Тест активации моноцитов ОФС
Вводится впервые
Настоящая статья описывает методы обнаружения или количественного определения пирогенных примесей, таких как бактериальные эндотоксины (БЭ) и пирогены неизвестной природы в лекарственных средствах (ЛС), предназначенных для парентерального применения в тестах in vitro.
В случаях проведения валидации теста активации моноцитов (МАТ) для испытуемого ЛС является альтернативой определения пирогенности на животных (кроликах).
В данной статье описаны три метода проведения испытания на активацию моноцитов:
Метод А. Количественное испытание.
Метод В. Полуколичественное испытание.
Метод С. Сравнительное испытание с серией ЛС, утвержденной в качестве контрольной.
ВВЕДЕНИЕ
Качественное или количественное определение веществ активирующих моноциты человека или моноцитоподобные клетки происходит за счёт высвобождения эндогенных маркёров, таких как БЭ, провоспалительные цитокины (например, фактор некроза опухоли α (TNFα), интерлейкина-1β (IL-1 β) и интерлейкина-6 (IL-6)) или пирогенные вещества (ПВ) неизвестной природы, участвующие в патогенезе лихорадки и вызывающие пирогенную реакцию.
При испытании ЛС, содержащие противовоспалительные цитокины или ПВ, отличные от БЭ, чаще наблюдаются более выраженные дозозависимые кривые. Наибольшую реакцию при испытании таких ЛС получают в случае неразведенных растворов или минимальных разведений. Поэтому, ЛС, способные содержать пирогены, отличные от БЭ, должны испытываться в диапазоне концентраций, полученных при минимальных разведениях.
Максимально допустимое разведение испытуемого (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого ЛС, в котором возможно определение концентрации пирогенов, соответствующей значению предельного содержания ПВ, установленному для данного ЛС. Испытуемое ЛС может быть проверено в одном или серии разведений при условии, что конечная степень разведения не превысит значения МДР.
МДР рассчитывается по следующей формуле:
МДР
|
|
ПКПВ
|
∙
|
КИР
|
=
|
|
|
|
ПО
|
|
где:
ПКПВ – предельная концентрация ПВ, которая выражается в эквиваленте единиц эндотоксина (ЭЕЭ) на миллиграмм или миллилитр или в единицах биологической активности лекарственного препарата (ЛП) и является критерием приемлемости для принятия положительного или отрицательного решения;
КИР – концентрация испытуемого раствора, т.е. концентрация ЛС или действующего вещества, для которого указано ПКПВ.
ПО - предел обнаружения, это концентрация БЭ, соответствующая пороговому значению, которая определяется с использованием калибровочной кривой стандарта эндотоксина или с серией ЛС, утвержденной в качестве контрольной и выражается в ЭЕЭ/мл. Один ЭЕЭ стимулирует выделение такого же количества IL-1β, IL-6, TNFα, что и одна единица эндотоксина (ЕЭ).
Для расчета предельного содержания ПВ используют формулу (ОФС «Бактериальные эндотоксины»): ПКПВ=  ,
где:
К пороговая пирогенная доза БЭ, выраженная на кг массы тела человека.
М максимальная терапевтическая доза испытуемого ЛП, вводимая в течение одного часа на 1 кг массы тела.
Значения для К представлены в Таблице 1 и соответствуют данным ОФС «Бактериальные эндотоксины»:
Таблица 1
Путь введения
|
К (ЕЭ на килограмм массы тела)
|
Внутривенный
|
5,0
|
Внутривенный, для радиофармацевтических препаратов
|
2,5
|
Интратекальный
|
0,2
|
Для ЛП, где используются другие способы введения, предельная концентрация БЭ обычно определяется на основании результатов, полученных в процессе их разработки.
В методе А концентрацию ПВ вычисляют с помощью калибровочной кривой стандарта эндотоксина.
В методе В концентрацию ПВ определяют при сравнении испытуемого ЛС с растворами стандарта эндотоксина. Исходный раствор стандарта эндотоксина готовят из вторичного стандарта, аттестованного относительно международного стандартного образца.
Пороговое значение эндотоксина вычисляется по формуле:
x̅  = среднее пороговое значение эндотоксина, полученное из 4-х повторностей для реакций на отрицательный контроль (холостой раствор) (R0);
s = стандартное отклонение 4-х повторностей для реакций на отрицательный контроль (холостой раствор) (R0).
ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ
МАТ проводится в условиях, не оказывающих влияние на результаты теста и исключающих контаминацию ПВ.
Испытуемый раствор инкубируют с источником моноцитов человека или с клетками моноцитов человека. Например:
– с гепаринизированной периферической кровью человека, желательно, отобранной не более, чем за 4 ч до испытания;
– с моноцитсодержащей фракцией данной крови, например, мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК), выделенные путем центрифугирования в градиенте плотности или иным способом;
– с линией моноцитоподобных клеток (моноцитов) человека.
