Институт биологии – обособленное подразделение
Федерального государственного бюджетного учреждения науки
Федерального исследовательского центра
«Карельский научный центр Российской академии наук»
(ИБ КарНЦ РАН)
На правах рукописи
Пеккоева
Светлана Николаевна
ИЗМЕНЕНИЕ ЛИПИДНОГО СОСТАВА мышц и липидного мешка ПРЕДСТАВИТЕЛЯ АРКТИЧЕСКОЙ ИХТИОФАУНЫ ЛЮМПЕНА ПЯТНИСТОГО LEPTOCLINUS MACULATUS
В постэмбриональном развитии
03.01.04. – Биохимия
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
профессор, член-корреспондент РАН
Немова Нина Николаевна
Санкт-Петербург – 2018
О
Стр.
ГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
|
4
|
ВВЕДЕНИЕ
|
5
|
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
|
14
|
1.1. Роль липидов в метаболизме животных
|
14
|
1.1.1. Фосфолипиды
|
15
|
1.1.2. Холестерин, его функциональное значение
|
19
|
1.1.3. Триацилглицерины, эфиры холестерина и воска
|
22
|
1.1.4. Жирные кислоты
|
23
|
1.2. Липиды в биохимических механизмах адаптации рыб в процессе роста и развития в условиях Арктики
|
26
|
1.3. Липиды и жирные кислоты в раннем развитии рыб северных широт
|
31
|
1.4. Ранний онтогенез костистых рыб
|
40
|
1.4.1. Типы и периодизация
|
40
|
1.4.2. Особенности раннего развития люмпена пятнистого как одного из ключевых представителей арктической ихтиофауны
|
43
|
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
|
50
|
2.1. Материал исследования
|
50
|
2.1.1. Район сбора проб – Конгсфьорд, о. Западный Шпицберген
|
52
|
2.2. Методы исследования
|
60
|
2.2.1. Фиксация материала
|
60
|
2.2.2. Экстракция
|
60
|
2.2.3. Тонкослойная хроматография
|
61
|
2.2.4. Методы количественного определения липидов
|
62
|
2.2.5. Высокоэффективная жидкостная хроматография
|
64
|
2.2.6. Газовая хроматография: определение спектра жирных кислот
|
65
|
2.3. Расчеты и статистическая обработка данных
|
67
|
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
|
69
|
3.1. Содержание общих липидов и их классов в мышцах молоди люмпена пятнистого (стадии развития L1–L5)
|
69
|
3.2. Жирнокислотный спектр общих липидов мышц молоди люмпена пятнистого (стадии развития L1–L5)
|
72
|
3.3. Жирнокислотный спектр фосфолипидов и триацилглицеринов мышц молоди люмпена пятнистого (стадии развития L1–L5)
|
80
|
3.4. Содержание общих липидов и их классов в липидном мешке молоди люмпена пятнистого на стадиях развития L3, L4, L4*
|
88
|
3.5. Жирнокислотный спектр общих липидов липидного мешка молоди люмпена пятнистого на стадиях развития L3, L4, L4*
|
91
|
3.6. Жирнокислотный спектр фосфолипидов и триацилглицеринов липидного мешка молоди люмпена пятнистого на стадиях развития L3, L4, L4*
|
97
|
3.7. Жирнокислотный спектр взрослых особей люмпена пятнистого
|
102
|
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
|
104
|
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
|
123
|
ВЫВОДЫ
|
126
|
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
|
128
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОЛ – общие липиды
ФЛ – фосфолипиды
ФИ – фосфатидилинозитол
ФС – фосфатидилсерин
ФХ – фосфатидилхолин
ФЭА – фосфатидилэтаноламин
СФМ – сфингомиелин
ЛФХ – лизофосфатидилхолин
ТАГ – триацилглицерины
ХС – холестерин
ЭХС – эфиры холестерина
В – воска
ГФИ – гликозилфосфатидилинозитол
ЖК – жирные кислоты
НЖК – насыщенные жирные кислоты
МНЖК – мононенасыщенные жирные кислоты
ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты
ДГК – докозагексаеновая кислота
ЭПК – эйкозапентаеновая кислота
(n-x) – положение двойной связи от конечной метильной группы в молекуле жирной кислоты, где x – номер углеродного атома в молекуле жирной кислоты, от которого начинается первая двойная связь.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
Липиды являются важнейшими структурными и функциональными компонентами всех живых систем. Они играют роль структурной основы любой биологической мембраны, обеспечивают энергетические потребности организма (Крепс, 1981; Болдырев и др., 2006). Многие липиды являются биологически активными веществами или их предшественниками, участвующими в регуляции многообразных физиолого-биохимических процессов (Алесенко, 1998; 2013; Дятловицкая, Безуглов, 1998; Проказова и др., 1998; Alessenko, 2000; Сергеева, Варфоломеева, 2006; Перевозчиков, 2008; Lagarde et al., 2016).
