Учебно-методический комплекс дисциплины «Основы биотехнологии»
|
Скачать 4.4 Mb.
|
Рис. 17. Ectothiorhodospora mobilis со стопками фотосинтетических ламелл. Электронная микрофотография ультратонкого среза (150000 х ). ПМ- плазматическая мембрана; Р-рибосомы; СЛ-стопка ламелл; 1-наружный слой клеточной стенки; 2-внутренний слой клеточной стенки; 3 и 4-наружный и внутренний электронопрозрачные промежуточные слои. Клеточная стенка у бактерий не жесткая, как стальной панцирь, а тонкая и эластичная, как кожаная покрышка футбольного мяча. Подобно тому как мячу придает упругость надутая камера, клеточной стенке придает определенную упругость плотно прилегающий к ней изнутри протопласт. Внутреннее давление (тургор) обусловлено осмотическими факторами. Осмотическим барьером служит плазматическая мембрана: она полупроницаема и контролирует проникновение в клетку и выход из нее растворенных веществ. В отличие от плазматической мембраны клеточная стенка проницаема для солей и других низкомолекулярных соединений. Плазмолиз. В обычных условиях концентрация cахаров и солей осмотически активных веществ - внутри клетки выше, чем в окружающей среде. Содержимое клетки по осмотическому давлению эквивалентно 10-20%-ному раствору сахарозы, и в клетку поступает столько воды, сколько допускает растяжимость ее стенки. Если повысить осмотическое давление внешней среды (например, путем добавления cахаров или мочевины), вода будет оттягиваться из клетки. В конце концов протопласт сожмется и плазматическая мембрана отделится от клеточной стенки. Такой процесс, происходящий в гипертонической среде, называют плазмолизом. Именно явление плазмолиза у крупных бактериальных клеток позволяет нам убедиться в том, что плазматическая мембрана у них окружена клеточной стенкой. Как плазматическую мембрану, так и клеточную стенку окрашивает водорастворимый основной краситель виктория синий. Окрашивание по Граму. Клеточная стенка, по-видимому, ответственна также за окрашивание по Граму. Способность или, наоборот, неспособность окрашиваться в темно-фиолетовый цвет при использовании метода, предложенного в 1884 г. Грамом, служит важным таксономическим признаком, с которым коррелируют другие свойства бактерий. Процедура окрашивания по Граму начинается с обработки фиксированных бактериальных клеток основным красителем кристаллическим фиолетовым. Затем следует обработка раствором иода. Иод образует с кристаллическим фиолетовым комплекс, нерастворимый в воде и плохо растворимый в спирте и ацетоне. После этого клетки «дифференцируют», обрабатывая их спиртом: грам-положительные клетки удерживают при этом комплекс краситель - иод и остаются синими, а грам-отрицательные обесцвечиваются. Для того чтобы сделать их видимыми, их дополнительно окрашивают контрастным красителем фуксином. Если после окрашивания по Граму обработать грам-положительные клетки лизоцимом, протопласты остаются окрашенными, однако под действием спирта они обесцвечиваются. Прорастающие споры Bacillus subtilis и первые генерации клеток после прорастания спор ведут себя как грам-отрицательные организмы. Лишь позднее они становятся грам-положительными. Эти наблюдения показывают, что окрашивающий комплекс находится в протопласте или на его поверхности и что у грам-положительных бактерий его удерживает главным образом клеточная стенка, которая препятствует его экстрагированию. Основной «каркас» стенки бактериальной клетки. Для понимания структуры клеточной стенки бактерий важно прежде всего указать на сходство ее опорного «скелета» с полимерами -D-глюкозы-целлюлозой и хитином. Целлюлоза - главный компонент клеточных стенок у высших растений, водорослей и оомицетов. У бактерий целлюлоза в качестве материала клеточной стенки не встречается, однако она соединяет клетки Sarcina ventriculi в большие пакеты. Кроме того, целлюлозу выделяют Acetobacter aceti subsp. xylinum в форме тонких фибрилл в среду, и она придает пленке «уксусного гриба» ("Mycoderma aceti") прочную кожистую консистенцию.  Хитин - материал наружного скелета членистоногих и некоторых других животных. Он является важнейшим компонентом клеточных стенок больших групп грибов (базидиомицетов, аскомицетов и зигомицетов). Структурными элементами хитина являются остатки N-ацетилглюкозамина, соединенные между собой подобно глюкозным остаткам в целлюлозе, т.