Лабораторная работа 8. Микробиологическая диагностика микозов
В последние годы грибы, как возбудители заболеваний, приобретают все больший удельный вес в структуре болезней. Оппортунистические микозы стали одной из актуальных проблем здравоохранения, т.к. являются частыми осложнениями многих заболеваний, входящих в компетенцию врачей различных специальностей: онкологов, инфекционистов, терапевтов, педиатров, фтизиатров, пульмонологов, гинекологов, урологов, хирургов, дерматологов, эндокринологов и т.д.
В настоящее время изучено более 100 000 видов грибов, представленных шляпочными грибами, трутовиками, так и микроскопическими формами, которые составляют преобладающее большинство. Около 400 видов грибов обладают способностью инфицировать человека и животных. Однако статус постоянных возбудителей заболеваний имеют около 100 видов. Лишь немногие из них особо опасны: Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis. Эти виды, эндемичные для стран Северной и Южной Америки, могут поражать практически здоровых людей, вызывая тяжелейшие формы заболеваний.
Основная масса грибов относится к условно патогенным (оппортунистическим) возбудителям. Являясь составной частью окружающей среды, обитая в почве, воде, воздухе, помещениях, на растениях, продуктах питания, либо на коже и слизистых оболочках человека, некоторые безвредные сапрофиты, контактируя с организмом в условиях сниженного иммунитета и/или при наличии других отягощающих факторов, приобретают патогенные свойства, становясь паразитами.
Возрастание случаев грибковых инфекций среди населения связано с несколькими причинами. Ухудшение экологических условий снижает антиинфекционную резистентность человека, что приводит к нарушению баланса между нормальной флорой и иммунным ответом организма и как следствие, к резкой активации условно-патогенных грибов. Кроме того, при этом расширяется спектр возбудителей, вызывающих поражение кожи и внутренних органов. Нерациональное использование антибиотиков, цитостатиков, гормональных препаратов, лучевой и химиотерапии в борьбе с основным заболеванием также приводит к снижению иммунитета, селекции устойчивых штаммов микроорганизмов и развитию грибковых осложнений. Частая внутривенная и внутриартериальная катетеризация, парентеральное питание, проведение искусственной вентиляции легких, гемодиализ, трансплантация органов, кандиданосительство медперсонала и т.д. увеличивают риск инфицирования внутрибольничными штаммами грибов. Учащающиеся случаи самолечения, антисанитарные условия жизни, тяжелые хронические заболевания являются предрасполагающими факторами к развитию поверхностных и глубоких микозов.
Поверхностные микозы приобретают чрезвычайную актуальность в связи с высокой заболеваемостью (от 5 до 20%) населения земного шара. Поражения кожи, ногтей и волос обусловлены дерматофитами, плесневыми и дрожжеподобными грибами. Дерматофиты включают три рода кератинофильных возбудителей: Microsporum, Trichophyton и Epidermophyton. Около 28 видов вызывают поражения кожи, волос и ногтей, 14 из которых встречаются наиболее часто. Местообитанием зоофильных дерматофитов (T.mentagrophytes, T.verrucosum, M.canis и др.) являются животные, а антропофильных дерматофитов (T.rubrum, T.interdigitale, M.audouinii, E.floccosum и др.) – человек; геофильные виды, например Microsporum gypseum, обитают в почве. Дерматофиты могут передаваться человеку от человека, животных или из почвы, вызывая заболевание.
Плесневые и дрожжеподобные грибы считались сапрофитами или контаминантами и не включались в число возбудителей грибковых инфекций кожи и ногтей. В настоящее время не существует единого мнения о недерматофитной этиологии онихомикозов или дерматомикозов, однако, в литературе публикуется все больше данных о том, что недерматофиты могут быть основной или даже единственной причиной грибкового поражения ногтей и кожи. Наиболее часто этиологическими агентами поверхностных микозов являются виды родов Candida, Rhodotorula, Scopulariopsis, Aspergillus, Penicillium, Acremonium, Cladosporium и др.
Системные микозы (кандидоз, аспергиллез, геотрихоз, зигомикоз, криптококкоз и др.), как правило, встречаются в группах риска: у больных с эндокринными нарушениями, туберкулезом, бронхиальной астмой, хроническими процессами в легких, онкологическими и гематологическими заболеваниями, СПИДом и т.д. В 90% случаев у пациентов диагностируется кандидоз. На второе место по частоте встречаемости выходят различные формы аспергиллеза. Наиболее распространенными возбудителями заболевания являются A.fumigatus, A. niger, A. flavus и A.terreus. Возрастают случаи выявления «редких» возбудителей, зигомицетов с характерным широким несептированным мицелием – Absidia, Mucor, Rhizopus и др., а также гифомицетов – Penicillium, Acremonium, Cladosporium и др.
Некоторые глубокие микозы возникают и у здоровых иммунокомпетентных людей, когда при травмах и повреждениях кожных покровов возбудители споротрихоза, хромомикоза и мицетомы из окружающей среды, почвы, предметов быта и др. проникают через кожу в подкожную клетчатку, лимфатическую систему и при отсутствии соответствующего лечения могут привести к инвалидизации больного.
Установление грибковой этиологии заболевания на ранних стадиях развития и адекватное этиопатогенетическое лечение помогут ускорить выздоровление, избежать инвалидизации, а иногда и смерти больного. При этом, за счет уменьшения длительности лечения значительно сокращаются затраты на лекарственные препараты и медицинское обслуживание в поликлинике и в стационаре, что важно в социальном и экономическом плане.
Для диагностики микозов применяются микроскопические (в том числе гистологические), микологические (культуральные), аллергические, серологические, экспериментальные, молекулярно-биологические и другие методы исследования. Ввиду морфологического многообразия грибов, а также их медленного роста ведущее значение в диагностике микозов имеют морфологические методы обнаружения и идентификации возбудителя. В зависимости от клинических проявлений болезни исследуемым материалом служат: пораженные волосы, чешуйки кожи, кусочки ногтей, кожные и ногтевые скарификаты, гной, мокрота, пунктаты лимфатических узлов, костного мозга, внутренних органов, кровь, спинномозговая жидкость, желудочный сок, желчь, испражнения, кусочки тканей, полученные при биопсии или аутопсии, и др. Материал берут по возможности из очага инфекции при соблюдении правил асептики эпиляционным пинцетом, скальпелем, препаровальной иглой, лезвием бритвы, ножницами, ложечкой Фолькмана, пастеровской пипеткой и др. Тампонами материал стараются не брать. Чтобы лучше рассмотреть пораженный участок, можно пользоваться лупой, у больных микроспорией – люминесцентной лампой, в лучах которой пораженные волосы имеют изумрудно-зеленое свечение. При подозрении на поражение дерматофитами ногти обрабатывают 70%-м этанолом для инактивации и удаления наружной (сопутствующей) микрофлоры, состригают и в сухом контейнере доставляют в лабораторию. Патологический материал следует брать в количестве, достаточном для микроскопического изучения в неокрашенном и окрашенном виде, для посева на питательные среды или заражения экспериментальных животных, а также проведения других исследований. Как правило, параллельно с микологическим проводится бактериологическое исследование патологического материала.
При необходимости транспортировки материала в лабораторию его помещают в стерильные пробирки, контейнеры, между предметными стеклами и др., указав в направлении паспортные данные больного, локализацию поражения, дату взятия материала, диагноз. Несмотря на то что многие возбудители микозов устойчивы во внешней среде, материал рекомендуется держать во влажной атмосфере в присутствии кислорода и доставлять в лабораторию в течение 2 ч, особенно в случае контаминации материала бактериями. С возбудителями гистоплазмоза, кокцидиоидоза и других особо опасных микозов работают в специально оборудованных лабораториях с соблюдением специальных правил, позволяющих предотвратить лабораторное заражение и распространение инфекции.
При микроскопическом исследовании изучают неокрашенный (нативный) и окрашенный материал. Как правило, параллельно с микологическим проводится бактериологическое исследование патологического материала.
При необходимости транспортировки материала в лабораторию его помещают в стерильные пробирки, контейнеры, между предметными стеклами и др., указав в направлении паспортные данные больного, локализацию поражения, дату взятия материала, диагноз. Несмотря на то, что многие возбудители микозов устойчивы во внешней среде, материал рекомендуется держать во влажной атмосфере в присутствии кислорода и доставлять в лабораторию в течение 2 ч, особенно в случае контаминации материала бактериями. С возбудителями гистоплазмоза, кокцидиоидоза и других особо опасных микозов работают в специально оборудованных лабораториях с соблюдением специальных правил, позволяющих предотвратить лабораторное заражение и распространение инфекции.
При микроскопии нативных препаратов можно определить характерное расположение спор гриба в пораженных волосах, мицелия в чешуйках кожи и соскобах с ногтей, что позволяет лаборатории дать предварительное заключение. Окончательное заключение о видовой принадлежности гриба дают только после микологического исследования материала.
Окрашенные препараты готовят, как правило, из материала, имеющего вязкую или жидкую консистенцию. В окрашенном материале легче выявить элементы гриба, чем в нативных препаратах. Чаще всего используют следующие методы окраски: по Граму, Романовскому-Гимзе, по Гомори (метенаминовым серебром), по Мак-Манусу (периодной кислотой и реактивом Шиффа), Цилю-Нильсену, Граму-Вельшу, Райту, Лейшману, лактофенолом, лактофуксином, по Аравийскому. Для окраски дерматофитов применяют методы Сабуро, Адамсона, Хоммершмидта, Берка и др.
Для экспресс-диагностики используют специальные методы окраски, так как окраска по Романовскому-Гимзе или по Граму не всегда позволяет выявить в материале клетки грибов. При необходимости применяют люминесцирующие иммунные сыворотки (РИФ).
