Морфофункциональные аспекты повышения эффективности экстракорпорального оплодотворения
|
Скачать 0.66 Mb.
|
|
На правах рукописи САМОЙЛОВА АЛЛА ВЛАДИМИРОВНА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ 03.00.25- гистология, цитология, клеточная биология 14.00.01- акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук САРАНСК 2009 Р  абота выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования«Чувашский государственный университет им. И.Н.Ульянова» Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Любовцева Любовь Алексеевна доктор медицинских наук, профессор Шарапова Ольга Викторовна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, академик РАМН профессор Волкова Ольга Васильевна доктор медицинских наук, академик РАМН профессор Адамян Лейла Владимировна доктор биологических наук, профессор Кругляков Павел Павлович Ведущая организация: ГУ НИИ морфологии человека РАМН Защита состоится «___»__________2009г. в___часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.01 при ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарёва» по адресу: 430000, республика Мордовия г. Саранск, ул. Большевистская, 68. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарёва». Автореферат разослан «____ »__________________ 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета д  октор биологических наук, профессор Балашов В.П.АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. В настоящее время демографическая ситуация в России оценивается как критическая, что обусловлено значи-тельным снижением рождаемости, ростом общей смертности (Шарапова О.В., 2007; Кулаков В.И., 2008). При этом продолжает оставаться высокой частота бесплодных браков (Корсак В.С., 2007; Аншина М.Б., 2008). В Чу-вашии этот показатель колеблется около 18% (Суслонова Н.В., 2008). Наиболее эффективным методом преодоления бесплодия сегодня является метод вспомогательной репродуктивной технологии – экстра-корпоральное оплодотворение (ЭКО) (Калинина Е. А., 2005; Радзинский В. Е., 2006). Однако, несмотря на внешнюю простоту выполнения процедуры ЭКО, частота наступления беременности при применении данного метода лечения не превышает 35-39 % (Краснопольская К.В., 2003; Калинина Е. А., 2005). Предложения многочисленных исследователей повышения эффек-тивности ЭКО в основном основывались на совершенствовании клини-ческих лечебно-диагностических мероприятий (Светлаков А.В. с соавт., 2002, Смольникова В. Ю., 2002; Калинина Е. А., 2005; Кострова Е. В., 2007; Rossin-Amar B., 2006; Myers E.R. et al., 2008). Изучению тонких молеку-лярно-биохимических механизмов оплодотворения in vitro, имплантации и наступлению беременности посвящено необоснованно мало работ. Безусловно результативность экстракорпорального оплодотворения во многом зависит от успешной имплантации и от качества получаемых для оплодотворения яйцеклеток (Светлаков А.В. с соавт., 2002; Ильина А.И. с соавт., 2008). Поэтому изучение способов оценки качества эндометрия, позволяющих составить прогноз возможного исхода ЭКО, а в конечном итоге воздействовать на повышение результативности ЭКО, на сегодня имеет очень важное научно-практическое значение (Ольховская М.А., 2007). В настоящее время доказано, что решающую роль в имплантации играет рецептивность эндометрия, т.е. количество функционально полно-ценных рецепторов ткани эндометрия к соответствующим стероидным гормонам (Судома И. А., 2006; Кострова Е. В., 2007; Lecce G. еt al., 2001). Важное значение в процессе имплантации играет сосудистый и гемостазиологический статус как в целом организме, так и, в особенности, в области формирования плацентарной площадки. Известно, что стимуляция суперовуляции в процессе экстракорпорального оплодотворения сопро-вождается явлениями гиперкоагуляции и активацией внутрисосудистого свертывания (Джинджгава Ж.Г., Бицадзе В.О., 2005). В этой связи пред-ставляется весьма актуальным изучение развернутой картины системы гемостаза с точки зрения влияния этой системы на результативность программы экстракорпорального оплодотворения (Долгов В.В., Свирин П.В., 2005; Голованова С.Ю., Сабирова Ф.