получение знаний об основных типах репарации митохондриальной ДНК и механизмах short patch BER и long patch BER.
Получение знаний о транскрипции митохондриальной ДНК, основных транскрипционных факторах и механизмах их работы.
Получение знаний о процессинге митохондриальных РНК и регуляции их стабильности.
Получение знаний о механизмах митохондриальной трансляции в сравнении с прокариотической.
Получение знаний о механизмах транслокации белков и РНК через внешнюю и внутреннюю митохондриальные мембраны.
Получение знаний о генетике митохондрий, митохондриальных болезнях и разработке подходов к их лечению.
Умение работать со специальной литературой в предметной области.
Место дисциплины «Молекулярная биология митохондрий» в образовательном модуле
Учебный курс "Молекулярная биология митохондрий" может преподаваться параллельно преподаванию курса «Структура и функция митохондрий» и должен предшествовать курсу «Биологическая роль митохондрий на клеточном и организменном уровне» и курсу «Принципы разработки митохондриально-адресованных лекарств».
Объем учебного курса составляет 3 зачетные единицы (108 ч), из них 60 часов - аудиторные занятия, 8 часов – индивидуальная работа со студентами, 40 часов – самостоятельная работа студентов. При очной форме обучения аудиторные занятия включают лекционные, семинарские и практические занятия. Индивидуальная работа со студентами предусматривает проведение консультаций по темам лекций и семинаров и при подготовке к зачету. Самостоятельная работа студентов имеет своей целью проработку лекционного материала, подготовку к семинарским занятиям и направлена на обучение студентов самостоятельной работе со специальной литературой. Изучение учебного курса завершается сдачей зачета.
Дисциплина базируется на курсах «Биохимия», «Физическая химия», «Молекулярная биология», «Органическая химия», «Клеточная биология».
В результате освоения учебного курса «Молекулярная биология митохондрий» обучающийся должен:
Знать особенности устройства митохондриальных геномов, их основные регуляторные элементы, основные модели репликации митохондриальной ДНК, типы репарации в митохондриях, механизм репарации BER, основные ферменты транскрипции, механизм работы РНК-полимеразы, транскрипционных факторов TFAM и MTERF1, основные этапы процессинга митохондриальных РНК, основные механизмы танслокации белков и РНК через митохондриальные мембраны, механизм митохондриальной трансляции, его отличия от такового прокариотической и цитоплазматической трансляции, основы генетики митохондрий, причины наиболее распространенных митохондриальных заболеваний и разрабатываемые подходы к их диагностике и лечению.
Уметь: самостоятельно находить и критически анализировать научную литературу в области молекулярной биологии митохондрий; применять полученные знания в области молекулярной биологии митохондрий для сопоставления патологических проявлений заболеваний и возможных нарушений в основных процессах, протекающих в митохондриях; применить знания в области молекулярной биологии митохондрий для предсказания влияния того или иного химического вещества на их функцию, а также для научного обоснования прогноза физиологических последствий этого влияния; прогнозировать патологические последствия дисфункции митохондрий на клеточном уровне; определять последовательность митохондриальной ДНК; диагностировать гетероплазию митохондриальной ДНК.
Владеть: навыками поиска и анализа научной литературы в области молекулярной биологии митохондрий; навыками, необходимыми для освоения теоретических основ и методов митохондриальной биологии.
Содержание учебного курса «Молекулярная биология митохондрий»
Раздел 1. Строение, функции и происхождение митохондрий.
Тема 1.1. Краткая история изучения митохондрий
Тема 1.2. Функции митохондрий - биохимия дыхания, апоптоз, кальциевая регуляция, сборка железо-серных кластеров, митохондриальная теория старения.
Тема 1.3. Происхождение митохондрий - теория симбиогенеза. Разнообразие митохондрий и их геномов.
Раздел 2. Строение митохондриальных генома и протеома.
Тема 2.1. Эволюция митохондриального протеома: основные тенденции.
Тема 2.2. Структура митохондриальной ДНК: организация нуклеоида, формы митохондриальной ДНК, митохондриальный генетический код.
Тема 2.3. Основные элементы митохондриального генома человека: гены и регуляторные участки – ориджины и промоторы.
Раздел 3. Репликация митохондриальной ДНК.
Тема 3.1. Основные модели репликации митохондриальной ДНК : Strand displacement model - однонаправленный ассиметричный синтез, Strand-coupled model -двунаправленный синтез с образованием θ-cтруктур, RITOLS (RNA Incorporated Through Out Lagging Strand) – синтез с образованием промежуточных продуктов, содержащих протяженные участки РНК.