Гепаринизированная периферическая кровь человека разводят обычно питательной средой или физиологическим раствором, например, до концентраций от 2 до 50% (об/об). Обычно в испытании используют МКПК или линии моноцитоподобных клеток в питательной среде с добавлением или плазмы донора, или сыворотки группы крови 4 (AB) с концентрацией клеток в суспензии 0,1-1,0 х 106 клеток/мл. При использовании линий моноцитоподобных клеток сыворотку группы крови 4 (АВ) можно заменить на бычью эмбриональную сыворотку, инактивированную нагреванием. Культура клеток готовится при температуре 37 ± 1°С в атмосфере, подходящей для культивируемой среды, например в увлажненном воздухе с 5% С02.
Реакцию выделенного маркёра, например, провоспалительного или пирогенного цитокина, сравнивают с реакциями на стандартный эндотоксин или с серией ЛС, утвержденной в качестве контрольной. Реакцию выбранного маркера калибруют с использованием соответствующего стандарта.
Для выделения маркёров, подтверждающих присутствие ПВ, культура клеток должна быть функционально стабильной.
Стеклянная и пластиковая посуда, используемая в испытании не должна содержать ПВ, в количествах, определяемых в тесте и оказывать влияние на ход реакции. Всю стеклянную посуду и другую аппаратуру, устойчивую к нагреванию, депирогенизируют в стерилизационном сухожаровом шкафу. Рекомендуемым режимом депирогенизации является нагревание при температуре 250 °С не менее 30 минут в соответствии с валидированной процедурой.
Источники клеток и их квалификация
Источниками клеток МАТ являются: цельная кровь и мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК).
Цельную кровь получают от доноров или пулов цельной крови, а МКПК выделяют из крови, полученной от доноров или пулов цельной крови.
Доноры крови должны проходить обследование в соответствии с действующими нормативными правовыми документами.
Пулы (цельной крови или компонентов крови, например МКПК) должны:
- состоять из порций крови минимум от 4-х индивидуальных доноров, но предпочтительно от 8-и или более доноров;
- формироваться путем отбора от каждого пакета донорской крови приблизительно в одинаковых объемах крови или клеток от приблизительно одинакового объема крови.
Для квалификации объединенных в пул клеток поступают следующим образом: в течение 4 ч с момента сбора крови строят дозозависимые кривые для пула с использованием растворов стандарта эндотоксина в не менее чем 4-х разведениях, например, в диапазоне от 0,01 ЕЭ/мл до 4 ЕЭ/мл. Полученные кривые должны отвечать критериям приемлемости калибровочной кривой, описанным в разделе 2.3.1.
Источник клеток, предназначенных для использования в МАТ, например, цельная кровь человека, компоненты крови, такие как МКПК или линии моноцитоподобных клеток, могут быть криоконсервированными. Пулы криоконсервированных клеток получают, объединив их, перед замораживанием, или объединением единичных криоконсервированных донорских порций сразу же после оттаивания.
Пулы криоконсервированных клеток должны:
- состоять из порций крови минимум от 4-х индивидуальных доноров, но предпочтительно от 8-и или более доноров;
- пулы формироваться путем отбора близких объемов крови или клеток от приблизительно одинакового объема крови.
Квалификация криоконсервированной крови или клеток выполняется сразу же после оттаивания (и объединения, в случае необходимости), где полученные дозозависимые кривые для криоконсервированной крови или клеток должны соответствовать критериям приемлемости теста, описанным в разделе 2.3.1.
Для выполнения МАТ необходимо постоянно культивировать непрерывную клеточную линию моноцитов (моноцитоподобных клеток) человека. Для оптимизации метода могут использоваться клоны, полученные от клеточной линии. Клетки должны храниться в асептических условиях и регулярно испытываться на заражение микоплазмой. Дополнительно клетки должны постоянно проверяться на подлинность (например, время удвоения, морфологию и функцию) и стабильность.
Функциональная стабильность клеточной линии оценивается при наблюдении за её состоянием с учетом количества пассажей в процессе повседневных испытаний. Должны быть установлены критерии функциональной стабильности, которые включают критерии роста, максимальную реакцию, полученную в испытании, фоновый шум и экспрессию рецептора. Экспрессия рецептора может проверяться с помощью специфических лигандов, например, липополисахарида (ЛПС) для Толл-подобного рецептора 4 (TLR4), липотейхоевой кислоты (LTA) для Толл-подобного рецептора 2 (TLR2), синтетического бактериального липопротеина для TLR2-TLR1 или синтетического бактериального липопротеина для TLR2-TLR6.
Предварительные испытания
Для обеспечения прецизионности и достоверности эксперимента проводят предварительные испытания, в которых проверяют выполнение критериев для калибровочной кривой, отсутствие взаимодействия растворов в ходе испытания, способность методики обнаруживать БЭ и ПВ, отличные от БЭ, отсутствие влияния испытуемых растворов на систему обнаружения (реактивы, оборудование, посуда и расходные материалы).