М., 2007; Di Simone N. et al., 2007). Ещё одним важным компонентом процесса имплантации, безусловно, являются оплодотворенные эмбрионы (Воробьева О. А., 2001; Светлаков А.В. с соавт., 2002; Ali A. et al., 2006). Огромное значение для оценки функциональной активности гамет имеет фолликулярная жидкость. Изучались многие параметры фолликулярной жидкости – ингибин, гомоцистеин, лептин, микроэлементы медь и цинк, биологически активные вещества гистамин, серотонин и катехоламины, альфа-2-микроглобулин фертильности (АМГФ), хорионический гонадотропин (ХГЧ) (Любовцева Е.В., 2005; Долгова И.Ю., 2006; Ильина А.А. с соавт., 2008; Hill M.J., Honolulu H.I., 2007; Takahashi C., 2007). Однако все эти работы имеют односторонний характер и не дают полного и однозначного ответа на вопрос о значении биохимического состава фолликулярной жидкости в процессе имплантации. При одновременной оценке таких механизмов, как клеточная дифференцировка (созревание яйцеклеток и состояние рецепторного аппарата), клеточный иммунитет (процессы отторжения и реакции немедленного и замедленного типа), состояние микрососудистого гомеостаза, представляется очень важным определить роль биологически активных веществ гистамина, серотонина и катехоламинов (Любовцева Л.А., 1993; Хромых Л.М. с соавт., 2001; Lalitkumar P.G.L. et al., 1998; Sozen I. Et al, 2002). Роль каждого из них в вышеуказанных процессах бесспорна, однако, сведения о значимости их в результативности экстракорпорального оплодо-творения практически отсутствуют. Таким образом, изучение новых механизмов имплантации в процессе экстракорпорального оплодотворения на тонком морфологическом и молекулярно-биохимическом уровнях может позволить сделать ещё один шаг в повышении эффективности данного метода лечения бесплодия. Исходя из этого целью настоящей работы явилось: Выявление морфофункциональных механизмов повышения эффективности экстракорпорального оплодотворения. Задачи исследования:
Научная новизна. Впервые выявлена различная экспрессия стероидных рецепторов эндометрия в течение менструального цикла у женщин с различными исходами экстракорпорального оплодотворения. Установлена корреляционная взаимосвязь между уровнем стероидных рецепторов эндометрия и концентрацией стероидных и гонадотропных гормонов в периферической крови у пациенток программы экстракорпорального оплодотворения. Впервые доказано положительное влияние повышенной концентрации гистамина и пониженной концентрации серотонина в фолликулярной жидкости и периферической крови на результат экстракорпорального оплодотворения Впервые выявлена корреляционная взаимосвязь гиперагрегационного состояния периферической крови у женщин с различными исходами экстракорпорального оплодотворения с уровнем гистамина и серотонина в периферической крови. Впервые установлено отрицательное воздействие повышенной концентрации меди в фолликулярной жидкости на исход экстракорпораль-ного оплодотворения. Доказана корреляционная взаимосвязь микроэлемент-ного состава и концентрации альфа-2-микроглобулина фертильности в фолликулярной жидкости. В проведенных исследованиях выявлены изменения пролиферативных процессов и морфологического строения матки мышей при сочетанном хроническом воздействии экзогенных эстрогенов, пролактина и глюкокортикоидов в сравнении с действием только эстрогенов. Впервые изучены особенности экспрессии эстрогеновых и прогес-тероновых рецепторов матки мышей при сочетанном хроническом воздействии экзогенных эстрогенов, пролактина и глюкокортикоидов. Практическая значимость. Выявленные морфофункциональные механизмы, влияющие на результат экстракорпорального оплодотворения, позволили сформировать группы непредотвратимых и условно-предотвратимых факторов, воздействие на которые позволит повысить эффективность лечения бесплодия. Внедрение в повседневную практику перед включением в программу лечения методом ЭКО лабораторного исследования рецепторного статуса эндометрия, биоаминного состава периферической крови и гемостазиограммы позволяют дифференцированно подходить к назначению соответствующего лечения с целью повышения конечной эффективности экстракорпорального оплодотворения. Положения, выносимые на защиту:
Апробация работы и публикации. По результатам работы опубликовано 50 работ, в том числе 12 в изданиях, рецензируемых ВАК РФ. Издана монография «Современные методы диагностики и лечения бесплод-ного брака» (Чебоксары 2006), издано учебное пособие для студентов, курсантов и практикующих врачей «Лабораторная диагностика бесплодия в браке» (Чебоксары 2006). Материалы работы использовались при написании раздела «Применение высокотехнологичных методов лечения бесплодия в браке» республиканской целевой программы минздравсоцразвития Чувашии на 2006-2008 годы «Дети Чувашии» (Чебоксары 2005). Результаты работы доложены на XV-XVIII международных научно-практических конференциях Российской ассоциации Репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Чебоксары, 2005; Ростов-на-Дону, 2006; Казань, 2007; Самара, 2008), первом международном конгрессе по репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи» (Москва, 2006), на научно-практической конференции, посвященной 60-летию Республиканской клинической больницы № 1 (Чебоксары, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Информационные технологии в профессиональной деятельности и научной работе» (Йошкар-Ола, 2008), на 2-м региональном научном форуме «Мать и дитя» (Сочи, 2008), на IV съезде акушеров-гинекологов России (Москва, 2008), в научно-практическом симпозиуме «Лабораторная медицина: инновационные технологии в аналитике, диагностике, образовании, организации» (Москва, 2008). Основные положения диссертационной работы доложены на объединённом заседании кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, нормальной физиологии, патологической физиологии, биологии и кафедры акушерства и гинекологии ФГОУ ВПО «Чувашского государственного университета им. И.Н.Ульянова» и кафедры акушерства и гинекологии ГОУ «Институт усовершенствования врачей». Внедрение результатов работы. Результаты работы внедрены в протоколы обследования пациенток перед включением в программу лечения пациенток методом ЭКО в амбулаторном отделении ГУЗ «Президентский перинатальный центр» минздравсоцразвития Чувашской республики, в протоколы морфологического исследования биоптатов эндометрия ГУЗ «Патологоанатомическое бюро» минздравсоцразвития Чувашской республики. Организована совместная гистохимическая лаборатория ГУЗ «Президентский перинатальный центр», ГУЗ «Патологоанатомическое бюро» минздравсоцразвития Чувашской республики и кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Чувашского госуниверситета. Внедрена в практическую деятельность разработанная автором прикладная программа для ЭВМ «Алгоритм ведения бесплодных супружеских пар» (Свидетельство РФ № 2005611629, 03.05.2005). Результаты работы используются в учебном процессе на кафедрах акушерства и гинекологии ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н.Ульянова» и ГОУ «Институт усовершенствования врачей» и на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии, биологии и патологической физиологии ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н.Ульянова». Объём и структура диссертации. Работа изложена на 264 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, главы собственных исследований и обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В работе содержится 68 рисунков, 61 таблица. Список литературы включает 330 работ, в том числе 145 отечественных и 185 зарубежных источников. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Для выполнения поставленных задач исследования работа была разделена на этапы с разработкой программы исследования (таб. 1). На первом этапе проведен ретроспективный анализ результатов обследования в амбулаторном отделении ГУЗ «Президентский перинатальный центр» 1912 женщин, которым было выполнено экстракорпоральное оплодотворение за период 1999-2007 г.