Антимикробная активность препарата Миковелт и его применение при дерматомикозах и раневых инфекциях животных
|
Скачать 2.1 Mb.
|
|
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований Работа выполнена в период с июля 2006 по октябрь 2010 г на кафедре микробиологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ; НИИ биоцидов и нанобиотехнологий (г. Москва) и ООО «НПО «ВЕЛТ» (г. Оренбург). Эксперименты на животных проводили в ООО «Вет Био Сервис» (г. Москва), ООО «Вет Зоо Сервис» (г. Москва), КФХ «Корнево» (Истринский р-н, Московской обл.), в племенном овцеводческом хозяйстве института биотехнологии Национальной академии Кыргызской Республики, в ветеринарном Центре пос. Красково (Люберецкий р-н, Московской обл.), в СХПК «Верещаки», Новозыбковского района, Брянской обл., а также в виварии кафедры микробиологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, лицензированной по работе с микроорганизмами III-IV групп патогенности. Характеристика препарата Миковелт. Миковелт – лекарственное противомикробное средство в форме раствора, предназначенное для лечения сельскохозяйственных, мелких домашних, зоопарковых, лабораторных и экзотических животных, в т.ч. птиц при дерматомикозах и раневых инфекциях, а также для профилактики послеоперационных осложнений и гнойной патологии. Миковелт содержит в своем составе в качестве действующего вещества клатрат дидецилдиметиламмоний бромида с карбамидом (0,1±0,01%), а в качестве вспомогательных компонентов изопропиловый спирт (70±3,0%), метиленовый синий (0,045±0,001%) и дистиллированную воду. По внешнему виду Миковелт представляет собой не прозрачную жидкость синего цвета с запахом спирта. Действующее вещество Миковелта - клатрат дидецилдиметиламмония бромида с карбамидом обладает широким спектром антимикробного действия в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в т.ч. анаэробных и спорообразующих бактерий (стрептококков, стафилококков, эшерихий, протея, синегнойной палочки, бацилл, клостридий, фузобактерий и др.), а также микроскопических грибов - возбудителей кандидозов и дерматомикозов, в т.ч. трихофитии, микроспории, эпидермофитозе. Миковелт выпускается в полиэтиленовых флаконах вместимостью 0,1, 0,25 и 0,3 дм3, в т.ч. в беспропеллентной аэрозольной упаковке. Срок годности препарата составляет 3 года. Средство хранится при температуре от 0° до плюс 50°С. Животные. Изучение острой и хронической токсичности препарата проводили на белых беспородных мышах массой 202,0 г, на белых беспородных крысах массой 1905,0 г, морских свинках массой 40050 г, кроликах массой 2,50,3 кг, телятах черно-пестрой породы в возрасте 6 месяцев и собаках разных пород. Лабораторные животные содержались в виварии кафедры микробиологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, лицензированной по работе с микроорганизмами III-IV групп патогенности (лицензия № 77.01.13.001.Л.000172.07.09 от 10.07.2009 г.), на стандартном пищевом рационе в соответствии с «Инструкцией по применению нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях и предприятиях системы здравоохранения» (приказ № 1179 от 10.10.83). Температура воздуха в виварии составляла 20-22С, влажность воздуха 70%. До начала эксперимента животных выдерживали в условиях карантина в течение 14 сут. В экспериментах по изучению лечебно-профилактической эффективности Миковелта при дерматомикозах и раневых инфекциях животных были использованы 150 белых мышей, 30 белых половозрелых крыс, 30 морских свинок, 10 кроликов, 27 телят черно-пестрой породы в возрасте 6-8 месяцев, 18 рабочих лошадей, 322 овцы тонко-рунной породы шерстно-мясного направления, 52 собаки и 28 кошек разных пород и возрастов. Тест-штаммы микроорганизмов. Антимикробную активность препарата Миковелт изучали с использованием следующих культур тест-штаммов микроорганизмов: - Escherichia coli 11229; - Staphylococcus aureus 6538; - Pseudomonas aeruginosa 15412; - Bacillus cereus 10702; - Clostridium sporogenes 272; - Candida albicans 10231; - Trichophyton verrucosum 480; - Trichophyton violaceum 11; - Trichophyton mentagrophytes 210; - Microsporum gypseum 37; - Microsporum canis 474; - Microsporon lanosum 22; - Epidermophyton rubrum 64; - Aspergillus niger 9642; - плесневые грибы Cladosporium spp., Mucor spp. Штаммы микроорганизмов были получены нами из Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ ВГНКИ), из музея штаммов ГНУ ВИЭВ, коллекции