Липиды считаются незаменимыми компонентами в реализации комплекса сформировавшихся в эволюции биохимических адаптаций, направленных на запуск компенсаторных реакций клетки, поэтому изменения липидного статуса в процессе индивидуального развития организма могут отражать состояние популяций животных, в том числе гидробионтов – эктотермных организмов, развитие которых происходит в постоянно изменяющихся условиях среды (Хочачка, Сомеро, 1988; Hochachka, Somero, 2002). Липиды определяют репродуктивные процессы, рост, развитие и выживаемость рыб, могут выступать в качестве дополнительных биохимических индикаторов их состояния на любой стадии онтогенеза (Мацук, Лапин, 1972; Мацук, 1975; Tocher, 2003; Tocher et al., 2008, Tocher, 2010). Следует отметить, что липидный и жирнокислотный состав представителей арктической ихтиофауны исследован недостаточно, тогда как системное изучение биохимии и физиологии ключевых видов морских приполярных экосистем очень важно для раскрытия особенностей механизмов биохимических адаптаций у арктических видов в раннем онтогенезе. Кроме того, в современных условиях повышенного интереса к Арктике результаты работы могут иметь значение при разработке государственных стратегий по освоению и развитию данного региона, для решения экологических проблем, связанных с повышенной чувствительностью рыб к климатическим изменениям.
Исследуемый в работе объект – представитель придонной арктической ихтиофауны – люмпен пятнистый Leptoclinus maculatus (Fries, 1838) из семейства Стихеевых (отряд Окунеобразные), который распространен в Арктике вплоть до 79° с.ш. и обитает при низких температурах от –1,2 до 2,0 °С и высокой солености – 33–35‰ (Андрияшев, 1954; Mecklenburg, Sheiko, 2004; Нельсон, 2009; Mecklenburg et al., 2011). Он имеет большое значение как промежуточное звено в арктических трофических цепях, где выступает одновременно в роли хищника и жертвы. Люмпен является ценным высокоэнергетическим объектом питания для многих видов рыб, птиц и млекопитающих (Watanuki et al., 1992; Barret, 2002; Hovde et al., 2002; Weslawski et al., 2006; Labansen et al., 2007; Lavers, Jones, 2007).
Люмпен пятнистый уникален многостадийным и длительным развитием со сменой зоны обитания. Молодь люмпена развивается в пелагиали до 3-х летнего возраста, а затем становится ювенильной особью, ведущей придонный образ жизни в возрасте около 5 лет (Meyer Ottesen et al., 2011). Уникальной особенностью личинок люмпена является наличие специального образования в брюшной части тела, провизорного органа – т.н. «липидного мешка». Липидный мешок, состоящий из крупных липидных капель, обнаружен только у рыб семейства Стихеевых и детально описан на примере люмпена пятнистого (Falk-Petersen et al., 1986a; Мурзина, 2010). Он выполняет, в первую очередь, запасную функцию, аккумулируя большое количество липидов, а также обеспечивает плавучесть личинок.
Следует отметить, что к настоящему времени сведения об онтогенезе люмпена пятнистого Leptoclinus maculatus (Fries, 1838), его питании и росте немногочисленны (Falk-Petersen et al., 1986a; Murzina et al., 2008; 2012; 2013a; Мурзина, 2010; Meyer Ottesen et al., 2011). Данная работа является продолжением и развитием исследований по липидному составу люмпена пятнистого, результаты которых представлены в основном в наших работах и в статьях норвежских коллег (Falk-Petersen et al., 1986a; Murzina et al., 2008, 2013a,b; Мурзина, 2010; Мурзина и др., 2010; Meyer Ottesen et al., 2011; Murzina et al., 2012; Пеккоева и др., 2017 а, б).
Изучение динамики содержания липидов и жирных кислот как структурных, так и энергетических липидов в мышцах и в липидном мешке люмпена пятнистого в процессе постэмбрионального развития позволит получить новые данные об особенностях липидного обмена, механизмов биохимических адаптаций с участием липидов в процессе развития рыб в условиях биотических (питание) и абиотических факторов среды арктического региона.
В связи с вышеизложенным, были определены следующие цели и задачи исследования.