г.. Все обследованные пациентки были разделены на две группы в зависимости от исходов лечения методом экстракорпорального оплодотворения: I группа - пациентки с наступившей беременностью (положительный результат лечения ЭКО); II группа - пациентки с нена-ступившей беременностью (отрицательный результат лечения ЭКО). В целях оптимизации методов диагностики и лечения, сокращения сроков обследования супружеских пар разработана индивидуальная карта и алгоритм обследования пациентов (Свидетельство РФ № 2005611629). В аналитической карте было подвергнуто многофакторному анализу 58 клинических параметров анамнестических данных, результатов лабораторного и инструментального обследования пациенток и результатов лечения методом экстракорпорального оплодотворения. На втором этапе сформированы репрезентативные выборки для проведения лабораторных исследований: морфологического строения и рецепторного статуса эндометрия, биоаминного состава периферической крови и фолликулярной жидкости, биохимического, гистохимического и микроэлементного состава фолликулярной жидкости, гемостазиологического статуса периферической крови (таб. 1). Методы исследования:
Таблица 1 Программа исследования
Экспериментальный этап работы выполнен на лабораторных половозрелых мышах CFW. Модель десентизации яичников в программе ЭКО в эксперименте достигали овариэктомией. Затем животным в течение 30 дней вводили подкожно раствор эстрадиола дипропионата в дозе 2 мкг/100 г 1 раз в неделю (n=21), эстрадиола дипропионата и овечьего пролактина в разведении 0,15 М раствора натрия хлорида подкожно 1 раз в сутки в дозе 0,25 мг/100 г в течение 1 мес. (n=21), эстрадиола дипропионата и дексаметазон в питьевой воде в дозе 2 мг/л в течение 30 дней (n=25), эстрадиола дипропионата и синтетического АКТГ продлённого действия в дозе 10 мкг на 100 г ежедневно 30 дней (n=25). После окончания медикаментозного воздействия через 48 часов после последней инъекции эстрадиола у животных под глубоким эфирным наркозом забирали матку и готовили поперечные гистологические срезы. Гистологические препараты окрашивали железным гематоксилином для выявления морфологических изменений. Для иммуногистохимического выявления рецепторов к эстрадиолу и прогестерону использовали кроличьи поликлональные антитела к прогестероновым и эстрогеновым рецепторам («Santa Cruz Biotechnology» США). Выявление бромдезоксиуридин-положительных клеток осущест-влялось стрептавидин-иммуногистохимческим методом с последующим под-счётом процента положительно окрашенных клеток. В результате проведённого исследования были изучены механизмы комплексного влияния морфофункциональных факторов на процессы имплантации и наступление беременности при лечении женского бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения. Все эти параметры рассматривались во-первых, с точки зрения их отдельного самостоятельного или совокупного влияния на результативность ЭКО, а, во-вторых, с точки зрения возможного воздействия на изученные факторы с целью повышения результативности ЭКО. В конечном итоге были сформированы группы предотвратимых и условно-предотвратимых причин, влияющих на исход экстракорпорального оплодотворения. Для оценки клинико-анамнестических данных была применена специально разработанная карта анализа причин бесплодного брака (Свидетельство РФ № 2005611629). Из 58 параметров результатов клинического, специального гинекологического, лабораторного, инструментального методов обследования различия между группами разной степени достоверности были выявлены по 32 показателям (т.е. в 55, 2 % случаев). Однако выявлено, что лишь 16 факторов имеют важное совокупное влияние на результат ЭКО (таб. 2). Каждый из этих 16 факторов по отдельности имеет несильно выраженные коэффициенты корреляции, а коэффициент совокупной множественной корреляции и коэффициент множественной детерминации имеют очень высокие показатели: соответственно R=0,97 и R2 = 0,95. Таблица 2 Факторы, наиболее существенно влияющие на результативность ЭКО