штаммов Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ и музея штаммов кафедры микробиологии. Все штаммы микроорганизмов имели типичные морфологические, биохимические и культуральные свойства. Питательные среды. Для поддержания, освежения и культивирования тест-штаммов микроорганизмов, а также культур бактерий и грибов, выделенных с поверхности кожи экспериментальных животных и из содержимого ран использовали мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ), агар и бульон Сабуро, сусло-агар, среду Китта-Тароцци, желточно-солевой агар, среды Эндо и Плоскирева, кровяной агар и др. Материалы, растворы, реактивы. В работе применяли дистиллированную воду и физиологический раствор. Концентрацию культур тест-штаммов микроорганизмов определяли с помощью стандарта мутности. Исследования биохимических показателей крови животных проводили с помощью спектрофотометра марки “HUMAN”. Методы исследований. Исследования проводили в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (издание второе, переработанное и дополненное, 2005), Методическими указаниями по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ (2000), методическими указаниями «Оценка воздействия вредных химических соединении на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнения кожи» (1980); методическими рекомендациями по оценке иммунотоксических свойств фармакологических веществ (1992); методическими указаниями «Порядок экспертизы, клинических испытаний, регистрации отечественных средств и субстанций» (1996); «Санитарно-эпидемиологические правила» СП 1.3.2322-08; «Биологический контроль безопасности лекарственных средств» (1985); «Инструментальные методы химического анализа» (1989); Госфармакопея XI издания "Методы микробиологического контроля лекарственных средств"; ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности; ОСТ 64-504-96. Контроль качества лекарственных средств на промышленных предприятиях и организациях. Основные положения; ОСТ 42-510-98. Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP); ОСТ 91500.05.001-00. Стандарты качества лекарственных средств; Федеральный закон N 85-ФЗ «О лекарственных средствах». Антимикробную активность Миковелта изучали in vitro и in vivo. Антибактериальную активность Миковелта изучали методом серийных разведений в соответствующих для культур тест-штаммов питательных средах и условиях культивирования, а также методом диффузии в агар. При определении противогрибковой активности Миковелта in vitro препарат изучали методом двукратных серийных разведений в жидкой среде Сабуро, а также методом диффузии в агар. При определении противогрибковой активности Миковелта in vivo эффективность препарата изучали на моделях дерматомикозов белых мышей, морских свинок и кроликов, вызываемых дерматофитами родов Trichophyton, Microsporon и Epidermophyton, а также на моделях кандидоза белых мышей и кроликов. Результаты исследований учитывали по проявлению клинических признаков болезни, исследованиям соскобов кожи на наличие грибов, а также с применением люминесцентной лампы со светофильтром Вуда (лампа Вуда). Все опыты проводили в трехкратной повторности для определения среднестатистических данных. Для определения острой и хронической токсичности препарат в различных концентрациях вводили животным в желудок, внутрибрюшинно, наносили на кожу, на слизистые оболочки и коньюнктиву глаз, воздействовали ингаляционно. Изучали токсическое, местно-раздражающее, кожно-резорбтивное, сенсибилизирующее действие и кумулятивные свойства препарата. Учитывали клинические признаки проявления воздействия препарата на организм животных, оценивали изменение гематологических и биохимических показателей крови до и после постановки опытов. Лабораторно-экспериментальные испытания антимикробной активности Миковелта in vivo проводили в отношении естественной микрофлоры кожи кроликов, а также тест-штамма E.coli 11229 при искусственной контаминации кожных покровов животных. Изучение фармакокинетики и сроков выведения остаточных количеств Миковелта из организма крупного рогатого скота и овец после его курсового применения изучали, исследуя молоко коров, а также мясо коров и овец, леченных Миковелтом, на наличие компонентов препарата и определение сроков ожидания для молочной и мясной продукции. Противовоспалительное действие Миковелта определяли методом онкометрии с использованием белых крыс, а также путем искусственного заражения кроликов суспензией культур