Тема 3.2. Инициация репликации
Тема 3.3. Основной фермент репликации - ДНК-полимераза гамма: структура и особенности работы.
Тема 3.4. Вспомогательные ферменты репликации: хеликазы, белок SSB, топоизомеразы, РНКазы.
Раздел 4. Метилирование митохондриальной ДНК
Тема 4.1. Функциональное значение метилирования ядерной и митохондриальной ДНК.
Тема 4.2. Бисульфитное секвенирование – основной метод для определения метилированных остатков цитозина.
Тема 4.3. Митохондриальные формы метилтрансфераз.
Раздел 5. Репарация митохондриальной ДНК
Тема 5.1. Возможные причины повышенной частоты мутаций в митохондриальном геноме.
Тема 5.2. Анализ распределения различных мутаций по митохондриальному геному и отдельным цепям митохондриальной ДНК
Тема 5.3. Виды репарации в ядре и митохондриях.
Тема 5.4. Основные виды повреждения азотистых оснований и ферменты, участвующие в их репарации.
Тема 5.5. Механизм Base excision repair (BER) в митохондриях: основные стадии и ферменты.
Тема 5.6. Регуляция репарации в митохондриях.
Раздел 6. Транскрипция митохондриальной ДНК
Тема 6.1. Структура РНК-полимеразы POLRMT:основные функциональные участки, РРR-мотивы.
Тема 6.2. Транскрипционные факторы TFB1M и TFB2M
Тема 6.3. Транскрипционный фактор TFAM –основной регулятор состояния митохондриальной ДНК в нуклеоиде.
Тема 6.4. Терминация транскрипции. Механизм терминации MTERF1. Другие белки семейства MTERF.
Раздел 7. Процессинг митохондриальных РНК.
Тема 7.1. Процессинг митохондриальных РНК: tRNA punctuation model.
Тема 7.2. Процессинг митохондриальных тРНК.
Тема 7.3. Процессинг мРНК: вырезание и полиаденилирование.
Тема 7.4. Регуляция стабильности митохондриальных мРНК.
Тема 7.5. Процессинг митохондриальных рРНК.
Тема 7.8. PPR-белки, их особенности и функции в митохондриях.
Раздел 8. Трансляция в митохондриях
Тема 8.1. Особенности структуры митохондриальных рибосом в сравнении с прокариотическими
Тема 8.2. Особенности механизмов митохондриальной трансляции в сравнении с прокариотической.
Раздел 9. Импорт биомакромолекул в митохондрии
Тема 9.1. Механизмы транслокации белковых предшественников через внешнюю и внутреннюю митохондриальную мембрану: работа комплекса TIM/TOM
Тема 9.2. Импорт РНК в митохондрии дрожжей.
Тема 9.3. Импорт 5S рРНК в митохондрии клеток млекопитающих.
Тема 9.4. Импорт тРНК в митохондрии хламидомонады - уникальная система балансировки частот использования кодонов в цитозольной и митохондриальной трансляции.
Тема 9.4. Разработка методов генная терапия митохондриальных болезней с помощью импорта в митохондрии конструкций на основе дрожжевых тРНК.
Раздел 10. Митохондриальные болезни и разработка подходов к их лечению.
Тема 10.1. Основы генетики митохондрий: наследование по материнской линии, гетероплазмия и гомоплазмия.
Тема 10.2. Генетические причины митохондриальных болезней: точечные мутации и деленции. Тканеспецифичность, симптоматика, диагностика и подходы к лечению.
Тема 10.3. Связь накопления соматических мутаций в митохондриальной
ДНК и старением. Клональная экспансия дефектных митохонджриальных ДНК. Мышиные модели.
Основная учебная литература
Льюин Б. Гены. М.: “Бином”. 2011 г. 896 с.
Льюин Б. Клетки. М.: “Бином”. 2011 г. 952 с.
Falkenberg M., Larsson N. G., Gustafsson C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria //Annu. Rev. Biochem. – 2007. – Т. 76. – С. 679-699.
Neupert W., Herrmann J. M. Translocation of proteins into mitochondria //Annu. Rev. Biochem. – 2007. – Т. 76. – С. 723-749.
Schapira A. H. V. Mitochondrial disease //The Lancet. – 2006. – Т. 368. – №. 9529. – С. 70-82.
Huynen M. A., Duarte I., Szklarczyk R. Loss, replacement and gain of proteins at the origin of the mitochondria //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. – 2013. – Т. 1827. – №. 2. – С. 224-231.
Campbell C. T., Kolesar J. E., Kaufman B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. – 2012. – Т. 1819. – №. 9. – С. 921-929.