е. 1,4-гликозидными связями.  Опорный скелет бактериальной стенки тоже состоит в значительной степени из однородного полимера - пептидогликана муреина. Эта макромолекула - гетерополимер, построенный из цепочек, в которых чередуются остатки N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты (N-ацетилглюкозаминлактата), соединенные между собой -1,4-глико-зидными связями.  Рис. 18. Структура муреина Escherichia coli. Гетерополимерные цепочки, состоящие из чередующихся остатков М-ацетилглюкозамина (N-АцГлю) и М-ацетилмурамовой кислоты (N-АцМур), связаны между собой пептидными мостиками. Слева - детальное строение фрагмента, изображенного справа в рамке. Треугольниками отмечены связи, расщепляемые лизоцимом (мурамидазой) и специфической муроэндопептидазой. Справа внизу -схематическое перспективное изображение структуры однослойного поперечносшитого муреинового мешка, состоящего из N-АцГлю (G) и N-АцМур (M). m-Dpm - .мезо-диаминопимелиновая кислота. Такие неразветвленные гетерополимерные цепи образуют основу муреина. Остатки мурамовой кислоты через лактильные группы соединены пептидной связью с аминокислотами. К типичным аминокислотам муреина относятся L-аланин, D-глутаминовая кислота, .мезодиаминопимелиновая кислота или L-лизин и D-аланин. Диаминокислоты мезо- (или LL-) диаминопимелиновая кислота и L-лизин играют большую роль в межмолекулярных сшивках, так как образуют пептидные связи с участием обеих аминогрупп и, таким образом, могут связать две гетерополимерные цепи между собой (рис. 18). Место диаминопимелиновой кислоты или лизина могут занять орнитин или диаминомасляная кислота. Пептидными мостиками гетерополимерные цепи связаны между собой в мешкообразную гигантскую молекулу - муреиновый мешок. Классическая модель, согласно которой эти цепи образуют замкнутые кольца, которые в клеточной стенке палочковидной бактерии расположены как обручи или перпендикулярно к ним, явно несостоятельна. Скорее всего длина гетерополимерных цепей составляет не больше десятой части окружности бактерии. По-видимому, цепи, состоящие из 50-500 дисахаридных звеньев (N-ацетилглюкозамин + N-ацетилмурамовая кислота), связаны между собой пептидными мостиками и образуют менее регулярную сеть, чем предполагалось прежде. Особого внимания заслуживает то, что в бактериальной стенке содержатся структуры и вещества, которых нет у животных и растений: таковы, например, чередующаяся последовательность N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты; не встречающаяся в составе белков мезо-диаминопимелиновая кислота; D-формы аланина и глутаминовой кислоты. Эти структурные элементы составляют ахиллесову пяту бактерий, используемую врачами в борьбе с инфекцией. По компонентам и структуре клеточной стенки и биохимическим механизмам ее синтеза бактерии коренным образом отличаются от животных и растений. Поэтому лекарственные препараты, специфически воздействующие только на бактериальные стенки и на процесс их синтеза, должны быть безвредными для высших организмов. Наличие в клеточных стенках пептидогликанового слоя - характерная особенность всех прокариот. Исключение составляют только архебактерии и немногие другие группы и виды. Муреиновый мешок выполняет функцию опорного каркаса клеточной стенки. На нем откладываются и его инкрустируют различные другие вещества. По строению этого каркаса, а также по содержанию других веществ в клеточной стенке грам-положительные бактерии отличаются от грам-отрицательных. Клеточная стенка грам-положительных бактерий. У грам-положи-тельных бактерий доля муреиновой сетки составляет 30-70% сухой массы клеточной стенки (толщиной в 40 слоев). Вместо м-диаминопимелиновой кислоты часто содержатся LL-диаминопимелиновая кислота или лизин. У Staphylococcus aureus тетрапептидные боковые цепи мурамовой кислоты связаны между собой межпептидными (например, пентаглициновыми) цепочками. Участвующие в образовании таких структур аминокислоты варьируют от вида к виду. Видоспецифическое строение опорного каркаса представляет собой хороший таксономический признак. В клеточной стенке грам-положительных бактерий полисахариды, если они вообще имеются, связаны между собой ковалентно. Содержание белков невелико. Характерная особенность-наличие тейхоевых кислот; это цепи, состоящие из 8-50 остатков глицерола или рибитола, связанных между собой фосфатными мостиками. Некоторые