тест-штаммов E.coli 11229, S.aureus 6538, P.aeruginosa 15412 и C.albicans 10231, с последующей обработкой Миковелтом пораженных участков кожи. Изучение ранозаживляющего действия Миковелта проводили с использованием белых мышей, кроликов и телят. У кроликов искусственно вызывали абсцессы подкожной клетчатки путем введения суспензией культур тест-штаммов E.coli 11229, S.aureus 6538, P.aeruginosa 15412 и C.albicans 10231, с последующей обработкой Миковелтом пораженных участков кожи. Белым мышам в области спины наносили глубокие царапины инъекционной иглой и втирали в раны суспензию тест-штаммов бактерий. После появления у мышей признаков гнойного поражения ран животных лечили Миковелтом. Морфологию раневого процесса изучали по методу Покровской М.П. и Макарову Ж.С. (6). Мазки-отпечатки с поверхности ран фиксировали в течение 3-5 мин в спирт-эфире и окрашивали в течение 25-30 мин. по Романовскому. Процесс эпителизации ран определяли с помощью теста Поповой Л.Н. (75). Эффективность обеззараживающего действия Миковелта при обработке мест инъекций и операционных полей оценивали в отношении естественной микрофлоры кожи собак и кошек. Результаты клинических испытаний Миковелта при раневых инфекциях подтверждали данными бактериологических исследований отделяемого содержимого инфицированных ран и абсцессов, общего состояния животных, степени заживления ран и исчезновения признаков воспаления. Оценку пролонгированного действия Миковелта при обработке кожи проводили в экспериментах на собаках и кошках в отношении естественной микрофлоры кожи. Для сравнения, в каждой серии опытов формировали контрольные группы животных, которых обрабатывали физиологическим раствором или стерильной водопроводной водой, аналогично с опытными группами животных. Лечебно-профилактическую эффективность Миковелта при дерматомикозах у животных оценивали в контролируемых опытах на телятах, лошадях, овцах, собаках и кошках. Результаты клинических испытаний Миковелта подтверждали данными микологических исследований соскобов кожи, общего состояния животных и исчезновения клинических признаков дерматомикозов. Экспериментальные данные обрабатывали методом корреляционного, вариационного и факторного статистического анализа с использованием пакета компьютерных программ «Statgraphics Plus for Windous», «Statistica 6,0» и анализом результатов по Ашмарину И.П. и Воробьеву А.А. (6). 2.2. Результаты исследований 2.2.1. Определение бактерицидной и противогрибковой активности Миковелта in vitro 2.2.1.1. Определение бактерицидной активности Миковелта в отношении тест-штаммов бактерий Антибактериальную активность Миковелта in vitro оценивали в отношении 48 - часовых культур тест-штаммов - Escherichia coli 11229, Staphylococcus aureus 6538, Pseudomonas aeruginosa 15412, Bacillus cereus 10702, Clostridium sporogenes 272. Исследования проводили качественными методами: суспензионный, капельный и чашечный (диско-диффузный). При использовании суспензионного метода при изучении бактерицидной активности Миковелта готовили бактериальные взвеси культур тест-штаммов бактерий с концентрацией не менее 2 млрд. микробных клеток в 1 мл суспензии по стандарту мутности. По 1 мл бактериальной суспензии вносили в пробирки с 5 мл Миковелта и выдерживали в течение 1, 2, 3, 5, 10, 15 и 30 мин. Для контроля взвесь тест-культуры смешивали со стерильной водопроводной водой. Через каждое время экспозиции в пробирку вносили универсальный нейтрализатор и через 10 мин. из бактериальной суспензии с Миковелтом делали посевы в МПБ, на МПА и в среду Китта-Тароцци (для клостридий). Посевы помещали в термостат при 37°С на 48 ч. Затем проводили учет результатов исследований на наличие или отсутствие роста изучаемых культур тест-штаммов бактерий. При капельном методе определения бактерицидной активности Миковелта на МПА в чашках Петри делали газон из культуры каждого тест-штамма бактерий (для клостридий использовали глюкозно-кровяной агар и культивировали их в анаэростате). На поверхность газона в центре чашки Петри наносили 0,05 мл Миковелта, выдерживали в течение 1, 2, 3, 5, 10, 15 и 30 мин. Затем из места контакта газона бактерий с Миковелтом через определенное время экспозиции делали высев в МПБ с последующим пересевом на МПА (для клостридий – посев в среду Китта-Тароцци с последующим пересевом на глюкозно-кровяной агар). Посевы помещали в термостат при 37°С и проводили учет результатов исследований через 48 часов на