МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Метод электрофореза ДНК ОФС
в агарозном геле Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод электрофореза ДНК в агарозном геле, предназначенный для определения размеров фрагментов ДНК, а также для их разделения по размеру и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки).
Метод электрофореза ДНК в агарозном геле представляет собой разновидность зонального электрофореза, описанного в ОФС «Электрофорез».
Сущность метода заключается в том, что молекулы ДНК заряженные отрицательно, под действием силы электрического поля движутся от отрицательного электрода - катода (-) к положительному электроду - аноду (+). Агарозный гель, являясь вязкой средой препятствует продвижению макромолекул - образцов ДНК, в связи с этим, короткие фрагменты ДНК движутся к аноду быстрее, чем длинные. Отношение величины заряда нуклеиновых кислот, мало зависящей от рН окружающей среды, к их массе практически одинаково, поэтому метод электрофореза в агарозном геле позволяет определять только размеры различных фрагментов ДНК.
В зависимости от цели эксперимента после проведения электрофореза в агарозном геле дальнейшее исследование может быть аналитическим и/или препаративным.
При аналитическом исследовании после электрофоретического разделения молекул ДНК, проводится последующая визуализация и анализ полученных результатов.
Препаративное исследование применяют для извлечения из геля разделенных компонентов используя несколько способов: агарозный гель подвергают элюции буферными растворами, центрифугированию, замораживанию и оттаиванию и др.
Методика электрофореза в агарозном геле
Подготовка к проведению анализа
На ровную поверхность, устанавливают форму для заливки геля. Не касаясь дна формы (1-2 мм) помещают гребенки на расстоянии 5 см друг от друга или как указано в НД.
Приготовление буферных растворов
Для приготовления буферных растворов обычно используют готовые составы, входящие в комплекты реагентов для метода электофореза в агарозном геле.
Для приготовления буферных растворов для электрофореза в агарозном геле, как правило, используют трис-боратный - ЭДТА (TBE) или трис-ацетатный буферный раствор (TAE) в объеме, достаточном для заполнения камеры для электрофореза и приготовления геля. Возможно использование других подходящих буферных растворов, указанных в нормативной документации. Буферный раствор для электрофореза можно хранить при температуре (18 – 25) оС в течение 1 недели или при температуре (2 - 8) оС в течение 1 мес.
В буферный раствор для образцов добавляют специально подобранный краситель. Присутствие красителя облегчает внесение образцов в лунки и позволяет в режиме реального времени наблюдать продвижение в геле фрагментов ДНК. Однако, избыточное количество красителя может мешать наблюдению фрагментов при ультрафиолетовом исследовании. В качестве красителей используют: бромфеноловый синий, ксиленцианол, крезоловый красный или OrangeG. Для каждой концентрации агарозного геля подбирается определенный краситель и его концентрация для оптимальных условий проведения электрофореза.
Приготовление геля
Для приготовления агарозного геля в СВЧ-печи или на водяной бане расплавляют до прозрачного состояния необходимое количество смеси агарозы, буферного раствора и воды, не допуская закипания геля (в течение 15-20 мин). Расплавленную смесь охлаждают до температуры 50 - 60 оС, далее с помощью автоматического дозатора добавляют бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл, тщательно перемешивают и смесь тонким слоем (до 5 мм) заливают на пластинку так, чтобы зубцы гребенок были погружены не менее, чем на 3 мм, не допуская образования пузырьков воздуха. После полного застывания геля в течение 30 – 60 мин при температуре 18 -25 оС осторожно извлекают гребенки плавным движением вверх, избегая повреждения образовавшихся лунок.
Проведение электрофореза
Камеру для электрофореза заполняют буфером раствором с бромистым этидием, помещают пластинку с агарозным гелем и осторожно извлекают гребенку плавным движением вверх, избегая повреждения образовавшихся лунок.