из тейхоевых кислот содержат эритритол или маннитол. Тейхоевые кислоты, вероятно, через фосфат связаны с муреином по типу амида. Клеточная стенка грам-отрицательных бактерий. У грам-отрицательных бактерий муреиновая сеть однослойная (рис. 18) и составляет менее 10% сухой массы клеточной стенки (у Escherichia coli). Муреин содержит только мезодиаминопимелиновую кислоту и не содержит лизина; межпептидные мостики отсутствуют. Строение муреинового мешка у всех грам-отрицательных бактерий одинаково. Наряду с этим опорным каркасом имеются большие количества липопротеинов, липополисахаридов и других липидов, которые как бы наклеены снаружи на муреиновый каркас. Они связаны ковалентно и составляют до 80% сухой массы клеточной стенки. Для сохранения стабильности липополиса-харидного слоя, по-видимому, необходимы ионы кальция. У многих грам-отрицательных бактерий муреиновый слой становится доступным для воздействия лизирующего муреин фермента лизоцима только после обработки ЭДТА (этилендиаминтетраацетатом) для удаления Са2 +. Этот комплексообразующий агент вызывает освобождение части липо-полисахаридов. Тейхоевые кислоты у грам-отрицательных бактерий до сих пор не были обнаружены. Действие лизоцима и пенициллина. Структура клеточной стенки и муреина была выяснена в основном в связи с изучением действия лизоцима и пенициллина на бактерии. Открытый А. Флемингом (1922) лизоцим является бактерицидным ферментом, содержащимся в слезной жидкости, в носовой слизи и в яичном белке; лизоцим выделили также из бактерий (Escherichia coli, Streptomyces) и бактериофагов. При воздействии лизоцима на суспензию грам-положительных бактерий наблюдают быстрое ее просветление. Micrococcus luteus (lysodeikticus) лизи-руется уже при концентрации 1 мкг лизоцима на 1 мл. Для лизиса клеток Bacillus megaterium необходима концентрация лизоцима 50 мкг/мл, а многие грам-отрицательные бактерии растворяются только тогда, когда к суспензии добавлен также комплексообразующий агент (ЭДТА). Лизоцим разрывает в муреине гликозидную связь между углеродом 1 N-ацетилмурамовой кислоты и углеродом 4 N-ацетилглюкозамина. При этом полисахаридные цепи расщепляются до дисахаридных фрагментов, состоящих из этих двух сахаров (рис. 18). Таким образом, лизоцим является N-ацетилмурамидазой. Можно избежать полного разрушения бактериальных стенок, проводя лизис в изотоническом или слабо гипертоническом (0,1-0,2 М) растворе сахарозы. В этих условиях под действием лизоцима из клеток образуются чрезвычайно чувствительные к осмотическим условиям округлые «протопласты». В гипертонических и изотонических средах протопласты стабильны; в гипотонических средах они лопаются, после чего остаются лишь «тени» (остатки плазматических мембран). Протопластами следует называть только такие округлившиеся клетки, у которых нет никаких остатков клеточной стенки, т.е. нельзя обнаружить ни мурамовой кислоты, ни специфической аминокислоты клеточной стенки - диаминопимелиновой, не встречающейся в белках. Лизис клеточной стенки не приводит к нарушению метаболизма; протопласты дышат подобно интактным клеткам, образуют споры, если процесс споруляции уже был инициирован, но не адсорбируют фагов. Наряду с лизоцимом существует много других ферментов, лизирующих муреиновый каркас. Муроэндопептидазы, чаще всего получаемые из бактерий, весьма специфическим образом расщепляют пептидные связи, участвующие в поперечной сшивке. Например, выделенная из Е. coli эндопептидаза разрывает связь между D-аланином и мезо-диаминопимелиновой кислотой (отмеченную на рис. 18). Другие ферменты расщепляют связи в иных местах. Антибиотик пенициллин действует главным образом на грам-положительные бактерии (стафилококки и пневмококки), а также и на некоторые грам-отрицательные клетки (гонококки, менингококки, энтеробактерии), убивая их. Однако его бактерицидному действию подвержены только растущие бактерии; нерастущие, «покоящиеся» клетки остаются незатронутыми. Самый примечательный феномен, наблюдаемый при воздействии пенициллина, - это появление так называемых L-форм, которые образуются из нормальных бактериальных клеток в результате несбалансированного роста в длину и в толщину. При этом исходные палочковидные клетки увеличиваются в объеме во много раз. На агаризованных питательных средах такие гигантские клетки могут некоторое время сохранять