При постановке ифа
|
Скачать 463.95 Kb.
|
| Новосибирск 2001 Институт средств медицинской диагностики ЗАО «Вектор-Бест» А.В. Масяго НЕКОТОРЫЕ ОШИБКИ ПРИ ПОСТАНОВКЕ ИФА Информационно-методическое пособие © ББК Т Некоторые ошибки при постановке ИФА. – Новоси- Т бирск, 2001. – 132 с. ББК 3 Многолетний опыт работы ЗАО «Вектор-Бест» по произ- водству иммуноферментных тест-систем, постоянный кон- такт с широким кругом потребителей продукции, как из хорошо оснащенных диагностических центров, так и из лабораторий, имеющих минимально необходимое для постановки иммунофер- ментного анализа (ИФА) оборудование, дает нам возможность классифицировать и вскрыть причины некоторых ошибок, допус- каемых при проведении иммуноферментного анализа. Автор не претендует на полноту освещения проблемы, однако надеется, что эта брошюра может быть полезна для наших читателей, использующих в своей работе ИФА. Сотрудники ЗАО «Вектор-Бест» будут благодарны всем за любые замечания, предложения и описания случаев из личной практики, которые обязательно будут учтены при подготовке нового, более полного издания. 4 1. Помещение Требования к помещениям изложены в ведомственных инс- трукциях. В реальной жизни руководителям достаточно трудно выполнить все предписания, поэтому зачастую для проведения ИФА используются приспособленные в той или иной степени по- мещения. Далее приведены некоторые факторы, которые могут повлиять на результат анализа. Температура воздуха в лаборатории Во многих тест-системах при проведении анализа по инструк- ции рекомендуется вести инкубацию планшетов при комнатной температуре. Под этим подразумевается температура 18–25°С. На практике температура в помещениях лабораторий варьирует от 12 до 30°С, что может привести к неправильным результатам тести- рования. В некоторых лабораториях пытались уменьшить влия- ние температуры воздуха на результат реакции с помощью изме- нения времени инкубации, однако общих формул оценки влияния соотношения температуры и времени инкубации на оптическую плотность не существует. Поэтому единственным способом избе- жать этой ошибки является установка планшетов при выполне- нии этой операции в настроенный на комнатную температуру термостат (если температура ниже комнатной), либо прекращение работы (если температура выше). Обычно в состав тест-системы входят концентраты растворов, которые перед постановкой необходимо развести дистиллирован- ной водой. В инструкциях по применению часто не указывается, но подразумевается, что дистиллированная вода имеет комнатную температуру. При использовании слишком холодной дистилли- рованной воды, особенно в растворах, предназначенных для раз- ведения сывороток и конъюгата, можно получить неправильный результат, независимо от температуры, при которой будет прово- диться инкубация. Вероятность получения неправильного резуль- тата в этом случае выше, если продолжительность инкубации мала (например, 30 мин). 5 Относительная влажность воздуха Как правило, влияние этого фактора менее существенно. Од- нако, если используются длительные времена инкубации при ком- натной температуре, то при сухом воздухе (обычно относительная влажность воздуха в помещениях ниже в зимний период) лучше использовать влажную камеру. В противном случае происходит подсыхание раствора с образованием «ободка» на боковой поверх- ности лунки планшета, который при промывке может сохраниться и повлиять на результат анализа на следующих его стадиях. Сле- дует заметить, что если используется настроенный на комнатную температуру термостат при низкой температуре воздуха в лабора- тории, то относительная влажность в термостате обычно намного ниже относительной влажности в помещении. Недостаточная вентиляция Душный воздух в лаборатории приводит к быстрой утомля- емости лаборанта, и, как следствие, к увеличению числа ошибок (неправильный отбор проб пипеткой, занос пробы в другую лунку и т.д.). Следует отметить, что в большинстве тест-систем в инструк- циях указано на необходимость применения масок либо респира- торов, что и без плохой вентиляции затрудняет дыхание. Общая загроможденность Для постановки анализа необходимо достаточное количество площади лабораторного стола. В противном случае возрастает ве- роятность пролива растворов, они могут быть перепутаны и т.