Pohjoismäki J. L. O., Goffart S. Of circles, forks and humanity: topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA //Bioessays. – 2011. – Т. 33. – №. 4. – С. 290-299.
Falkenberg M., Larsson N. G., Gustafsson C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria //Annu. Rev. Biochem. – 2007. – Т. 76. – С. 679-699.
Yasukawa T. et al. Replication of vertebrate mitochondrial DNA entails transient ribonucleotide incorporation throughout the lagging strand //The EMBO journal. – 2006. – Т. 25. – №. 22. – С. 5358-5371.
Kasiviswanathan R., Collins T. R. L., Copeland W. C. The interface of transcription and DNA replication in the mitochondria //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. – 2012. – Т. 1819. – №. 9. – С. 970-978.
Korhonen J. A. et al. Structure–function defects of the TWINKLE linker region in progressive external ophthalmoplegia //Journal of molecular biology. – 2008. – Т. 377. – №. 3. – С. 691-705.
Sobek S et al. Negative regulation of mitochondrial transcription by mitochondrial topoisomerase I. // Nucleic acids research. – 2013. – Т. 41. – №. 21. – С. 9848-9857.
Sykora P., Wilson III D. M., Bohr V. A. Repair of persistent strand breaks in the mitochondrial genome //Mechanisms of ageing and development. – 2012. – Т. 133. – №. 4. – С. 169-175.
Boesch P. et al. DNA repair in organelles: Pathways, organization, regulation, relevance in disease and aging //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. – 2011. – Т. 1813. – №. 1. – С. 186-200.
Arnold J. J. et al. Human mitochondrial RNA polymerase: structure–function, mechanism and inhibition //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. – 2012. – Т. 1819. – №. 9. – С. 948-960.
Rackham O., Filipovska A. The role of mammalian PPR domain proteins in the regulation of mitochondrial gene expression //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. – 2012. – Т. 1819. – №. 9. – С. 1008-1016.
Joanna R., Michal M. The post-transcriptional life of mammalian mitochondrial RNA //Biochemical Journal. – 2012. – Т. 444. – №. 3. – С. 357-373.
Ngo H. B., Kaiser J. T., Chan D. C. The mitochondrial transcription and packaging factor Tfam imposes a U-turn on mitochondrial DNA //Nature structural & molecular biology. – 2011. – Т. 18. – №. 11. – С. 1290-1296.
Campbell C. T., Kolesar J. E., Kaufman B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. – 2012. – Т. 1819. – №. 9. – С. 921-929.
Yakubovskaya E. et al. Helix unwinding and base flipping enable human MTERF1 to terminate mitochondrial transcription //Cell. – 2010. – Т. 141. – №. 6. – С. 982-993.
Byrnes J, Garcia-Diaz M. Mitochondrial transcription: how does it end? //Transcription. – 2011.- Т. 2. – С. 32-36.
Rorbach J, Minczuk M. The post-transcriptional life of mammalian mitochondrial RNA //Biochemical Journal. – 2012. – Т. 444. – №. 3. – С. 357-373.
Дополнительная литература:
Yin Y. W. Structural insight on processivity, human disease and antiviral drug toxicity //Current opinion in structural biology. – 2011. – Т. 21. – №. 1. – С. 83-91.
Copeland W. C. Inherited mitochondrial diseases of DNA replication //Annual review of medicine. – 2008. – Т. 59. – С. 131.
Larsson N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging //Annual review of biochemistry. – 2010. – Т. 79. – С. 683-706.
Chujo T. et al. LRPPRC/SLIRP suppresses PNPase-mediated mRNA decay and promotes polyadenylation in human mitochondria //Nucleic acids research. – 2012. – Т. 40. – №. 16. – С. 8033-8047.
Wang K., Klionsky D. J. Mitochondria removal by autophagy //Autophagy. – 2011. – Т. 7. – №. 3. – С. 297-300.
Skulachev V. P. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis //Apoptosis. – 2006. – Т. 11. – №. 4. – С. 473-485.
Shock L. S. et al. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2011. – Т. 108. – №. 9. – С. 3630-3635.
Bellizzi D. et al. The control region of mitochondrial DNA shows an unusual CpG and non-CpG methylation pattern //DNA research. – 2013. – Т. 20. – №. 6. – С. 537-547.
Kennedy S. R. et al. Ultra-sensitive sequencing reveals an age-related increase in somatic mitochondrial mutations that are inconsistent with oxidative damage //PLoS genetics. – 2013. – Т. 9. – №. 9. – С. e1003794.
