Лабораторная работа 7. Вирусологическое исследование. Работа с клеточными культурами. Взятие и подготовка материала для вирусологической диагностики. Выявление (индикация) и идентификация вирусов.
Как известно, вирусы являются генетическими внутриклеточными паразитами, способными к размножению только в живых системах. Следовательно, первым этапом вирусологической диагностики является получение и подготовка одной из живых систем: культур клеток, куриных эмбрионов или чувствительных лабораторных животных. Наиболее трудоемкой является работа с клеточными культурами. На практике используют первичные, полуперевиваемые (диплоидные) и перевиваемые клеточные культуры.
Первичные клеточные культуры. Эти культуры получают непосредственно из ткани животного или человека путем разрушения протеолитическими ферментами (трипсин, коллагеназа, проназа) межклеточного вещества. Разобщенные (диспергированные) клетки, помещенные в питательную среду, способны прикрепляться к поверхности культурального сосуда и размножаться, образуя так называемый монослой –слой толщиной в одну клетку.
В большинстве случаев перед обнаружением вируса в живой системе его следует освободить от компонентов клеток хозяина. Для этого предусмотрены следующие процедуры.
Для разрушения клеток в материале используют трехкратное замораживание с последующим оттаиванием или растирание материала в гомогенизаторе со стерильным песком или стеклянными бусами.
Для очистки от клеточного детрита и посторонних примесей полученный таким образом материал подвергают центрифугированию с последующим исследованием надосадочной жидкости или пропускают через бактериальные фильтры. При этом вирус ввиду малых размеров не осаждается при центрифугировании и не задерживается бактериальными фильтрами, оставаясь в жидкости.
Полученный материал обрабатывают антибиотиками (500-1000 ЕД/мл пенициллина и 200 ЕД/мл стрептомицина) для деконтаминации и предотвращения бактериального загрязнения.
Полученный таким образом материал принято называть вируссодержащим материалом.
Выявление (индикацию) вирусов проводят, исследуя воздействие их на живые системы. Например, по цитопатическому действию (ЦПД). ЦПД представляет собой дегенеративные изменения в клетках, которые появляются в результате репродукции в них вирусов. Одни вирусы проявляют ЦПД в первые дни после заражения культур клеток (вирус оспы, полиомиелита и др.), другие — значительно позже, иногда спустя 1-2 недели после заражения (аденовирусы, вирусы парагриппа и др.). Характер ЦПД зависит в основном от вида вируса. Различают полную и частичную дегенерацию клеток монослоя.
По реакции гемадсорбции (РГадс). Эта реакция позволяет выявить вирусы до развития ЦПД благодаря адсорбции эритроцитов на поверхности клеток, инфицированных гемадсорбирующими вирусами. Эти сложные вирусы имеют в составе суперкапсида специфические гликопротеиды – гемагглютинины (например, орто- и парамиксовирусы).
По цветной пробе. Принцип данного теста заключается в следующем. В результате жизнедеятельности клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты. В результате цвет входящего в состав среды индикатора (фенолового красного) становится оранжевым. При заражении культуры клеток такими цитопатогенными вирусами, как энтеровирусы или реовирусы, метаболизм клеток подавляется, рН среды и ее цвет не изменяются (она остается красной).
По внутриклеточным включениям. Внутриклеточные включения образуются при репродукции некоторых вирусов в цитоплазме и ядре клеток (оспы, бешенства, гриппа, герпеса и др.). Они представляют собой участки локализации вирусов и их компонентов в клетках. Включения обнаруживают при микроскопии после окраски монослоя по Романовскому-Гимзе или другими сложными методами, а также при люминесцентной микроскопии после обработки акридиновым оранжевым.
Электронно-микроскопическое выявление (ЭМВ). Это исследование дает возможность в зависимости от вида вируса выявить в клетках отдельные вирионы и их кристаллоподобные скопления в ядре или цитоплазме. ЭМВ, как правило, используется для обнаружения возбудителей вирусных инфекций с типичной морфологией (оспенные вирусы), особенно в тех случаях, когда их не удается культивировать обычными методами (вирусы гепатитов А и В, ротавирусы). Использование специфических антител положено в основу метода иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).