п. 6 2. Оборудование и расходные материалы Проверка автоматической пипетки В инструкциях по применению большинства тест-систем ука- зано, что погрешность пипеток не должна превышать 5%. Непра- вильное дозирование растворов на любой стадии анализа может привести как к росту, так и к снижению оптической плотности, за- меряемой при оценке результата анализа. Наиболее простой способ проверки пипетки – взвешивание дистиллированной воды, дозируемой пипеткой. Вес 1 мкл дистил- лированной воды при комнатной температуре с большой точнос- тью равен 1 мг. Таким образом, настроив пипетку на дозу 100 мкл, мы должны получить вес воды около 100 мг. Желательно сделать несколько повторов для того, чтобы убедиться в воспроизводимости результатов. Весы, позволяющие измерять вес от 10 до 200 мг с не- обходимой точностью, достаточно доступны и просты в обращении. Не стоит пытаться проверять точность дозирования много- кратным повтором с последующим измерением суммарного объема с помощью мерного цилиндра. Такой способ не позволяет обнару- жить пипетку, которая дозирует правильный средний объем при сильном разбросе между последовательными дозами. (Напри- мер, пипетка настраивается на дозирование 100 мкл, произво- дится 20 дозирований, с помощью мерного цилиндра измеряется объем, который должен составить около 2 мл. Пипетка дозирует случайным образом от 85 до 115 мкл, что, при большом количестве дозирований, приводит к ожидаемому объему.) Промыватели планшетов Наиболее характерным источником погрешностей является засорение каналов промывателей. Недостаточная промывка при- водит обычно к завышению сигнала. Обнаружить это достаточно просто – при использовании рядного промывателя повышенный сиг нал имеет один из рядов, при использовании 96-канального – одна и та же лунка разных планшетов. Необходимо отличать такую не- исправность от неисправности многоканального спектрофотометра. 7 Менее часто встречается засорение пространства между иг- лами промывателя (труднее визуально это обнаружить у авто- матических промывателей) кусочками марли или ваты. Такое засорение приводит к заносу растворов из одной лунки в другие, оптическая плотность в соседних по ряду от сильноположительно- го образца лунках повышена, при этом оптическая плотность тем меньше, чем далее расположена лунка от положительного образца (как при титровании). Как ручные, так и автоматические промыватели в конце рабо- чего дня следует тщательно промывать дистиллированной водой для предотвращения проростов в шлангах. Посуда Посуда должна быть чистой. Необходимо выделить отдельную посуду для приготовления и манипуляций с растворами конъюга- та, ТМБ и ОФД. Посуду для растворов ТМБ, ОФД и конъюгата необходимо мыть более тщательно, так как влияние возможных загрязнений на эти растворы сильнее отражается на результате анализа. Особенности мытья посуды и манипуляций с раствором ОФД изложены в инструкциях по применению тест-систем. Предлагаемая методика подготовки одноразовых наконечни- ков к повторному использованию дана в приложении. Термостаты В целом, благодаря отсутствию подвижных деталей, термо- статы редко выходят из строя. Однако желательно периодически проверять температуру с помощью дополнительного контрольного термометра. В некоторых термостатах неудачной конструкции мо- жет наблюдаться высокая разность температур между нижней и верхней полками. Следует учитывать, что при низкой относительной влажнос- ти в лаборатории (зимний период) или при низкой температуре в помещении относительная влажность в термостате может стать настолько малой, что даже при небольших временах инкубации возможно подсыхание растворов в лунках. В таких случаях лучше использовать влажную камеру или заклеивать планшет липкой пленкой. 