Буферный раствор должен полностью покрыть пластинку с гелем слоем приблизительно 3-5 мм. Исследуемые образцы ДНК вносят в лунки агарозного геля под буферный раствор, камеру для электрофореза закрывают, электроды подсоединяют к источнику тока и включают напряжение. Молекулы ДНК одинакового размера (и одинакового заряда) движутся единым фронтом, образуя в геле дискретные невидимые полосы. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся от катода (-) к аноду (+).Постепенно исходный образец ДНК, состоящий из разных макромолекул, разделяется на зоны, распределенные по длине пластинки. Процесс электрофореза отслеживают по перемещению в геле красителя - заряженного низкомолекулярного вещества, которое вносят в каждую лунку перед началом электрофореза. Электрофорез останавливают, при приближении красителя к концу пластинки.
Регистрация результатов
Результаты электрофореза ДНК в агарозном геле регистрируют в присутствии бромистого этидия, интеркалирующего соединения, образующего с фрагментами ДНК устойчивое соединение, проявляющееся в ультрафиолетовом свете при 290-330 нм в виде светящихся полос при облучении геля с помощью УФ-трансиллюминатора. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос.
Если образец представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после проведения электрофореза образуются четкие полосы, расположенные на пластинке одна под другой в соответствии с их размером. Для определения относительной молекулярной массы фрагментов ДНК, одновременно с исследуемым образцом проводят электрофорез маркеров макромолекул ДНК с известными молекулярными массами. Набор маркеров должен охватывать весь диапазон молекулярных масс в данной системе. Образец, содержащий маркеры ДНК, вносят в отдельную лунку. Логарифм относительной молекулярной массы маркера линейно связан с его электрофоретической подвижностью Rf — величиной, равной отношению расстояний, пройденных маркером и красителем (фронтом растворителя). По калибровочному графику зависимости логарифма относительных молекулярных масс маркеров от Rf, находят относительную молекулярную массу каждого компонента образца ДНК. Относительная молекулярная масса двухцепочечных нуклеиновых кислот измеряется в числе пар нуклеотидов, одноцепочечных — в числе нуклеотидов.
Разделение линейных молекул
Для разделения линейных двухцепочечных молекул ДНК используют гели с различной концентрацией агарозы от 0,3 % до 2 % соответствующее определенному размеру молекул ДНК (табл.1).
Таблица 1 - Соотношение гелей с различной концентрацией агарозы и размеров, разделяемых ДНК.
-
% агарозы
|
0.3
|
0.5
|
0.6
|
0.7
|
0.8
|
0.9
|
1.0
|
1.2
|
1.5
|
2.0
|
Размер ДНК [kbp]
|
5-60
|
1-30
|
1-20
|
0.8-12
|
0.6-10
|
0.5-8
|
0.5-7
|
0.4-6
|
0.2-3
|
0.1-2
|
|
[kbp] – 1000 пар оснований ДНК
Нижний предел размеров ДНК определяется (в основном) диффузией полосы в геле. В гелях с низкой концентрацией агарозы фрагменты небольших размеров ДНК разделяются, но четкость разделения полос не высокая.
Верхний предел размеров ДНК находится в прямой зависимости от напряженности поля, при которой проводится электрофорез. Чем меньше напряженность поля, тем более эффективно можно разделить длинные молекулы ДНК с большей молекулярной массой.
Разделение суперскрученных и кольцевых молекул
Относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий электрофореза: концентрации агарозного геля в %, скорости электрофореза (например, нельзя пользоваться линейным маркером для оценки размера кольцевых молекул).
Суперскрученные молекулы ДНК имеют меньшую подвижность, поэтому для их разделения используются более высокие значения напряжения и низкое содержание агарозы в геле.
В табл. 2 приведено примерное соотношение подвижностей при умеренной (~6 В/см) скорости электрофореза (в скобках - при более быстром разгоне).
Таблица 2 – Примерное соотношение подвижностей суперскрученных молекул ДНК в зависимости от концентрации агарозы в геле.