Цель исследования: изучить динамику содержания липидов и их жирнокислотных компонентов в мышцах и в липидном мешке молоди люмпена пятнистого Leptoclinus maculatus, обитающего в заливе Конгсфьорд архипелага Шпицберген, в процессе постэмбрионального развития и роста.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Провести сравнительный анализ количественного и качественного состава липидов и их отдельных классов – фосфолипидов (в том числе фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, лизофосфатидилхолина, сфингомиелина), холестерина, триацилглицеринов, эфиров холестерина в мышцах и в липидном мешке люмпена пятнистого на стадиях раннего постэмбрионального развития L1, L2, L3, L4, L4*, L5;
Провести сравнительный анализ спектра жирных кислот структурных (фосфолипидов) и запасных (триацилглицеринов) липидов в мышцах и в липидном мешке люмпена пятнистого на стадиях раннего постэмбрионального развития L1, L2, L3, L4, L4*, L5 и в мышцах взрослых особей;
Установить особенности поступления жирных кислот по трофическим цепям от фито-, зоопланктона и донных беспозвоночных к люмпену пятнистому в процессе его развития и их влияние на процессы роста молоди рыб.
Научная новизна
Впервые получены данные о динамике содержания отдельных классов липидов и жирных кислот структурных и энергетических липидов в мышцах и в липидном мешке молоди люмпена пятнистого Leptoclinus maculatus (Fries, 1838) из Конгсфьорда (арх. Шпицберген) на стадиях его раннего постэмбрионального развития L1, L2, L3, L4, L4*, L5 в зимний период. Установлено, что уровень полиненасыщенных жирных кислот понижается, а мононенасыщенных жирных кислот повышается в процессе развития молоди люмпена от L1 к L5 стадии развития, что соответствует изменению фракционного состава липидов в мышцах с возрастом люмпена. Впервые изучена связь между содержанием липидов и жирных кислот структурных и энергетических липидов в мышцах и в липидном мешке и питанием в раннем онтогенезе люмпена в условиях полярной ночи. Показано, что содержание мононенасыщенных жирных кислот в составе триацилглицеринов мышц значительно повышается с L2 стадии развития люмпена, главным образом за счет биомаркерных для калянусов 20:1(n-9) и 22:1(n-11) жирных кислот, поступающих с пищей. Впервые показано, что изменения в жирнокислотном спектре люмпена пятнистого в процессе его постэмбрионального развития связаны со сменой зоны обитания и характера питания: высокий уровень 22:6(n-3), 18:1(n-9) жирных кислот у пелагических личинок на стадии развития L1 – с питанием динофитовыми водорослями в составе фитопланктона; высокое содержание биомаркерных 22:1(n-11), 20:1(n-9) жирных кислот со стадии развития L2 – с началом активного питания зоопланктоном рода Calanus, жирных кислот 18:1(n-9), 18:1(n-7), 16:1(n-7) у взрослой придонной рыбы – с питанием беспозвоночными бентоса. Впервые показано, что одним из признаков, вносящих вклад в фенотипическую разнокачественность молоди люмпена, является установленное различие в содержании жирных кислот – 14:0, 16:0, 18:0, 16:1(n-7), 18:1(n-9), 20:1(n-9), 22:1(n-11), 18:2(n-6), 20:4(n-6), 18:3(n-3), 20:5(n-3), 22:5(n-3), 22:6(n-3).
На защиту выносятся СЛЕДУЮЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ:
Качественный и количественный состав липидов и жирных кислот молоди люмпена пятнистого определяет его сходство с другими видами морской холодноводной ихтиофауны (высокое содержание длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот n-3 семейства, нейтральных липидов), при этом имеются специфические особенности - высокий уровень моноеновых жирных кислот, в основном в виде биомаркерных жирных кислот калянусов – 20:1(n-9), 22:1(n-11);
-
Изменение жирнокислотного состава в постэмбриональном развитии люмпена пятнистого отражает особенности его питания: высокий уровень 22:6(n-3), 18:1(n-9) жирных кислот на стадии L1 указывает на питание динофитовыми водорослями в составе фитопланктона; высокое содержание 20:1(n-9) и 22:1(n-11) жирных кислот со стадии развития L2 – на начало активного питания зоопланктоном рода Calanus; жирных кислот 18:1(n-9), 18:1(n-7), 16:1(n-7) у взрослого люмпена – на питание беспозвоночными бентоса.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И Практическое значение работы