Boesch P. et al. DNA repair in organelles: Pathways, organization, regulation, relevance in disease and aging //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. – 2011. – Т. 1813. – №. 1. – С. 186-200.
Sage J. M., Knight K. L. Human Rad51 promotes mitochondrial DNA synthesis under conditions of increased replication stress //Mitochondrion. – 2013. – Т. 13. – №. 4. – С. 350-356.
Рекомендуемые источники информации в сети Интернет:
http://ghr.nlm.nih.gov/mitochondrial-dna
http://mitochondrialdiseases.org/mitochondrial-disease/
http://mda.org/disease/mitochondrial-myopathies/overview
http://bioinfo.nist.gov/
Программу курса «Молекулярная биология митохондрий» можно подразделить на следующие составные части:
Часть 1. (Разделы 1 и 2). Строение, функции и происхождение митохондрий. Геном и протеом митохондрий.
Краткая история изучения митохондрий
Функции митохондрий - биохимия дыхания, апоптоз, кальциевая регуляция, сборка железо-серных кластеров, митохондриальная теория старения.
Происхождение митохондрий - теория симбиогенеза. Разнообразие митохондрий и их геномов.
Эволюция митохондриального протеома: основные тенденции.
Структура митохондриальной ДНК: организация нуклеоида, формы митохондриальной ДНК, митохондриальный генетический код.
Основные элементы митохондриального генома человека: гены и регуляторные участки – ориджины и промоторы.
Часть 2 (Разделы 3, 4, 5). Репликация, метилирование и репарация митохондриальной ДНК.
Основные модели репликации митохондриальной ДНК: Strand displacement model - однонаправленный ассиметричный синтез, Strand-coupled model -двунаправленный синтез с образованием θ-cтруктур, RITOLS (RNA Incorporated Through Out Lagging Strand) – синтез с образованием промежуточных продуктов, содержащих протяженные участки РНК.
Инициация репликации
Структура и особенности работы ДНК-полимеразы гамма
Вспомогательные ферменты репликации: хеликазы, белок SSB, топоизомеразы, РНКазы.
Функциональное значение метилирования ядерной и митохондриальной ДНК.
Бисульфитное секвенирование – основной метод для определения метилированных остатков цитозина.
Митохондриальные формы метилтрансфераз.
Возможные причины повышенной частоты мутаций в митохондриальном геноме.
Анализ распределения различных мутаций по митохондриальному геному и отдельным цепям митохондриальной ДНК
Виды репарации в ядре и митохондриях.
Основные виды повреждения азотистых оснований и ферменты, участвующие в их репарации.
Механизм Base excision repair (BER) в митохондриях: основные стадии и ферменты.
Топография и регуляция репарации в митохондриях.
Часть3. (Разделы 6 и 7). Транскрипция митохондриальной ДНК и процессинг митохондриальных РНК.
Структура РНК-полимеразы POLRMT:основные функциональные участки, РРR-мотивы.
Транскрипционные факторы TFB1M и TFB2M
Транскрипционный фактор TFAM – основной регулятор состояния митохондриальной ДНК в нуклеоиде.
Терминация транскрипции. Механизм терминации MTERF1. Другие белки семейства MTERF.
Процессинг митохондриальных РНК.
Процессинг митохондриальных РНК: tRNA punctuation model.
Процессинг митохондриальных тРНК.
Процессинг мРНК: вырезание и полиаденилирование.
Регуляция стабильности митохондриальных мРНК.
Процессинг митохондриальных рРНК.
PPR-белки, их особенности и функции в митохондриях.
Часть 4. (Раздел 8) Трансляция в митохондриях
Особенности структуры митохондриальных рибосом в сравнении с прокариотическими
Особенности механизмов митохондриальной трансляции в сравнении с прокариотической.
Часть 5. (Раздел 9). Импорт биомакромолекул в митохондрии
Механизмы транслокации белковых предшественников через внешнюю и внутреннюю митохондриальную мембрану: работа комплекса TIM/TOM
Импорт РНК в митохондрии дрожжей.
Импорт 5S рРНК в митохондрии клеток млекопитающих.
Импорт тРНК в митохондрии хламидомонады - уникальная система балансировки частот использования кодонов в цитозольной и митохондриальной трансляции.
Разработка методов генная терапия митохондриальных болезней с помощью импорта в митохондрии конструкций на основе дрожжевых тРНК.