жизнеспособность. Если воздействовать пенициллином на растущие клетки в гипотоническом растворе, то они лопаются. В изо- и гипертонических средах палочки превращаются в шаровидные образования (рис. 19), получившие название L-форм или «сферопластов». Последние отличаются от протопластов тем, что сохраняют остатки клеточной стенки (анализ обнаруживает следы мурамовой и диаминопимелиновой кислот). Пенициллин нарушает процесс образования клеточной стенки. Образование клеточной стенки. Биосинтез и встраивание структурных компонентов муреина в пептидогликановый скелет можно разделить на три этапа (рис. 20). Первые стадии биосинтеза осуществляются в цитоплазме. Здесь образуется пентапептид мурамовой кислоты. Синтез начинается с образования N-ацетилглюкозамин-1-фосфата; в ряде последовательных ферментативных реакций образуется лактиловый эфир, к которому присоединяются пять аминокислот. Во время этого процесса растущая молекула остается связанной с UDP (уридиндифосфатом), который служит носителем. Связывание пентапептида мурамовой кислоты с N-ацетилглюкозамином и присоединение пяти остатков глицина происходит на втором этапе синтеза на плазматической мембране. Для осуществления этого этапа гидрофильная молекула должна быть превращена в липофильную, что достигается путем замены UDP С55-полиизопреноидом-ундекапренилфосфатом. Это соединение делает возможным перенос готового компонента клеточной стенки через плазматическую мембрану. На третьем этапе происходит его встраивание в пептидогликановый скелет и образование пептидных связей. Эта поперечная сшивка осуществляется путем транспептидирования, при котором расщепляется связь между двумя остатками D-аланила и освободившаяся карбоксильная группа связывается с аминогруппой лизина второго олигопептида, а концевой D-аланин освобождается. При встраивании освобождается также ундекапренилдифосфат; он подвергается гидролизу, и получающийся ундекапренилмонофосфат используется в следующем цикле. Этот же липид служит переносчиком и при синтезе других полимеров, расположенных вне цитоплазматической мембраны, таких как полисахариды, липополисахариды и целлюлоза.  Рис. 19. Escherichia coli после обработки пенициллином (100 ед. на 1 мл питательной среды, 90 мин). 9000 х. Пенициллин не влияет на синтез структурных компонентов муреина но препятствует поперечной сшивке, осуществляемой путем транспептидирования; однако удлинению гетерополимерных цепей путем транс-гликозилирования он не мешает. В результате воздействия пенициллина ряд бактерий выделяет в среду наряду с UDP-пентапептидом также и несшитые пептидогликановые цепи. Образование клеточной стенки могут нарушать и производные пенициллина; подобным же образом действуют цефалоспорины, ристоцетины, ванкомицин, бацитрацин и циклосерин. Сферопласты возникают также в присутствии глицина и D-аминокислот или в результате так называемого анаэробного лизиса.  |
Похожие:
 |
Учебно-методический комплекс дисциплины обсужден на заседании кафедры... Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины обсужден на заседании кафедры... Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
 |
Учебно-методический комплекс дисциплины основы психодиагностики направление... Учебно-методический комплекс составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Основы культуры речи» Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «основы управления проектами» Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями федерального государственного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Торговое оборудование» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «организационное поведение» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Русский язык и культура речи» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Системное программное обеспечение» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методического комплекса дисциплины «Основы культуры речи»... Учебно-методический комплекс составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины обсужден на заседании кафедры... Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины архитектура ЭВМ 090104. 65... Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Таможенное право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «коммерческое право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |