ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
ИРКУТСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ
На правах рукописи
Карпова Екатерина Александровна
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ПЕЧЕНИ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ И ПРИ ЕГО КОРРЕКЦИИ
06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Научный руководитель:
доктор ветеринарных наук, профессор
О. П. Ильина
Улан-Удэ - 2014
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………
|
4
|
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………….............
|
14
|
Морфофункциональные особенности течения патологических процессов в печени при токсическом поражении ………………………...
|
14
|
Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита организма ……………………………………………………………………
|
20
|
Общая характеристика нанокомпозитных селенсодержащих материалов…………………………………………………………………..
|
31
|
ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ …
|
43
|
2.1. Материалы и методы исследований
|
43
|
2.1.1. Определение антиоксидантной активности препарата in vitro……
|
44
|
Моделирование токсического повреждения печени………………
|
45
|
Методы биохимического исследования ……………………………
|
46
|
Методы исследования острой токсичности………………………..
|
50
|
Методы патоморфологического исследования…………………….
|
50
|
Методы статистической обработки результатов исследований
|
51
|
Оценка биологического действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных………………………………………
|
52
|
2.2.1. Антирадикальная активность нанокомпозитного препарата селена in vitro………………………………………………………………..
|
52
|
Антиоксидантная активность нанокомпозитного препарата селена in vivo………………………………………………………….
|
54
|
Исследование острой токсичности нанокомпозитного препарата селена…………………………………………………………………
|
65
|
Морфофункциональная оценка биологического действия нанокомпозитного препарата селена при токсическом поражении печени…………………………………………………………………
|
66
|
ГЛАВА III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………..
|
91
|
ВЫВОДЫ…………………………………………………………………..
|
105
|
ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………
|
107
|
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
|
108
|
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
|
109
|
СПИСОК ИЛЛЮСТРИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА
|
128
|
ПРИЛОЖЕНИЯ
|
132
|
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
Функции печени в организме очень разнообразны: в ней вырабатывается желчь, имеющая большое значение для пищеварения, печень задерживает и ассимилирует продукты переваривания, в ней протекает синтез и расщепление пуриновых тел, аминокислот, белков, жиров, накапливаются витамины и микроэлементы. Этот орган способен фиксировать скрытые повреждения, которые проявляются в ближайшие или отдаленные сроки. Огромное значение играют барьерные функции печени – задерживаются или изменяются и выводятся вместе с желчью многие ядовитые вещества эндогенного и экзогенного происхождения. При заболеваниях печени падает её окислительная способность и уменьшается обезвреживающая функции (Кудрявцев, 1984). Значительная роль печени в синтезе и сохранении ферментов. Так в этом органе максимальная активность фермента глутатионпероксидазы, которая напрямую зависит от обеспеченности организма селеном.
В Иркутской области недостаток селена, также, как и недостаток йода в почве, является геохимической патологией. Недостаточно селена содержится в пахотном слое пашни Иркутской области, на территории Тулуно-Иркутского, Качугского, Киренского, Братского округов (Кудрявцев А.П. Токсическая дистрофия печени поросят. Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1984. 260 с.). Для предотвращения патологий, связанных с недостатком селена, в животноводстве используют препараты, в которых селен содержится в виде синтетических комплексов селенита натрия или селен-метионина. Селен из этих препаратов усваивается неполноценно, а носители, зачастую, нефизиологичны и могут вызвать побочные эффекты (тошнота, анорексия, аллопеция) как при длительном применении, так и при передозировке (Решетник Л.А. Биогеохимическое и клиническое значение селена для здоровья человека // Сибирский медицинский журнал. 1999. Т.18, № 3. С.16–22).
Селен (Se) привлекает внимание животноводов как биотический элемент, выполняющий в исчезающе малых количествах важные биохимические функции, а также как высокотоксичный элемент, неорганические соединения которого более ядовиты, чем соединения молибдена, мышьяка и ванадия (Хеннинг А. Минеральные вещества, витамины, биостимуляторы в кормлении сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1976. 158 с.; Георгиевский В.И. Минеральное питание животных. М.: Колос, 1979. 471 с.; Синдирева А.В. Критерии и параметры действия микроэлементов в системе почва-растение-животное: автореф. дис. д-ра биолог. наук 03.02.08 / Анна Владимировна Синдирева. Тюмень, 2012. 35 с.). Нижним пределом содержания селена в корме, при котором наступают явления селеноза, считают 3-4 мг/кг корма. Концентрация 5 мг/кг является токсичной. При 8 мг/кг Se отмечаются тяжелые повреждения, а при 10 мг/кг, например, цыплята уже не вылупляются (Хеннинг А. Минеральные вещества, витамины, биостимуляторы в кормлении сельскохозяйственных животных. 158 с.). Смертельная доза селенитов составляет 0,59-10 мг/кг массы тела (Ветеринарная токсикология с основами экологии: учеб. пособие / под ред. М.Н. Аргунова. СПб.: Лань, 2007. 416 с.).
Биологическая активность селена обусловлена его участием в регуляции образования антиоксидантов. Существует тесная корреляция между уровнем в организме селена и активностью селен-содержащего фермента глутатионпероксидазы, который предотвращает накопление в клетках перекисных продуктов обмена веществ (Зайцев С.Ю. Биохимия животных. Фундаментальные и клинические аспекты: учеб. СПб.: Лань, 2004. С. 271–272; Зайцев С.Ю. Супрамолекулярные системы на границе раздела фаз как модели биомембран и наноматериалы. Донецк - М.: Норд Компьютер, 2006. 189 с.; Георгиевский В.И. Минеральное питание животных. М. 1979. 471 с.; Решетник Л.А. Биогеохимическое и клиническое значение селена для здоровья человека // Сибирский медицинский журнал. 1999. Т.18. № 3. С.16–22).
Помимо этого, селен играет фундаментальную роль во многих метаболических функциях. Он участвует в поддержании иммунной системы (Spasic M.B. Effect of term exposure to cold on the antioxidant defense system in the rat // Free Rad. Biol. Med. 1993. № 3. P.291–299; Griffiths C. A comparison of the monetized impact of IQ decrements from mercury emissions // Environ Health Perspect. 2007. P.841–847; Clarkson T.W. The toxicology of mercury-current exposures and clinical manifestations // N Engl J Med. 2003. Vol.349. P. 1731–1737; Jang M. Characterization and recovery of mercury from spent fluorescent lamps // Waste Management. 2005. Vol. 25. P.5–14; Psychological effects of low exposure to mercury vapor: application of a computer-administered neurobehavioral evaluation system / Liang Y.X. [et al.] // Environ Res. 1993. Vol. 60. P.320–327), улучшает подвижность сперматозоидов (Corazza A. Mercury dosing solutions for fluorescent lamps // Journal of Physics D-Applied Physics. 2008. Vol.41 p.144007), активирует гормоны щитовидной железы (Eckelman M.J. Spatial Assessment of Net Mercury Emissions from the Use of Fluorescent Bulbs // Environmental Science & Technology. 2008. Vol.42. P.8564–8570; Reduction of mercury loss in fluorescent lamps coated with thin metaloxide films / Hildenbrand V.D. [et al.]// Journal of the Electrochemical Society. 2003. Vol.150. P. H147–H155), а также профилактирует возникновение раковых заболеваний (Ralston N. Nanomaterials: Nano-selenium captures mercury // Nature Nanotechnology. 2003. Vol.3. P.527–528; Tunnessen W.W. Acrodynia - Exposure to Mercury from Fluorescent Light-Bulbs // Pediatrics. 1987. Vol.79. P.786–789; Raposo C. Mercury speciation in fluorescent lamps by thermal release analysis // Waste Management. 2003. Vol.23. P. 879–886; Baughman T.A. Elemental mercury spills // Environmental Health Perspectives. 2006. Vol.114. P.147–152; Celo V. Abiotic methylation of mercury in the aquatic environment // Science of the Total Environment. 2006. Vol.368. P.126–137; Engelhaupt E. Do compact fluorescent bulbs reduce mercury pollution? // Environmental Science & Technology. 2008. Vol.42. P.8176–8176; Johnson N.C. Mercury vapor release from broken compact fluorescent lamps and in situ capture by new nanomaterial sorbents // Environmental Science & Technology. 2008. Vol.42. P.5772–5778).
Дозы селена, незначительно превышающие терапевтические, являются токсичными (Gilbert S.G. Neurobehavioral Effects of Developmental Methylmercury Exposure // Environmental Health Perspectives. 1995. Vol.103. P.135–142). Сочетание введенной дозы и химической формы селена играют фундаментальную роль в определении его токсичности (Clarkson T.W. The toxicology of mercury-current exposures and clinical manifestations. P.1731–1737; Griffiths C. A comparison of the monetized impact of IQ decrements from mercury emissions. P. 841–847).
В последние годы развивается новый подход к получению терапевтических препаратов, основанный на иммобилизации лекарственных средств на полимерных носителях. Это позволяет улучшить их фармакологические свойства - увеличить активность и время действия, снизить токсичность и побочные эффекты, увеличить избирательность воздействия на орган-мишень, а также улучшить стабильность при хранении, то есть обеспечить безопасность и эффективность действия.