Распределение теоретического материала по занятиям
№
|
Тема занятий
|
Основные вопросы,
рассматриваемые на занятиях
|
Активные и интерактивные формы проведения занятий
|
1
|
2
|
3
|
4
|
1
|
Строение, разнообразие и основные функции митохондрий (2ч)
|
Краткая история изучения митохондрий. Первые наблюдения. Экспериментальное доказательство Энгельгардтом образования АТФ за счет энергии, освобождающейся при окислении органических веществ в процессе клеточного дыхания. Биохимия дыхания: цикл Кребса, окислительное фосфорилирование, ферменты дыхательной цепи. Другие функции митохондрий – участие в передача апоптотических сигналов, участие в кальциевой регуляции, сборка железо-серных кластеров. Митохондриальная теория старения.
Теория симбиогенеза. Происхождение митохондрий от α-протеобактерий, их сходство с современными риккетсиями. Разнообразие митохондрий. Митохондриальные геномы и протеомы.
|
нет
|
2
|
Митохондриальный протеом и митохондриальный геном. (2 ч).
|
Эволюция митохондриального протеома: основные тенденции. Частичная потеря предковых белков на ранних этапах эволюции эукариотической клетки при возникновении эндосимбиоза. Перенос большей части предковых генов в ядерный геном, возможные причины этого процесса.
Неортологичные замены предковых белков в ходе эволюции. Примеры таких замен: митохондриальные ДНК - и РНК- полимеразы, хеликаза TWINKLE.
Добавление новых белков в митохондриальный протеом в ходе эволюции в связи с возникновением новых функций у митохондрий по сравнению с бактериальным предком.
Увеличение числа субъединиц в больших мультиферментных митохондриальных комплексах в ходе эволюции.
Структура митохондриальной ДНК : организация нуклеоида, ключевая роль TFAM в компактизации митохондриальной ДНК. Формы митохондриальной ДНК: суперскрученная, релаксированная, димеры, катеннаны. Митохондриальный генетический код, его отличия от универсального.
Основные элементы митохондриального генома человека: гены и регуляторные участки – ориджины и промоторы.
|
нет
|
3
|
Репликация в митохондриях (2ч.)
|
История изучения репликации в митохондриях. Основные модели репликации митохондриальной ДНК, их экспериментальное доказательство и ограничения. Strand displacement model - однонаправленный ассиметричный синтез – исторически первая модель, не объясняющая всех наблюдаемых фактов. Более современные модели: Strand-coupled model -двунаправленный синтез с образованием θ-cтруктур. Модель RITOLS (RNA Incorporated Through Out Lagging Strand) – синтез с образованием промежуточных продуктов, содержащих протяженные участки РНК. Различные варианты замещения РНК на ДНК. Сравнение моделей митохондриальной репликации с классическими эукариотическими, прокариотическими и вирусными моделями .
Инициация репликации. Основные митохондриальные ориджины.
Терминация транскрипции при синтезе РНК-праймеров.
|
нет
|
4
|
Репликация в митохондриях: основные ферменты (2 ч)
|
Структура ДНК-полимеразы гамма: каталитическая и дополнительные субединицы – основные домены и их функции. Гомология ДНК-полимеразы гамма с полимеразой фага Т7. Особенности работы ДНК-полимеразы гамма - возможные причины вставки рибонуклеотидов в митохондриальную ДНК. Участие ДНК-полимеразы гамма в BER (base excision repair).
Вспомогательные ферменты репликации. Структура и функции хеликазы TWINKLE, её гомология с С-концевым участком хеликазы-праймазы фага T7. Участие TWINKLE в репликации и регуляции числа копий митохондриальной ДНК. Другие митохондриальные хеликазы. Роль белка mtSSB. Возможная стимуляция активности TWINKLE и ДНК-полимеразы ɣ in vitro белком mtSSB.
Митохондриальные топоизомеразы. Тор1mt – негативный регулятор транскрипции митохондиальных генов. РНКаза Н1 удаляет РНК праймеры на ориджинах ORI H и ORI L и при синтезе фрагментов Оказаки.
|
|
5
|
(2 ч) Метилирование и репарация митохондриальной ДНК.
|
Функциональное значение метилирования ядерной ДНК. Эпигенетика.
Бисульфитное секвенирование – основной метод для определения метилированных остатков цитозина.
Митохондриальная форма метилтрансферазы DNMT1. Преимущественное метилирование области D-loop в промоторных и регуляторных (CSB) участках. Преимущественное метилирование цитозина не в СpG последовательностях. Возможная роль метилирования в регуляции транскрипции и репликации.
Высокая частота мутаций в митохондриальной ДНК по сравнению с ядерной. Возможные причины повышенной частоты мутаций в митохондриальном геноме.
Изменение частот различных транзиций и трансверсий в митохондриальной ДНК с возрастом.