По образованию бляшек. Бляшки вирусов представляют собой очаги разрушенных вирусом клеток монослоя под агаровым или бентонитовым покрытием. Вирусные бляшки подсчитывают для количественного анализа инфекционной активности вирусов.
Очаги клеточной дегенерации (бляшки) выявляют путем окрашивания культуры нейтральным красным, который либо включают в состав агарового покрытия, либо добавляют непосредственно перед учетом результатов. Бляшки состоят из погибших клеток, не окрашиваются нейтральным красным и поэтому выглядят в виде светлых пятен на фоне розово-красного монослоя.
Идентификацию вирусов проводят по следующим признакам:
1.Вирусиндуцированным патологическим изменениям в чувствительных живых системах
2.Антигенным свойствам вирусов в серологических реакциях с противовирусными видовыми и типовыми сыворотками (является основной и достаточно точной идентификацией).
3.Выявлению вирусной НК.
4.Результатам электронно-микроскопического изучения морфологии вирусов.
Идентификация по антигенной структуре. Реакция нейтрализации. Наиболее чувствительным вариантом реакции нейтрализации (РН) является подавление вирусного бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки (реакция редукции вирусных бляшек). Соответствие вируса антителам сыворотки проявляется подавлением бляшкообразования (в сравнении с контролем). РН позволяет определить видовую и типовую (вариантную) принадлежность вируса.
Одним из вариантов РН является цветная проба (колориметрическая реакция нейтрализации). При положительном результате противовирусные антитела блокируют размножение вируса в культуре клеток, и под действием кислых метаболитов последних в среде меняется цвет индикатора. Результаты реакции учитывают колориметрически: рН 7,4 и выше указывает на репродукцию вируса, 7,2 и ниже – на нейтрализацию вируса антителами.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Эта реакция основана на блокировании вирусных гемагглютининов специфическими антителами. Ее можно рассматривать как частный случай реакции нейтрализации. РТГА может быть использована как для серологической диагностики, так и для идентификации гемагглютинирующих вирусов. Феномен РТГА проявляется в образовании компактного осадка эритроцитов вместо «зонтика» гемагглютинации. Реакцию проводят на полистироловых пластинах и оценивают по отсутствию склеивания эритроцитов, добавленных к смеси вируса и специфической сыворотки. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, которое «тормозит» гемагтлютинацию. Для РТГА широко применяется также микрометод с использованием микропланшетов и делютеров Такачи (для разведения материала).
Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс). Данная реакция основана на нейтрализации эффекта адсорбции эритроцитов на поверхности клеток, инфицированных вирусами. РТГадс используется для идентификации гемадсорбирующих вирусов. О видовой принадлежности вируса судят по отсутствию адсорбции эритроцитов в опыте при типичной гемадсорбции в контрольных пробирках.
Для антигенной идентификации вирусов в клеточных культурах используют серологические реакции со специфическими иммунными противовирусными сыворотками или моноклональными антителами.
Опрос по теме занятия.
1.Знать живые системы, которые используются для культивирования вирусов.
2. Объяснить с какой целью используются в вирусологии питательные среды.
3. Указать способы забора исследуемого материала и его подготовку к проведению вирусологической диагностики.
4. Знать методы индикации вирусов.
5. Методы идентификации вирусов.
Задания
1.Провести вирусоскопическое исследование демонстрационных мазков, приготовленных из патологического материала для обнаружения цитопатического действия, гемадсорбции, внутриклеточных включений. Сделать заключение.
2. Учесть результаты готовой цветной пробы. Сделать заключение.
3. Учесть результаты готовых реакций нейтрализации, торможения гемагглютинации и иммуноферментного анализа (ИФА). Сделать заключение.
Раздел 2.3. Дрожжевые и мицелиальные грибы – возбудители микозов человека
|