Замечено, что комбинации различных материалов проявляют улучшенные свойства по сравнению с индивидуальными веществами. Одними из самых успешных примеров таких смесей являются композитные материалы, которые сформированы из основного вещества, тем или иным образом распределенного в объеме второго вещества, называемого матрицей. Особый интерес представляют материалы, построенные одновременно из органической и неорганической составляющих.
Одной из важных и актуальных тенденций в развитии лекарственной терапии является создание нанокомпозитных систем доставки, повышающих эффективность действия лекарственного вещества на организм человека или животных (Конструирование наночастиц для адресной доставки терапевтических средств в клетки и их органеллы / Ткачук В.А. и [др.] // Междунар. форум по нанотехнологиям Rusnanotech-08: сб. тез. докл. 2008. С.191; Цыб А.Ф. Лекарственные и радиофармацевтические препараты, создаваемые на основе наномолекулярных технологий // Международный форум по нанотехнологиям Rusnanotech-08: сб. тез. докл. 2008. С.193; Швец В.И. Перспективные направления создания эффективных лекарственных препаратов методами нанобиотехнологии // Междунар. Форум по нанотехнологиям Rusnanotech-08: сб. тез. докл. 2008. С.195; Niemeyer C.M. Nanobiotechnology: Concepts, Applications and Perspectives. Wiley-VCH, 2004. 491p; Kubik T. Nanotechnology on duty in medical applications // Current Pharmaceutical Biotechnology. 2005. V.6. №1. Р.17 – 33; Torchilin V. Nanoparticulates as Drug Carriers. N. Y.: World Scientific Publishing Co. 2006. 756p; Bharаd Bushan. Springer Handbook of Nanotechnology. Berlin: Heidelberg: N. Y.: Springer. 2007. 1916p; Ehud G. Plently of Room for Biology at the Bottom. An Introduction to Bionanotechnology. N.Y.: Work Scientific Publishing Co., 2007. 200p; Claudio N. Nanobiotechnology and Nanobiosciences. N.Y.: World Scientific Publishing Co. 2008. 308p).
В последние десятилетия разработаны многочисленные системы носителей лекарственных веществ, используемые как средства контролируемого распределения лекарств в органах и тканях организма (Niemeyer C.M. Nanobiotechnology: Concepts, Applications and Perspectives. 491p; Torchilin V. Nanoparticulates as Drug Carriers. 756p; Bharаd Bushan. Springer Handbook of Nanotechnology. 1916p; Ehud G. Plently of Room for Biology at the Bottom. An Introduction to Bionanotechnology. 200p; Claudio N. Nanobiotechnology and Nanobiosciences. 308p.).
Сопоставимость «нано-био» размеров позволяет внедрить достижения нанотехнологии в биологию, создавая объекты для медицинской диагностики, целевой терапии, молекулярной и клеточной биологии (Niemeyer C.M. Nanoparticles, proteins and nucleic acids: Biotechnology meets materials science // Angew. Chem. Int. Edn. Eng. 2001. Vol.40. P.4128 - 4158).
Исходя из вышеизложенного, целью исследования стало изучение действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных и его роли в механизмах защиты поврежденной печени.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Оценка антиоксидантной активности нанокомпозитного препарата селена in vitro.
Установление степени токсичности нанокомпозитного препарата селена.
Определение концентрации факторов перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) на модели токсического гепатита и на фоне введения нанокомпозитного препарата селена.
Определение факторов антиоксидантной защиты (АОЗ): супероксиддисмутаза (СОД), антиоксидантная активность (АОА), глутатионпероксидаза (GSH), витамина А и Е.
Установление саногенетического эффекта нанокомпозитного препарата селена на морфологическую структуру печени.
Научная новизна:
В исследованиях in vitro показано, что композит селена с АГ обладает антиоксидантной активностью и не уступает по данному показателю аскорбиновой кислоте. Причем антиоксидантная активность обусловлена наличием селена в наноразмерном состоянии.
Установлено, что нанокомпозитный препарат селена (наноразмерный Se в решетке арабиногалактана) в выбранной нами дозе 2мг/100гр массы животного не оказывает повреждающего действия на организм животных, а оказывает выраженное протекторное действие на печень. Проявляет антиоксидантную активность, о чем свидетельствует снижение уровня маркеров ПОЛ и повышение активности глутатиона. Доказано, что применение нанокомпозитного препарата селена в эксперименте и при коррекции токсического действия тетрахлорметана на организм животных способствует уменьшению метаболических и морфологических нарушений.