Результаты детального исследования изменения липидного состава в раннем постэмбриональном развитии одного из ключевых видов арктических экосистем – люмпена пятнистого Leptoclinus maculatus, помимо фундаментального значения для получения новых знаний о липидном составе в раннем онтогенезе рыб, о взаимоотношениях организма и среды (в том числе для биохимии, физиологии, биологии развития, экологии), могут быть использованы в решении ряда практических задач, связанных, например, с оценкой продуктивности ценных промысловых видов рыб (атлантическая треска, полярная треска, камбала), для которых пелагическая молодь люмпена является высокоэнергетическим источником питания. Данные о составе жирных кислот экологически значимого вида – люмпена пятнистого, могут быть использованы и при составлении кормов для эффективного выращивания рыб северных регионов в аквакультуре, учитывая то, что в последнее время активно развивается направление культивирования холодноводных морских рыб (Журавлева, 1996; Svasand et al., 2004), а также при разработке биологически активных веществ особой ценности. Результаты работы могут быть использованы в комплексной эколого-биохимической индикации состояния ихтиофауны арктического региона на организменном и популяционном уровне и для оценки приспособительных возможностей у гидробионтов северных широт при определении границ их толерантности в условиях изменения климата.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены в виде 9 устных и 8 стендовых докладов: на Международном конгрессе «International Congress on the Biology of Fish» (Эдинбург, 2014); Международной конференции «Комплексные исследования природы Шпицбергена и прилегающего шельфа» (Мурманск, 2014); II Всероссийской Интернет – конференции с международным участием «Липидология – наука XXI века» (Казань, 2014); Международной конференции «Arctic Change 2014» (Оттава, 2014); Международной конференции «Arctic Frontiers 2015 - Climate & Energy» (Tromsø, 2015); Международном семинаре и конференции «Gordon Research Conference. Polar Marine Science» (Лукка, 2015); Международной конференции «39th Annual Larval Fish Conference» (Вена, 2015); Международной конференции «Функционирование и динамика водных экосистем в условиях климатических изменений и антропогенных воздействий», посвященной памяти выдающегося гидробиолога, чл.-корр. АН СССР проф. Г. Г. Винберга (1905-1987) (Санкт-Петербург, 2015), XXVIII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2016), Российско-финском научном семинаре по теме «Biochemical biomarkers for environmental bioindication and biomonitoring» (Петрозаводск, 2016); 57th International Conference on the Bioscience of Lipids (Chamonix - Mont Blanc, 2016); Конгрессе Университета Арктики (UАrctic-2016) (Санкт-Петербург, 2016); XV Всероссийском совещании с международным участием по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика Л.А. Орбели и 60-летию ИЭФБ РАН (Санкт-Петербург, 2016); Annual meeting SEB (Gothenburg, 2017); Международная конференция «Живая природа Арктики: сохранение биоразнообразия, оценка состояния экосистем» (Архангельск, 2017), Международная конференция «Young Biologists Science Week-2017» (Петрозаводск, 2017).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 27 работ, их них 5 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов научных исследований, и 22 тезиса и материалов докладов.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 4-х глав: обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, а также заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 164 страницах, документирована 26 рисунками, 17 таблицами. Список литературы содержит 309 источников, из них 174 иностранные.
ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА
Автор принимал участие лично во всех этапах подготовки диссертационной работы: при постановке и решении цели и задач исследования, проведении экспериментов, сборе полевого материала, статистической обработке и анализе данных, в подготовке публикаций на основе полученных результатов.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает искреннюю признательность и благодарность преподавателям и наставникам: научному руководителю – д.б.н., проф., чл.-корр. РАН Н. Н. Немовой, научному консультанту – к.б.н., зав. лаб. экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН С. А. Мурзиной, научному консультанту – к.б.н., в.н.с. З. А. Нефедовой, а также другим сотрудникам лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН – д.б.н., г.н.с. А. Л. Рабиновичу, д.б.н., в.н.с. Л. П. Смирнову, к.б.н., в.н.с. П. О. Рипатти, к.б.н., в.н.с. Т. Р. Руоколайнен, главному химику Л. В. Марковой. Отдельная благодарность д.б.н., проф., зав. лаборатории паразитологии животных и растений ИБ КарНЦ РАН Е. П. Иешко за ценную профессиональную помощь, научные дискуссии и ценные рекомендации по работе с публикациями. Глубокая благодарность норвежским коллегам: к.б.н., проф. С. Фальк-Петерсену, д.б.н., проф. Й. Берге, к.б.н. проф. О.Й. Лонне за ценные советы и всестороннюю помощь в организации экспедиций на норвежском научном судне «Helmer Hanssen» (UiT), а также автор выражает признательность судовой команде за помощь в полевых работах на борту.
Исследование проводилось при поддержке программы Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-1410.2014.4, Программы Президиума РАН «Поисковые фундаментальные научные исследования в интересах развития Арктической зоны РФ», проекта «Эколого-биохимическая характеристика устойчивости гидробионтов Арктической зоны России в условиях изменения климата» (№ 0221-2016-0001), РФФИ (№ 17-04-00466), международного проекта ES504895 «Timing of ecological processes in Spitsbergen fjords» (SpitsEco).
|