8 Спектрофотометры Многоканальные спектрофотометры являются самыми слож- ными из необходимых для постановки иммуноферментного анали- за приборов. Спектрофотометры различных фирм могут сильно отличать- ся конструктивно, поэтому невозможно в рамках данной брошюры указать на все возможные нарушения правил эксплуатации этих приборов. Можно только отметить наиболее распространенные ошибки и неисправности. Во-первых, следует совместно со специалистами правильно подключить прибор. Часто требования к колебаниям напряжения в сети очень жесткие (обычно они указаны в инструкции к прибору), специалисты на местах знают типичные колебания напряжения и могут посоветовать те или иные меры противодействия. Во-вторых, обычно спектрофотометры требуют длительного времени прогрева, что указано в инструкции по эксплуатации. Нарушение данного требования может привести к неправильному измерению оптической плотности. Поэтому, если ожидается изме- рение оптической плотности примерно через 30 минут после очеред- ного измерения, прибор лучше оставить включенным. В большинстве спектрофотометров наименьшим ресурсом обладает источник света – мощная лампа, во многих инструкциях указан пересчет влияния каждого включения на ресурс лампы (например, 1 вклю- чение равносильно 40 минутам работы лампы). Спектрофотометры обычно имеют допустимую погрешность измерения до 10%. Проверить это можно, например, промеряя дважды подряд один и тот же планшет сразу после постановки ИФА и вычисляя различие в величине оптической плотности в одинаковых лунках. При этом желательно развернуть планшет так, чтобы лунка А1 заняла место лунки Н12. Следует учитывать, что при оптической плотности выше 1,5 о.е. погрешность спектро- фотометра может возрастать ввиду конструктивных особенностей прибора. Марля или фильтровальная бумага В практике приходилось сталкиваться с такими случаями. При удалении мелких капель из планшета (простукивание) ис- пользовалась марля. Ввиду перебоев в снабжении марля исполь- зовалась многократно, периодически обрабатывалась раствором хлорамина. После одной из обработок марля не была достаточно 9 промыта от остатков хлорамина, что привело к попаданию хлора- мина в лунки планшетов при простукивании. В результате в слу- чайном наборе лунок наблюдалось повышение сигнала до 0,8 о.е., даже в контроле конъюгата. После смены марли «выбросы» по оп- тической плотности исчезли. Фильтровальную бумагу для простукивания желательно ис- пользовать однократно. Дистиллированная вода Формальные требования к качеству дистиллированной воды приведены в соответствующем ГОСТе (основные показатели: масса сухого остатка после выпаривания – не более 5 мг/л, рН – 5,4–6,6, удельная проводимость при 20°С – не более 0,0005 См/м). В прак- тике приходилось сталкиваться с влиянием качества воды на ре- зультат реакции во многих лабораториях. Влияние качества дистиллированной воды на результат ре- акции чаще наблюдается весной и осенью, что, по-видимому, свя- зано с ухудшением качества водопроводной воды. Правильная эксплуатация и своевременная профилактика дистилляторов не является достаточным условием. При долгом хранении дистиллированной воды возможен бак- териальный пророст. Желательно не хранить дистиллированную воду более 2–3 дней. Не следует добавлять в дистиллированную воду в качестве консерванта азид натрия, так как он является ингибитором пероксидазы и может повлиять на активность конъ- югата при разведении. Если дистиллированная вода хранилась в холодильнике, то перед приготовлением растворов для ИФА ее следует прогреть до комнатной температуры, в противном случае возможно понижение оптической плотности. Планшет для предварительного разведения сывороток Если используется планшет для предварительного разведе- ния сывороток, то следует использовать этот планшет однократно. Нельзя применять для предварительного разведения неис- пользованные планшеты из наборов с сорбированными антигена- ми или антителами. 10 3. Подготовка образцов Данная глава несколько выходит за рамки настоящей брошю- ры, однако неправильное приготовление образцов может сущест- венно повлиять на все последующие результаты анализа. Рекомендуемое приготовление сыворотки: отстаивание 0,5–1 час при 37°С в термостате для быстрого формирования фибринового сгус- тка (не превратившийся в фибрин фибриноген является источником ложнопозитивных реакций во многих тест-системах), центрифугиро- вание 10 минут при 3 000 об/мин или 20 мин при 1 500 об/мин. При приготовлении сывороток должны быть приняты все меры, позволяющие исключить контаминацию. Случай из практики: на одной из СПК количество ложно- положительных результатов было намного выше обычного уров- ня, при поиске причин удалось выяснить, что при заборе проб ис- пользовалась стеклянная пипетка, которая ополаскивалась пе- ред забором следующей пробы физраствором, в случае попадания в исследуемые за день пробы высокотитражного образца количес- тво ложноположительных реакций резко возрастало. Более сложны для расследования случаи ошибочной марки- ровки проб или сознательной их подмены. 