Анализ распределения различных мутаций (транзиций и трансверсий) по митохондриальному геному: повышенное содержание мутаций в области D-loop по сравнению с остальным митохондриальным геномом. Относительное количество каждого типа мутаций одинаково по всему митохондриальному геному и не меняется с возрастом. Ассиметрия в мутировании цепей митохондриальной ДНК: транзиции G/A и Т/С чаще происходят в L-цепи, чем в Н-цепи по всему митохондриальному геному, кроме области D-loop. Возможные объяснения ассиметрии.
|
|
6
|
Репарация ДНК в митохондриях (2 ч)
|
Сравнительный анализ видов репарации в ядре и митохондриях
Основные механизмы репарации: BER, MMR, NER, NHEJ и HR. Основные виды повреждения азотистых оснований: окисление, алкилирование и дезаминирование. Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8охоG и 8охоА. Основные митохондриальные гликозилазы: особенности структуры и функционирования.
Механизм Base excision repair (BER) в митохондриях: основные стадии и ферменты. Различия в SP (short patch) BER и LP (long patch) BER. Сравнение ферментов BER в ядре и митохондриях.
Другие виды репарации в митохондриях.
MMR – mismatch repair.
Репарация двуцепочечных повреждений митохондриальной ДНК: вероятное участие Rad 51 в митохондриальной репликации.
Топография и регуляция репарации в митохондриях.
|
|
7
|
Транскрипция в митохондриях: РНК полимераза и транскрипционные факторы TFB1M и TFB2M: (2ч.)
|
Три основных митохондриальных транскрипта. Структура РНК-полимеразы POLRMT: гомология с РНК- полимеразой фага Т7. Доменная организация POLRMT. N-концевой домен NTD. Уникальный N-концевой домен NTE, содержащий PPR-повторы и «митохондриальный адрес». Белки содержащие РРR-мотивы в митохондриях и пластидах. Их функции, возможная роль PPR-повторов – связь с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами.
Каталитический домен СТD: структура типа «ладонь».
Транскрипционные факторы TFB1M и TFB2M: сходства и различия, рРНК-метилтрансферазная активность, возможная роль в транскрипции.
|
|
8
|
Регуляция транскрипции с помощью TFAM, механизм терминации транскрипции (2ч.)
|
Транскрипционный фактор TFAM –основной регулятор состояния митохондриальной ДНК в нуклеоиде. TFAM регулирует число копий митохондриальной ДНК и участвует в регуляции транскрипции. Структура TFAM: 2 HMG box и уникальный С-конецевой участок. Механизм связывания с TFAM c малым желобком ДНК с образованием изгиба. Неспецифическое и специфическое (в областях промоторов) связывание TFAM с ДНК. Необходимость изгиба митохондриальной ДНК в областях промоторов LSP и HSP1 для начала транскрипции. Кооперативность связывания TFAM. Мультимеризация TFAM. Различные модели регулирование числа копий митохондриальной ДНК TFAMом. Регуляция активности TFAM путем фосфорилирования и протеолиза.
Терминация транскрипции. Предполагаемые сайты терминации митохондриальных транскриптов. MTERF1 связывается с ДНК, изгибая её и «выворачивая» три нуклеотида. Уникальный механизм терминации MTERF1: «выворачивание» происходит только при связывании MTERF1 в сайте терминации – за счет стабилизации вывернутых нуклеотидов. Специфичность связывания MTERF1 с сайтом терминации определяется водородными связями пяти остатков Arg MTERF1 с консервативными нуклеотидами в сайте терминации. Другие белки семейства MTERF, их возможные функции.
|
|
9
|
Процессинг митохондриальных РНК (2 ч)
|
Процессинг митохондриальных РНК: разрезание полицистронных прекурсоров, полиаденилирование мРНК, модификации нуклеотидов. tRNA punctuation model.
Процессинг митохондриальных тРНК. Разрезание 5’-конца тРНК РНКазой Р. Компоненты РНКазы Р: MRPP1– m1G9метилтрансфераза, участвующая в модификации тРНК, MRPP2 и MRPP3 .
Разрезание 3’-конца тРНК РНКазой Z- эндонуклеазой ELAC2.
Процессинг мРНК: вырезание и полиаденилирование. 4 сайта в митохондриальном геноме, не содержащих тРНК, разрезание в которых идет вразрез с tRNA punctuation model. Полиаденилирование митохондриальных мРНК создает стоп-кодоны для трансляции.
Основные ферменты полиаденилирования в митохондриях: hmtРАР и PNPase. Основные ферменты, участвующие в деградации митохондриальных мРНК: PNPase и РНК-хеликаза SUV 3.