Критерии приемлемости калибровочной кривой
Для построения калибровочной кривой готовят не менее 4-х концентраций растворов стандарта эндотоксина. Проводят испытание, используя не менее 4-х повторностей каждой концентрации раствора.
Базовое высвобождение маркёра (контрольный уровень) в отсутствие добавленного раствора стандарта эндотоксина должно быть доведено до минимально возможного уровня.
Для калибровочной кривой должны выполняться два критерия приемлемости:
- регрессионная зависимость ответов (соответственно преобразованных при необходимости) от логарифма концентрации БЭ должна быть статистически значима
(р < 0,01);
- регрессионная зависимость ответов от логарифма концентрации БЭ должна быть линейна (р > 0,05). При анализе 4-параметрической S-образной кривой полученная кривая не должна существенно отличаться от теоретической кривой, рассчитанной с помощью стандартных статистических методов (ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами»).
Испытание на мешающие факторы
Для подтверждения отсутствия влияния испытуемого раствора на результаты определения ПВ, проводят предварительную валидацию методики. Она необходима при любых изменениях, влияющих на результаты испытания. Используя соответствующий растворитель, в геометрической прогрессии делают ряд разведений ЛС, таким образом, чтобы они не превышали МДР испытуемого ЛС. Для Метода А готовят такие же разведения испытуемого ЛС, к которым прибавляют БЭ в концентрации равной или близкой к середине калибровочной кривой), а для Метода В – равные удвоенному значению ПО.
В одном эксперименте одновременно проводят испытания полученных серий разведений. Для вычисления концентрации эквивалента эндотоксина для каждого раствора используют калибровочную кривую. Вычисляют среднее значение полученной концентрации БЭ в растворе, содержащего добавленный стандарт эндотоксина. Для этого из средней концентрации эквивалента эндотоксина, содержащего добавленный стандарт эндотоксина, вычитают среднюю концентрацию эквивалента эндотоксина в растворе ЛС (при его наличии).
Считают, что испытуемый раствор не содержит мешающих факторов, если в условиях испытания измеренная концентрация БЭ, добавленного стандарта эндотоксина в испытуемый раствор, составляет 50-200% от известной концентрации добавленных БЭ. Если испытание не отвечает этому критерию, испытание следует провести Методом С.
При использовании Метода С испытывают раствор ЛС в 3-х концентрациях: с наибольшей концентрацией ЛС (без разведения / с наименьшей кратностью разведения), при которой наблюдается максимальное высвобождение, выбранного маркёра, и её двукратные разведения. Концентрация испытуемого ЛС, при которой наблюдается наибольшее выделение маркёра, может зависеть от особенностей донора клеток/крови, а также серии клеток. Необходимо проводить валидацию методики в отношении используемых клеток в 3-х независимых испытаниях с использованием в каждом из них клеток от различных доноров. Дальнейшие испытания могут быть продолжены, в случае если при минимальном разведении раствора А, регистрируется максимальное высвобождение количества соответствующего маркёра из клеток большинства доноров, а так же при тестировании с этими клетками растворов B и С, полученными при 2-кратном и 4-кратном разведении раствора А (Таблица 2). В случае если максимальное высвобождение соответствующего маркёра происходит при испытании исходного раствора ЛС, то последующее определение должно выполняться с использованием неразведенного испытуемого раствора, а также его разведения в отношениях 1:2 и 1:4 перед добавлением к МКПК. Три разведения, используемые в последующем исследовании, не должны превышать MДР; кратность разведения для этих 3-х растворов обозначаются как f1, f2 и f3. После валидации методики выполняются стандартные испытания с клетками от 4-х индивидуальных доноров или с единичным пулом, или с клетками от 1 пассажа линии моноцитоподобных клеток человека.
2.3.3. Валидация методики в отношении веществ-активаторов моноцитов, отличных от БЭ
В предварительных испытаниях также подтверждают способность выбранной методики обнаруживать провоспалительные или ПВ, отличные от БЭ. Для этого можно использовать архивные образцы, в которых наличие ПВ, отличных от БЭ, было определено в ранее проведенных исследованиях, на основании положительных реакций в испытании «Пирогенность» на кроликах или по развитию побочных эффектов у человека. При отсутствии таких серий ЛС, в предварительные испытания должна быть включена валидация используемой методики с применением специфических лигандов для толл-подобных рецепторов, например, пептидогликанов, липотейхоевых кислот или синтетических бактериальных липопротеинов.
После подбора оптимального разведения раствора испытуемого ЛС для дальнейшего исследования, проводят проверку его отрицательного влияния на результаты методики измерения маркёра (например, ELISA.) Различие в определяемых концентрациях серий разведений стандарта выбранного маркёра в присутствии и отсутствии испытуемого ЛС должно находиться в диапазоне ± 20%.
|