Таким образом, установлено, что Se, взятый в наноразмерном состоянии, не проявляет повреждающего действия на организм животных. Нанокомпозитный препарат селена (нано-Se), благодаря сродству арабиногалактановой матрицы к асиалогликопротеиновым рецепторам (с мембранотропными свойствами) гепатоцитов, макрофагов, ретикулоцитов позволяет изучаемому данному терапевтическому средству внедрять Se в эти клетки путем рецепторно-обусловленного эндоцитоза. На основании анализа литературных данных и собственных исследований разработана концептуальная схема протекторного действия нано-Se при интоксикации тетрахлорметаном, важнейшим элементом которой является ингибирование активности ПОЛ.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные экспериментальные данные являются доклиническим обоснованием применения нанокомпозитного препарата Se для профилактики и лечения заболеваний животных, вызванных недостатком этого микроэлемента, особенно в недостаточных по селену зонах. А так же для защиты печени от повреждающего действия эндо- и экзотоксикантов.
Предложенная концептуальная схема является доклиническим обоснованием для дальнейшего изучения действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных.
Препарат может применяться в экспериментальной и ветеринарной практике для профилактики и лечения редокс-зависимых заболеваний.
Апробация результатов исследований
Основные результаты исследования представлены на международной Байкальской научно – практической конференции по проблемам ветеринарной медицины «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» Иркутск, 15-16 марта 2011г.; на региональной научно – практической конференции «Актуальные проблемы АПК» г. Иркутск, 20-22 апреля 2011г.; в I Международной научно-практической конференции «Перспективы развития научных исследований в 21 веке» г. Москва 2013г.; на международной научно-практической конференции молодых ученых «научные исследования и разработки к внедрению в АПК» в г. Улан-Удэ 17-18 апреля 2013 г; международной научно-практической конференции, посвященной 60 - летию аспирантуры ИрГСХА 3-5 декабря 2013г.; в семинаре «Научно-практические аспекты применения лекарственных растений в производстве пищевых продуктов 19-20 декабря 2013 г., Казахстан, г. Семей.
Внедрение результатов научных исследований в практику
Материалы по экспериментальному исследованию нанокомпозитного препарата селена используются:
в учебном процессе и научной работе ФГБОУ «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» при чтении дисциплин «Ветеринарная патофизиология» и «Ветеринарная экология» на кафедре анатомии, физиологии и микробиологии (протокол №2 от 23.09.2013 г);
в учебном процессе факультета ветеринарной медицины на кафедре нормальной, патологической физиологии, фармакологии и токсикологии по курсу «клиническая фармакология» и «токсикология» (акт внедрения от 13 декабря 2013г.);
-
используются в учебном процессе и научной работе на кафедре патанатомии и гистологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» (протокол №19 от 11.12.2013);
используются в учебном процессе по курсу «Внутренние болезни животных», «Токсикология», «Фармакология» ФГБОУ ВПО Алтайский государственный аграрный университет (протокол №11 от 17.12.2013);
используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе кафедры патологии, морфологии и физиологии, факультета ветеринарной медицины и зоотехнии ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» (протокол №4 от 16.12.2013);
приняты к внедрению в производство или к использованию в разработках на кафедрах института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВПО Омского государственного аграрного университета им. П.А. Столыпина (от 18.12.2013);
приняты к использованию в учебном процессе кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии, а также используются в научно-исследовательской работе Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины КрасГАУ (протокол №6 от 27.11.2013);
используются в учебном процессе кафедры «Внутренние незаразные болезни и акушерство» ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» (протокол №4 от 15.12.2013);
приняты к внедрению в учебный процесс и научную работу кафедры морфологии и физиологии животных Сельскохозяйственного института ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова» (протокол №6 от 27 декабря 2013г);
используются в учебном процессе при изучении дисциплин «Ветеринарная токсикология», «Клиническая фармакология», «Внутренние болезни животных» и в научных исследованиях на кафедрах фармакологии и токсикологии и внутренних незаразных болезней ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» (протокол №8 от 15 января 2014г);
получена приоритетная заявка на изобретение «Антиоксидантное средство с гепатопротекторным эффектом на основе наноструктурированного селена и способы его получения и применения»: заявление от 30.12.2013; регистрационный № 2013159311.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации результатов диссертации на соискание степени кандидата наук, получена 1 приоритетная заявка на изобретение РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, предложений и рекомендаций, и списка литературы и приложений; иллюстрирована 8 таблицами и 23 рисунками. Указатель литературы включает 180 источников, из них 119 работ отечественных и 61 – зарубежных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Новый нанокомпозитный препарат селена в экспериментах in vitro обладает антиоксидантным действием.
В исследованиях in vivo изучаемый препарат достоверно снижает негативные эффекты перекисного окисления липидов, усиливает систему антиоксидантной защиты.
В условиях эксперимента при токсическом повреждении, обеспечивает более раннюю регенерацию клеток печени и меньшим повреждением в данной группе.
|