Постранскрипционная регуляция стабильности мРНК в митохондриях. Уровень митохондриальных мРНК в клетке зависит от времени её жизни. Стабилизация митохондриальных мРНК комплексом белков LRPPRC и SLIRP.
Процессинг митохондриальных рРНК. Диметилирование 12S rRNA TFB1M и TFB2M.
Участие PTCD3 и ERAL1 в сборке малой субъединицы миторибосом. Связывание MTERF4 с 16SрРНК.
PPR-белки, их разнообразие, особенности и функции в митохондриях.
|
|
10
|
Трансляция в митохондриях
(2 ч)
|
Особенности структуры митохондриальных рибосом в сравнении с прокариотическими: различия в размере, массе, составе и количестве белков и рРНК, соотношении РНК:белок. Вопрос о присутствии 5S рРНК в рибосомах митохондрий Млекопитающих. Структурные различия в рРНК малой и большой субъединиц митохондриальных и бактериальных рибосом. Уникальная воротообразная структура в составе большой субъединицы миторибосом для входа мРНК.
Особенности механизмов митохондриальной трансляции в сравнении с прокариотической.
Основные отличия в инициации трансляции у митохондрий и бактерий. Основные отличия в элонгации трансляции у митохондрий и бактерий. Основные отличия в терминации трансляции у митохондрий и бактерий.
|
|
11
|
Импорт био-макромолекул в митохондрии. (2 ч)
|
Общая схема импорта белков в митохондрии. Посттрансляционный и котрансляционный импорт. Определенные сигнальные последовательности белков для импорта в разные митохондриальные субкомпартменты. Рецепторы внешней мембраны: Tom20/Tom22 и Tom70. Малые TOM-белки: Tom5, Tom6, Tom7. Альтернативные пути встраивания белков во внешнюю митохондриальную мембрану. Импорт белков в межмембранное пространство: MIA-путь. Транслоказа внутренней мембраны TIM23. Общая схема работы TIM23-комплекса. Транслоказа внутренней мембраны TIM22. Схема встраивания интегральных белков во внутреннюю мембрану. Импорт РНК в митохондрии. Нуклеотидные детерминанты/антидетермининты импорта тРНК в митохондрии. Импорт тРНК в митохондрии простейших. Импорт тРНК в митохондрии растений. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей. Импорт 5S рРНК в митохондрии млекопитающих. Импорт РНК в митохондрии – потенциальный способ супрессии мутаций в генах тРНК митохондрий или протяженных делеций митохондиального генома. Импорт производных дрожжевых тРНК в митохондрии клеток человека с мутациями в генах изоакцепторных тРНК. Импорт «мини-версий» дрожжевых тРНК в митохондрии клеток человека с протяженной геномной делецией. Опосредованный ферментом PNPase импорт гибридных РНК в митохондрии клеток человека.
Механизмы транслокации белковых предшественников через внешнюю и внутреннюю митохондриальную мембрану: работа комплекса TIM/TOM
Импорт РНК в митохондрии дрожжей.
Импорт 5S рРНК в митохондрии клеток млекопитающих.
Импорт тРНК в митохондрии хламидомонады - уникальная система балансировки частот использования кодонов в цитозольной и митохондриальной трансляции.
Разработка методов генной терапии митохондриальных болезней с помощью импорта в митохондрии конструкций на основе дрожжевых тРНК.
|
|
12
|
Генетика митохондрий и митохондриальные болезни (2 ч).
|
Типы повреждений митохондриальной ДНК: точечные замены, делеции, инсерции и нарушения кольцевой структуры. Причины повреждения митохондриальной ДНК: нарушения процессов репликации, репарации, а также действие мутагенов. Виды точечных мутаций в митохондриальной ДНК, их распределение по геному. Виды делеций митохондриальной ДНК, причины их возникновения. Гетероплазмия митохондриальной ДНК, ее роль в дисфункции митохондрий, клеток и органов. Митохондриальные заболевания (МЗ): причины, частота встречаемости. Генетика МЗ, обусловленных мутациями в митохондриальной (материнское наследование) и ядерной ДНК (аутосомно-доминантное и аутосомно-рецессивное наследование) на примерах наследственной оптической нейропатии Лебера, доминантной оптической атрофии и атаксии Фридрейха. Методы детекции точечных мутаций в митохондриальной ДНК. Понятие «узкого места» для митохондриальной ДНК в онтогенезе млекопитающих, его эволюционное значение. Классификация МЗ. Причины разнообразных клинических проявлений одних и тех же мутаций в митохондриальных генах. Тканеспецифичность МЗ. Симптоматика МЗ. Примеры МЗ. Синдром Кирнса-Сейра, его генетика. Хроническая прогрессирующая наружная офтальмоплегия, ее генетика. Митохондриальная энцефалопатия с лактоацидозом и инсультоподобными эпизодами (MELAS), ее генетика и диагностика. Миоклоническая эпилепсия. Наследственная оптическая невропатия Лебера, значение ее генетической диагностики для пенетрантности заболевания. Диагностика МЗ: клинические, лабораторные и генетические исследования. Пути лечения МЗ. Перспективные направления лечения МЗ. Соматические мутации в митохондриальной
ДНК и старение организма. Клональная экспансия делетированных митохондриальных ДНК, ее роль в старении и развитии сопутствующих заболеваний. Пути изучения функциональных следствий мутаций в митохондриальной ДНК в процессах старения. Мыши с мутантной митохондриальной полимеразой, типы мутаций у таких мышей.