На основании математического моделирования разработана прогностическая многофакторная модель:  y= -1607,692*X1+272,967*X2 - 36,203*X3 - 309,619*X4+75,113*X5 - 392,781*X6 --87,053*X7 - 36,034*X8+1,828*X9+286,900*X10 - 0,082*X11+83,020*X12 - 12,146*X13+75,363*X14+ +118,607*X15 - 0,304*X16 Переменные данной модели представляют 16 факторов существенного совокупного влияния на исход ЭКО (таб. 2). Коэффициент множественной детерминации R2 констатирует, что факторы, учтенные в модели, объясняют 95,5% дисперсии результативного признака (y), а на долю неучтённых факторов приходится лишь 4,5% её дисперсии. Статистический критерий Фишера: Fнабл= 232,09, Fкрит=F(1;175;0,05)= 3,89 подтверждает значимость модели в целом. На рис. 1 приведена графическая интерпретация математического моделирования исходных данных и построенной математической многофакторной модели прогностических данных. Ряд 1 представляет графическое отображение математического анализа влияния изученных параметров на результативность ЭКО в течение 12 месяцев наблюдения. Ряд 2 отображает прогностическую модель возможного результата ЭКО при совокупном учитывании изученных признаков. На рисунке отчётливо видно полное совпадение ретроспективного и проспективного анализа в восьми из двенадцати месяцев. Это доказывает, что построенная математическая многофакторная модель действительно отражает существенное влияние совокупности изученных признаков на результативность ЭКО. Поскольку все клинико-анамнестические данные являются уже имеющимися факторами на момент включения пациенток в программу лечения ЭКО, нет возможности изменить существующий факт. Следо-вательно, данные факторы могут быть отнесены в группу непредотвратимых, которые неизбежно оказывают влияние на исход ЭКО.  Рис. 1. Исходная и прогностическая математическая модель влияния клинико-анамнестических данных на результат ЭКО. Примечание: ряд 1 - исходные данные, Ряд 2 построенная математическая многофакторная модель. Результаты иммуно-гистохимического исследования рецепторного статуса эндометрия. В ходе исследования было установлено, что у пациенток с различным исходом программы ЭКО ретроспективно выявляется различная экспрессия рецепторов стероидных гормонов (рис. 2 a-d). Наблюдается преобладание эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в фазе пролиферации, особенно в позднюю стадию, по сравнению с фазой секреции (таб. 3). Это совпадает с данными других исследователей (Mylonas I., et al., 2000). При этом выявлено, что у пациенток I группы экспрессия эстрогеновых рецепторов в эндометрии максимальна в среднюю стадию фазы пролиферации в эпителии желез, в последующем снижается в секреторной фазе (рис. 2a, 3a). Это вполне согласуется с концепцией роста концентрации эстрогеновых рецепторов в периовуляторный период (Побединский Н.М. с соав., 2000, Oehler M.K., et al., 2000). Концентрация эстрогеновых рецепторов в строме у пациенток этой же группы постепенно снижается от фазы проли-ферации к фазе секреции и повышается в поздней стадии фазы секреции. Во II группе с отрицательным результатом лечения наблюдается достоверное увеличение эстрогеновых рецепторов в эпителии желез эндометрия в ранней и поздней стадии фазы пролиферации и достоверное увеличение концентрации эстрогеновых рецепторов в клетках стромы по сравнению с таковыми показателями у женщин с положительным результатом лечения. Достоверно ниже концентрация эстрогеновых рецепторов в клетках стромы эндометрия в средней и поздней стадии фазы секреции у пациенток с отрицательным исходом ЭКО. Это может объяснять истинную недостаточность лютеиновой фазы цикла у женщин данной группы, поскольку эстрогеновые рецепторы рассматриваются как источник образования прогестероновых рецепторов. А с другой стороны, можно предположить недостаточное влияние эстрогеновых рецепторов стромы в данной группе на процессы ангиогенеза, которые особенно характерны для средней и поздней стадии фазы секреции. Именно в этот период предполагаются процессы имплантации оплодотворенных яйцеклеток. Прогестероновые рецепторы в ядрах эпителиальных клеток желез в обеих группах пациенток были подвержены одинаковым колебаниям в течение цикла при отсутствии достоверных различий в концентрации за исключением поздней стадии фазы секреции, где достоверно меньше выявлялось прогестероновых рецепторов у женщин с положительным результатом лечения (рис. 2 b, 2d). Экспрессия прогестероновых рецепторов в клетках стромы у женщин с положительным