наличие или отсутствие роста изучаемых культур тест-штаммов бактерий. При чашечном (диско-диффузном) методе определения бактерицидной активности Миковелта изготавливали бумажные диски, которые смачивали Миковелтом и высушивали. На МПА в чашках Петри делали газон из культуры каждого тест-штамма бактерий (для клостридий использовали глюкозно-кровяной агар и культивировали их в анаэростате). На поверхность газона в центре чашки Петри наносили бумажный диск с Миковелтом. Посевы помещали на 48 часов в термостат при 37°С, затем определяли зону отсутствия роста тест-штамма вокруг бумажного диска, пропитанного Миковелтом. Все исследования проводили в трехкратной повторности. С помощью качественного суспензионного метода было установлено, что Миковелт вызывает полную гибель культур тест-штаммов бактерий при всех испытуемых экспозициях (табл. 6). Таблица 6. Бактерицидная активность Миковелта по отношению к тест-штаммам бактерий (качественный суспензионный метод)
Примечание: «–» - отсутствие роста бактерий; «+» - наличие роста бактерий. Как следует из данных таблицы, эшерихии, стафилококки, синегнойная палочка, бациллы, кандиды и клостридии погибали в присутствии Миковелта уже через 1 мин. экспозиции. Во всех контрольных пробах наблюдался рост изучаемых культур тест-штаммов бактерий. При использовании капельного метода определения антимикробной активности, Миковелт оказывал бактерицидное действие на тест-штаммы бактерий в месте контакта при экспозиции 2 мин. в отношении E.coli, S. aureus, P.аeruginosa. Гибель B.cereus и C.sporogenes наступала при 3-минутной экспозиции (табл. 7). Таблица 7. Бактерицидная активность Миковелта по отношению |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 |
Инструкция по применению лекарственного препарата Амоксигард для... В 1 мл лекарственного препарата в качестве действующего вещества содержится 140 мг амоксициллина (в форме амоксициллина тригидрата)... |
 |
Фармако-токсикологические свойства и эффективность применения препарата... Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных |
|
Фармако-токсикологические свойства и эффективность применения препарата... Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных |
|
Морфофункциональные изменения в печени при токсическом поражении и при его коррекции Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных |
|
Методические указания му 09 Издание официальное Роспотребнадзор Москва... Организация и проведение дезинфекционных мероприятий при дерматомикозах: Методические указания. – М. Федеральное государственное... |
|
Что делать, если скорая не едет? Орз и гриппе, многих «детских инфекциях», при бактериальных инфекциях, в том числе при пневмониях и ангинах. Понятно, что решение... |
|
Учебно-методическое пособие для самостоятельной работы студентов... Ситуационные задачи по теме: «сестринское обследование и уход при острых кишечных инфекциях» |
|
Инструкция по применению препарата асд. Создатель препарата Препарат асд является жидкостью, приготовленной из тканей животных по особой методике. Асд выпускается в 2 фракциях n 2, n 3 |
|
Разработка и применение лекарственных средств на основе ароксиалканкарбоновой... Разработка и применение лекарственных средств на основе ароксиалканкарбоновой кислоты |
|
Рекомендации по безопасному применению кордарона (амиодарона гидрохлорида) Кордарон Вместе с тем оказалось, что переносимость препарата при его длительном применении оказалась хуже, чем у b–адреноблокаторов и антагонистов... |
|
Инструкция по применению Тилозина 50 и Тилозина 200 при бактериальных инфекциях у животных Лекарственная форма: раствор для инъекций. Тилозин 50 и Тилозин 200 в 1 мл содержат в качестве действующего вещества тилозина основание... |
|
Клинические рекомендации рациональное использование антибиотиков... Рациональное использование антибиотиков при инфекциях дыхательных путей в общей врачебной практике |
|
Инструкция по применению средства гемостатического «Гемоблок» ту 9391-002-68087337-2012 Сочетает гемостатические и антисептические свойства. Применяется при обработке раневых поверхностей при хирургических операциях,... |
|
Фармако токсикологические свойства минерал сорбента сорби и его применение... |
|
Прием (осмотр, консультация) врача-специалиста Стандарт специализированной медицинской помощи детям при хронических герпесвирусных инфекциях |
|
Инструкция по применению Бензилпенициллина натриевой соли для инъекций... ... |