Размер суперскрученных. ДНК [kbp]
|
Размер линейной ДНК [kbp] для различных концентраций, (%) агарозного геля
|
0.7%
|
1%
|
1.5%
|
2%
|
2
|
1.2
|
1.3
|
1.3 (1.6)
|
1.5 (1.0)
|
3
|
1.7
|
1.8
|
2 (2.4)
|
2.9 (1.8)
|
4
|
2.2
|
2.3
|
2.7 (3.7)
|
-
|
5
|
2.7
|
2.9
|
3.5 (5.5)
|
-
|
6
|
3.2
|
3.5
|
5 (8.5)
|
-
|
7
|
3.9
|
4.2
|
8.5 (>12)
|
-
|
8
|
4.4
|
5.0
|
>12
|
-
|
9
|
5.1
|
5.9
|
-
|
-
|
10
|
5.8
|
6.8
|
-
|
-
|
12
|
7
|
8.7
|
-
|
-
|
[kbp] – 1000 пар оснований
В присутствии 0.5 мкг/мл бромистого этидия разрешение релаксированной и суперскрученной ДНК увеличивается примерно в 20 раз при повышении ионной силы трис-боратного буферного раствора до 4∙ТBЕ. Того же увеличения можно добиться понижая концентрацию бромистого этидия.
Разделение одноцепочечных ДНК
В процессе разделения на 1% агарозном геле одноцепочечная ДНК в электрическом поле движется быстрее (примерно на 10 %), чем двухцепочечная ДНК того же размера. Однако, одноцепочечная ДНК окрашивается бромистым этидием заметно слабее, чем двухцепочечная примерно в 4-5 раз. В связи с этим, для получения одинаковой интенсивности окраски полос, необходимо использовать примерно в 5 раз больше образца одноцепочечной ДНК.
Для разделения цепей ДНК, нужно либо непосредственно перед электрофорезом прогреть испытуемые образцы примерно 1 мин при температуре 100 oC, либо добавить к образцу раствор натрия гидроксида до получения концентрации 0,1 М раствора и выдержать примерно 5-10 мин при комнатной температуре или при температуре 37 oC.
Напряжённость поля
При оценке напряженности поля для горизонтального электрофореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами.
Оптимальные условия между скоростью и качеством электрофореза для высококачественных или препаративных электрофорезов при напряженности поля около 2 В/см. Для аналитических электрофорезов приемлемое качество сохраняется при напряженности поля до 6 В/см.
ДНК особенно легко теряет бромистый этидий при повышенной температуре. Проведение электрофореза при высоком напряжении может достаточно сильно нагреть гель. Но даже при не высоких значениях напряжения в электрическом поле происходит выделение тепла, поэтому следует обеспечивать теплоотвод и стабильность температурного режима (комнатная температура) с целью исключения изменений вязкости геля, проводимости и скорости потока и, следовательно, искажения зон анализируемых компонентов.
Примечания.
Приготовление трис-боратного буферного раствора pH. В мерную колбу вместимостью 1л вносят 10,8 г трис(гидроксиметил)аминометан, 5,5 г борной кислоты, 4 мл 0,05 М раствора ЭДТА pH 8.0 и 700 мл воды очищенной, перемешивают и доводят объем раствора водой очищенной до метки и вновь перемешивают.
Приготовление буферного раствора для внесения. В мерную колбу вместимостью 25 мл вносят 1,25 мл 0,5 % раствора натрия додецилсульфата, 5 мл 0,1 М раствора ЭДТА pH 8.0, 12,5 мл глицерина, 6,25 мл воды очищенной и тщательно перемешивают. Перед использованием отбирают необходимое количество буферного раствора, разводят в 10 раз водой очищенной и добавляют выбранный краситель до необходимой концентрации, указанной в фармакопейной статье или нормативной документации.
Приготовление агарозного геля. Растворяют необходимое количество агарозы в трис-боратном буферном растворе, нагревая в СВЧ-печи или на водяной бане, не доводя до кипения, до полного растворения агарозы. Полученный раствор остужают до температуры 50-60 оС и добавляют водный раствор бромистого этидия до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Раствор заливают в плашку для электрофореза и оставляют на 0,5 – 1 ч до полного застывания геля. Например, для приготовления 1,5 % раствора агарозного геля следует взять 1,5 г агарозы и растворить в 100 мл буферного раствора.
|