Клетки грибов, как правило, грамположительны. Окраска по Граму помогает выявить сопутствующие бактериальные клетки и обнаружить капсулу у криптококков. Тушевая (негативная) окраска по Бурри позволяет выявить инкапсулированные клетки Cryptococcus neoformans в препаратах ликвора при криптококковом менингите. Окраска по Романовскому-Гимзе используется для обнаружения в мокроте трофозоитов Pneumocystis carinii, в крови или костном мозге (как и окраска по Райту) – дрожжевую форму возбудителя гистоплазмоза. Для выявления кислотоустойчивых грибов применяют метод окраски по Цилю-Нильсену или модифицированный метод Хенкса.
Микологическое (культуральное) исследование направлено на выделение чистой культуры гриба и ее идентификацию. Посевы производят на плотные и жидкие, неселективные и селективные питательные среды: Сабуро, сусло-агар, Чапека, кукурузный, рисовый, картофельный агар, Френсиса, Полаччи и др. Грибы хорошо растут также на некоторых средах для бактерий – кровяном, шоколадном, сердечно-мозговом агаре, угольно-дрожжевой среде. Их, как и картофельный агар с глюкозой, используют для выделения грибов из «стерильных» материалов (крови, ликвора, биоптатов и т.п.) и инкубирование ведут более длительное время. Для приготовления селективных сред к неселективным добавляют антибиотики (левомицетин – 20-50, стрептомицин – 40, пенициллин – 20 мкг/мл и др.), а также красители (бенгальский розовый и др.) или дезинфектанты. Так, для выделения грибов из контаминированных бактериями материалов используют агар Сабуро с глюкозой, в который добавляют пенициллин и гентамицин или гентамицин и хлорамфеникол.
Для первичной дифференциации грибов используют хромогенный агар CHROM. В его составе имеются хромогенные субстраты, которые при действии на них того или иного фермента грибов расщепляются с образованием окрашенных соединений. В результате этого колонии различных грибов на агаре CHROM отличаются по цвету: белые, кремовые, желтые, коричневые, черные, розовые, красные и т.д.
Серологическое исследование. Реакции агглютинации, преципитации, связывания комплемента, непрямой гемагглютинации, ИФА, иммуноблотинг или иммунофлюоресценции проводят с антигенами из грибов.
Аллергологическое исследование. Аллергические пробы ставят путем внутрикожного введения соответствующих аллергенов (взвеси из убитых грибов, фильтратов культур, полисахаридных и белковых фракций из клеток или клеточных оболочек возбудителей). Результаты учитывают по пятибалльной системе через 20 мин (немедленные) и через 24-48 ч (замедленные реакции).
Кроме того, для выявления микотической сенсибилизации организма применяют иммунологические тесты in vitro: дегрануляции базофилов (крови и тканевых), другие тесты гиперчувствительности немедленного типа, а при гиперчувствительности замедленного типа – реакцию торможения миграции фагоцитов, бластной трансформации лимфоцитов.
Гистологическое исследование. Этот метод позволяет обнаружить гриб в тканях, изучить его морфологию и особенности патологического процесса, вызванного им в организме. Материалом для исследования служат ткани, полученные при биопсии и аутопсии.
ПЦР. Разработаны тест-системы для ПЦР, позволяющие выявлять до 40 видов грибов, включая все клинически важные виды. Например, тест-системы для выявления ДНК Candida albicans позволяют обнаружить 10-100 клеток возбудителя на 100 мкл биологического материала. С помощью геномной дактилоскопии ДНК в ПЦР проводят также типирование штаммов С. albicans.
Для выявления в клиническом материале Т. rubrum и С. neoformans предложены прямые ПЦР-зонды. Определенные сложности при использовании ПЦР в клинике связаны с ложноположительными реакциями, обусловленными временным присутствием плесневых грибов (чаще аспергиллов) в респираторном тракте. Значительно более надежные результаты при аспергиллезной инфекции получены в ПЦР с сывороткой или плазмой крови. Для быстрого выявления различных видов Aspergillus в крови и бронхиальном секрете предложен новый высокочувствительный вариант двухступенчатой ПЦР с двумя парами «гнездовых» праймеров. Его также применяют для идентификации и дифференциации штаммов возбудителей паракокцидиоидомикоза (Paracoccidioides brasiliensis) и гистоплазмоза (Histoplasma capsulatum).
Опрос по теме занятия.
Контрольные вопросы.
1.Указать микроскопические методы исследования при диагностике микозов.
2. Указать микробиологические методы исследования при диагностике микозов
3. Указать серологические методы исследования при диагностике микозов
Задания
1.Провести микроскопическое исследование демонстрационных мазков, приготовленных из патологического материала для подтверждения клинического диагноза «микоз». Сделать заключение.
2. Учесть результаты готовых посевов патологического материала на питательную среду Сабуро.
3. Приготовить мазки из выросших колоний и окрасить по Граму.
4. При наличие в мазках дрожжевых клеток составить план исследования.
5. Учесть результаты готовых посевов чистых культур на голодный агар.
6. Учесть результаты готовых посевов чистых культур на хромогенную среду. Отметить характер роста культуры на этой среде.
7. Оценить рост на средах «пестрого ряда».
8. Учесть и оценить результаты чувствительности к антимикотикам с выделенной культурой дрожжевых грибов.
|