11 4. Инструкция по применению При получении новой серии наборов даже хорошо Вам знако- мой тест-системы следует прочитать инструкцию. Прогресс в им- муноферментном анализе в настоящее время сравним с прогрес- сом в вычислительной технике. В связи с этим, практически все тест-системы совершенствуются, что может отразиться на методи- ках подготовки реактивов и протоколе реакции. В случае возможных разночтений в инструкции лучше позво- нить производителям и разрешить возникший вопрос – не следует экспериментировать самим. Наиболее распространенное сознательное нарушение инс- трукции при постановке анализа – сокращение времени инку- бации раствора ОФД, осуществляемое в целях уменьшения ко- личества ложноположительных результатов. При этом причина возникновения завышенного количества ложноположительных результатов (заводской брак, неправильная транспортировка, не- правильное хранение, неверная постановка анализа) не выясня- ется и не устраняется. Такие изменения протокола ИФА могут су- щественно снизить выявляемость слабоположительных образцов, т.е. привести к ложноотрицательным результатам. Многие требования к хранению реагентов, подготовке и проведению реакции подразумеваются, но иногда не указаны в инструкции. Ниже приведены некоторые из таких требований (за основу взята инструкция по применению тест-системы Ortho HCV v3.0). |
Похожие:
 |
Анализ причин приостановки и отказа при постановке земельных участков ... |
 |
Барометрическое нивелирование При надлежащей постановке работ с помощью барометрического нивелирования можно получить также и абсолютные высоты пунктов наблюдения,... |
|
Рекомендации по обнаружению и устранению неисправностей При постановке перемычек с провода Э301 убедиться в отсутст- вии предохранителей аб некалиброванного сечения |
|
Факультет: лпф курс: V Очень часто друзья говорят больному: Как правило, при этой постановке фразы больной за помощью не |
|
Автоматическое складывание зеркал при постановке на охрану Адаптация, в выпадающем длинном списке очень внимательно! ищем строчку (ближе к концу списка) |
|
Порядок заполнения формы «Заявление физического лица о постановке на учет в налоговом органе» Настоящий Порядок заполнения формы «Заявление физического лица о постановке на учет в налоговом органе» (далее в настоящем порядке... |
|
Неотложные заболевания пищевода Кроме того, никто из практических хирургов не скрывает, какие трудности и колебания они испытывают при постановке диагноза и выборе... |
|
Конкурсная документация К на закупку тест-систем для ифа-анализа, реактивов и расходных материалов на 2-е полугодие 2013 года |
|
Конкурсная документация К на закупку тест-систем для ифа-анализа, реагентов, реактивов и расходных материалов на 2-е полугодие 2014 года |
|
Конкурсная документация К на закупку тест-систем для ифа-анализа, реагентов, реактивов и расходных материалов на 1-е полугодие 2014 года |
|
" 21 " августа Набор Иммунофа-тс предназначен для количественного определения содержания тестостерона (ТС) в сыворотке крови человека методом твердофазного... |
|
Порядок заполнения формы Заявление о постановке на учет индивидуального... Порядок заполнения формы «Заявление о постановке на учет индивидуального предпринимателя в качестве налогоплательщика единого налога... |
|
Регламентирующие документы Распоряжение о постановке здания на балансовый учет мук "Вычегодский Дом культуры" |
|
Извещение о проведении запроса котировок на поставку ифа-реактивов Запрос котировок проводится: муз «Вторая городская больница» г. Чебоксары, ул. Гагарина, 53, тел.(8352) 23-48-01, 63-25-37 е-mаil:,... |
|
Инструкция по заполнению учетной формы n 01-тб/У "медицинская карта... ТБ/у заполняется при постановке диагноза "Туберкулез". На случай повторного лечения (рецидив; лечение после неэффективного курса... |
|
Извещение о проведении запроса котировок на поставку ифа-реактивов Запрос котировок проводится: муз «Вторая городская больница» г. Чебоксары, ул. Гагарина, 53, тел.(8352) 23-48-01, 63-25-37 е-mаil:... |