|
|
Зачет. Вопросы, выносимые на зачет по курсу «Молекулярная биология митохондрий»:
Строение и структура митохондрий. Митохондриальный матрикс и мембраны, их роль.
Функции митохондрий в клетке: роль митохондрий в биоэнергетике, в метаболизме, в явлениях старения и программируемой клеточной гибели.
Роль митохондрий в процессе дыхания, мембранный потенциал, белки дыхательной цепи, перенос электронов.
Эволюция митохондриального протеома.
Строение нуклеоида, формы митохондриальной ДНК, гены митохондриальной ДНК
Митохондриальный генетический код.
Основы генетики митохондрий - гомоплазмия и гетероплазмия, особенности наследования генов митохондриальной ДНК
Основные модели репликации митохондриального генома.
Основные регуляторные элементы митохондриального генома, их функции.
Структура и функции основных ферментов репликации: ДНК полимераза γ, хеликаза TWINKLE, белок SSB, топоизомеразы, RNase НI.
ДНК полимераза γ – структура и функции.
Митохондриальные хеликазы и топоизомеразы.
Метилирование митохондриальной ДНК
Мутации митохондриального генома: распределение по геному и цепям, возможные причины возникновения.
Основные типы репарации митохондриальной ДНК в сравнении с ядерной.
Основные виды повреждений азотистых оснований в митохондриях и их последствия.
Основные этапы BER в митохондриях.
Механизм short patch BER и long patch BER.
Регуляция BER в митохондриях.
MMR и репарация двуцепочечных повреждений митохондриальной ДНК
Топология и регуляция репарации в митохондриях.
Транскрипция митохондриальной ДНК: основные ферменты и их функции.
Структура и особенности POLRMT. Функции транскрипционных факторов TFBM1 и TFBM2.
Структура, особенности связывания с ДНК и функции TFAM.
Терминация транскрипции митохондриального генома. Механизм связывания с ДНК и функции MTERF1.
Белки семейства MTERF – их особенности и функции.
Процессинг митохондриальных РНК: tRNA punctuation model.
Процессинг митохондриальных тРНК.
Процессинг мРНК: вырезание и полиаденилирование.
Регуляция стабильности митохондриальных мРНК.
Процессинг митохондриальных рРНК.
PPR-белки, их особенности и функции в митохондриях.
Особенности структуры митохондриальных рибосом в сравнении с прокариотическими.
Особенности механизмов митохондриальной трансляции в сравнении с прокариотической.
Узнавание белковых предшественников митохондриальными рецепторами и их транслокация через внешнюю митохондриальную мембрану.
Варианты транслокации белковых предшественников через внутреннюю митохондриальную мембрану.
Импорт РНК в митохондрии дрожжей.
Импорт 5S рРНК в митохондрии клеток млекопитающих.
Импорт тРНК в митохондрии хламидомонады - уникальная система балансировки частот использования кодонов в цитозольной и митохондриальной трансляции.
Гетероплазмия - фактор, определяющий развитие митохондриальных болезней и их генную терапию.
Способы генной терапии митохондриальных болезней посредством импорта РНК в митохондрии.
Митохондриальные заболевания: их причины и генетика.
Уменьшение кол-ва митохондриальной ДНК в онтогенезе, значение этого процесса в эволюции и для развития митохондриальных заболеваний.
Тканеспецифичность и симптоматика митохондриальных заболеваний. Примеры, диагностика и подходы к лечению.
Связь накопления соматических мутаций в митохондриальной ДНК и старением. Клональная экспансия дефектных митохондриальных ДНК. Мышиные модели митохондриальных заболеваний.
|