результатом лечения постепенно повышается в ранней и средней стадии пролиферации, снижается в поздней пролиферативной фазе и значительно увеличивается в средней и, особенно, в поздней стадии фазы секреции (рис. 2d, 3b). У женщин с отрицательным результатом лечения экспрессия прогес-тероновых рецепторов в клетках стромы достоверно повышается в поздней пролиферативной и средней секреторной фазах. Но остаётся достоверно ни-же экспрессии прогестероновых рецепторов в клетках стромы в средней и поздней стадиях фазы секреции у женщин I группы (рис. 3d). По данным ряда авторов максимальное содержание прогестероновых рецепторов в неизмененном эндометрии должно наблюдаться в позднюю стадию фазы пролиферации и раннюю стадию фазы секреции (Феськов А.М., 1999; Яманова М.В. с соав., 2003). Однако в нашем исследовании было выявлено максимальное повышение экспрессии прогестероновых рецепторов в клетках стромы эндометрия в средней и поздней стадии фазы секреции у пациенток с последующим положительным исходом ЭКО. Основываясь на современных представлениях о взаимной связи уровня половых стероидов и экспрессии рецепторов стероидных гормонов, причи-ной низкой концентрации прогестероновых рецепторов в фазу секреции мо-гут быть недостаточное количество эстрогенов или избыток прогестерона. Результаты гормональных исследований пациенток сравниваемых групп позволяют нам считать причиной недостаточности прогестероновых рецепторов эндометрия в секреторной стадии у пациенток II группы сниженный базальный уровень эстрадиола (52,5 + 2,3 пг/мл). |
Похожие:
 |
Пограничные психические расстройства у женщин с бесплодием в программе... Работа выполнена в фгу «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии Росмедтехнологий» |
 |
Программа энергосбережения и повышения энергетической эффективности... ... |
|
Программа энергосбережения и повышения энергетической эффективности... Программа энергосбережения и повышения энергетической эффективности на 2015-2018 гг |
|
К городской целевой программе «Энергосбережение и повышение энергетической... Информационная система в области энергосбережения и повышения энергетической эффективности 5 |
|
Филиал фгуп концерн «росэнергоатом» Ленинградская аэс В настоящее время все больше внимания уделяется вопросам повышения эффективности выработки электроэнергии на аэс. Одним из направлений... |
|
Саха Республикатын «ленскэй оройуон» «Ленский район» от 25 февраля 2010 года №7-12 «О внесении изменений в решение Районного Совета от 27 августа 2009 года №10-8», в... |
|
Программа повышения энергетической эффективности на территории асиновского... Приложение сводная таблица Мероприятий к программе «Повышения энергетической эффективности на территории Асиновского района Томской... |
|
Аннотации модулей образовательных программ Повышения квалификации... Повышения квалификации сотрудников образовательных учреждений по вопросам энергосбережения и энергетической эффективности |
|
К научно-методической разработке разработка технологии для повышения... ... |
|
Методические рекомендации для участников стажировочной площадки по... «Эмоционально-сенсорное развитие младших школьников как фактор повышения эффективности их учебной деятельности в рамках реализации... |
|
Курсовая работа Тема Планирование показателей повышения экономической эффективности производства |
|
Развитие научных основ и практических методов повышения эффективности технологии зерносушения |
|
1 Теоретические аспекты конкурентоспособности предприятия Именно поэтому так важно изучать конкурентов и, исходя из этого, принимать обоснованные решения в пользу повышения конкурентоспособности... |
|
Отчет ОАО "Газпром" Соединение науки и практического опыта основа повышения экологической эффективности работ |
|
Современные подходы к химиотерапии больных туберкулезом легких и... Современные подходы к химиотерапии больных туберкулезом легких и возможности повышения эффективности лечения (клинико-экспериментальное... |
|
Курсовая работа по дисциплине «Экономика фирмы» Выявление факторов и резервов повышения экономической эффективности деятельности предприятия |