Возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе пцр
|
Скачать 0.68 Mb.
|
| МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ПИЩЕВЫМ ПУТЕМ ПЕРЕДАЧИ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ НА ОСНОВЕ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.2872-11 1. Авторский коллектив: Научно-исследовательский институт питания РАМН, ФГУН "ЦНИИ эпидемиологии" Роспотребнадзора РФ. 2. Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, протокол N ___ от ________ 2011. 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 июля 2011 г. 4. Введены в действие с момента утверждения. 5. Введены впервые. 1. Область применения 1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод ускоренного выявления (посредством ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией) в пищевых продуктах патогенных бактерий - возбудителей острых и хронических инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи (родов Salmonella, Shigella (в комплексе с энтероинвазивными E. coli), вида Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, энтерогеморрагических веротоксигенных Escherichia coli, термофильных Campylobacter spp. видов C. jejuni, C. coli, C. lari, а также Listeria monocytogenes). 1.2. Методические указания предназначены для специалистов лабораторий Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также иных организаций и учреждений, занимающихся вопросами оценки качества и безопасности пищевых продуктов, аккредитованных (лицензированных) на проведение соответствующих исследований в установленном порядке. 2. Определения, обозначения, сокращения ПЦР - полимеразная цепная реакция ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота FEP - детекция по "конечной точке" FRT - детекция в режиме "реального времени" ВКО - внутренний контрольный образец ОКИ - острые кишечные инфекции ТСБДЭ - триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом ТСАДЭ - триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом ФБР - фосфатный буферный раствор ЗПВ - забуференная пептонная вода ЗФР - забуференный физиологический раствор 3. Общие положения 3.1. Лабораторный контроль загрязненности пищевых продуктов патогенными бактериями с использованием традиционных культуральных методов анализа сопряжен с трудоемкостью, длительностью. Даже в случае отрицательного результата требуется от 3 до 7 дней для выдачи ответа. Этот срок увеличивается при идентификации изолятов биохимическими и серологическими методами, что обусловливает проблемы при расследовании вспышек ОКИ и других заболеваний с пищевым путем передачи. Так, при вспышках шигеллеза, занимающих ведущее место в структуре ОКИ пищевого происхождения в РФ, из-за низкой эффективности выделения возбудителя в чистой культуре из инкриминированных продуктов возникают значительные трудности при верификации инцидентов. Наряду с этим, среди микробных контаминантов пищи получают все большее распространение возбудители новых и вновь возникших заболеваний с измененными свойствами, дополнительными факторами патогенности (по терминологии ФАО-ВОЗ "эмерджентные" патогены), такие как энтерогеморрагические E. coli (O157:H7 и другие серотипы), Campylobacter jejuni, Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, Listeria monocytogenes. Культуральные методы зачастую не позволяют провести их четкую дифференциацию от родственных непатогенных штаммов, имеющих одинаковые фенотипические свойства. Это снижает достоверность результатов, осложняет оценку распространенности патогенов в пищевых продуктах, а также не гарантирует от необоснованных браковок продукции. 3.2. Существенно оптимизировать процедуры определения, сократить время исследований и повысить специфичность позволяют новые технологии геномного анализа. Наиболее надежным в последние годы признается анализ микробных нуклеиновых кислот и выявление специфичных участков ДНК, путем ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. 3.3. Представленный в настоящих указаниях метод является альтернативным классическому бактериологическому посеву и предусматривает ускоренное определение наличия или отсутствия ДНК, и соответственно, бактерий родов Salmonella, Shigella, вида Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, энтерогеморрагических Escherichia coli, термофильных Campylobacter spp. видов C. jejuni, C. coli, C. lari, Listeria monocytogenes в определенной массе (объеме) пищевого продукта, подвергнутого инкубации в жидких селективных питательных средах (при необходимости дополнительно прединкубации в неселективных средах). 3.4. Предварительная инкубация исследуемых продуктов в питательных средах является обязательным этапом анализа, обеспечивающим биологическое накопление возбудителей <1>. -------------------------------- <1> При наличии эпидемиологических данных о возможности массивного заражения пищевого продукта искомыми возбудителями и только в ходе расследования вспышек пищевых отравлений и инфекций допускается исследовать инкриминированные образцы нативных пищевых продуктов с целью получения предварительных данных о причинном агенте вспышки. При этом положительные результаты ПЦР-анализа нативных пищевых продуктов должны подтверждаться выделением возбудителя в культуре, а отрицательные результаты не должны интерпретироваться и не могут служить основанием для прекращения поиска возбудителя с предварительной инкубацией в питательных средах. 3.5. ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией также подлежит включению в комплексное тестирование подозрительных культур патогенных микроорганизмов, выделенных из пищевых продуктов бактериологическими методами (согласно утвержденным в установленном порядке методам определения), с целью подтверждения их принадлежности к родам Salmonella, Shigella, Campylobacter (видов C. jejuni, C. coli, C. lari), Listeria (вида L. monocytogenes), энтерогеморрагическим E. coli и E. (Cr.) sakazakii в качестве дополнительных к биохимическим и серологическим методам идентификации, в том числе в обязательном порядке при: - затруднениях идентификации Salmonella spp. - взамен расширенного набора биохимических тестов в случаях отсутствия агглютинации культуры с поливалентной диагностической сальмонеллезной 0-сывороткой (A, B, C, D, E) и со смесью 0-сывороток редких групп при положительном результате стандартного набора биохимических тестов; при предположительном результате в случае наличия агглютинации с сыворотками редких групп; при положительных результатах серологического исследования и нетипичных результатах биохимических тестов (отклонения по 2 и более признакам); - идентификации энтерогеморрагических E. coli (O157:H7 и другие серотипы) - взамен расширенного набора биохимических тестов одновременно с подтверждением серологической принадлежности к серогруппе O157; - идентификации L. monocytogenes - взамен расширенного набора биохимических тестов одновременно с определением наличия лецитиназной и бета-гемолитической активности; - идентификации других вышеперечисленных микроорганизмов при нетипичных результатах биохимических тестов (отклонения по 2 и более признакам). 3.6. Метод применяется для исследования пищевых продуктов при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора (контроля), скрининговых исследований для целей гигиенического мониторинга, санитарно-эпидемиологических экспертиз и оценок, санитарно-эпидемиологических расследований вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи, а также может быть использован для проведения производственного контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов. 4. Сущность метода 4.1. Принципом метода является выявление путем ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией последовательностей (фрагментов) ДНК, строго специфических для геномов бактерий родов Salmonella, Shigella, вида Enterobacter (Cronobacter) sakazakii, веротоксигенных Escherichia coli, Listeria monocytogenes, термофильных Campylobaster spp. В основе ПЦР лежит многократное увеличение числа копий (амплификация) нуклеотидных фрагментов - мишеней ДНК, ферментом Taq-полимеразой в присутствии синтетических олигонуклеотидных праймеров и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Гибридизация флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов, присутствующих в составе реакционной смеси, с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени сопровождается нарастанием флуоресценции. Измерение интенсивности флуоресцентного сигнала позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации. 4.2. Метод ускоренного выявления предусматривает высев определенных количеств исследуемых образцов пищевых продуктов в соответствующие неселективные и селективные питательные среды, инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, экстракцию (выделение) ДНК из культуральной жидкости <2>, амплификацию участка ДНК целевых бактерий со специфичными праймерами и гибридизационно-флуоресцентную детекцию ампликонов, осуществляемую в одном из двух вариантов: в режиме реального времени в ходе ПЦР (вариант FRT) либо после завершения амплификации (вариант FEP). -------------------------------- <2> В случае исследования образцов нативных пищевых продуктов или бактериальных культур, выделенные из пищевых продуктов, - экстракция ДНК осуществляется из соответствующим образом подготовленных проб этих продуктов или чистых культур, выращенных на пластинчатых средах по п. 8.5.1. При использовании варианта FEP детекция флуоресцентного сигнала осуществляется после окончания ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора (по "конечной точке"), а при использовании варианта FRT - непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме "реального времени". Выделение ДНК из каждого исследуемого образца проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО), используемого на всех этапах исследования, начиная с этапа экстракции ДНК. Детекция амплифицированной ДНК целевого микроорганизма и ВКО проводится по самостоятельным раздельным каналам. 4.3. При положительных результатах обнаружения патогена жизнеспособность присутствующих в исследуемом продукте искомых микроорганизмов должна быть подтверждена бактериологическим посевом с соответствующим биохимическим и серологическим типированием или ПЦР-анализом парных проб (прошедшей и не прошедшей культуральное обогащение) в режиме FRT.  КонсультантПлюс: примечание. Нумерация пунктов дана в соответствии с официальным текстом документа. 4.3. Анализ осуществляется с применением коммерчески доступных комплектов реагентов, обеспечивающих амплификацию и детекцию ампликонов в одной пробирке, прошедших регистрацию в РФ в установленном порядке после стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа. 5. Требования к выполнению анализов 5.1. Работа по выявлению бактериальных патогенов в пищевых продуктах должна проводиться в лаборатории, выполняющей микробиологические и молекулярно-биологические (ПЦР) исследования и лицензированной на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний III - IV групп патогенности, с соблюдением санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней", а также дополнениями и изменениями к ним СП 1.3.2518-09 - "Дополнения и изменения N 1 к СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней" (приложение), ГОСТ Р ИСО 7218-2008 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям" и методических указаний МУ 1.3.2569-09"Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности". Исследуемые образцы пищевых продуктов следует рассматривать как инфекционноопасные и организовывать их хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней". 5.2. Исследование осуществляется с применением описанных в настоящих указаниях методов культурального бактериологического анализа и коммерчески доступных ПЦР тест-систем с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации, предназначенных для применения в данной области и разрешенных к применению на территории РФ в установленном порядке. Для экстракции ДНК и ее детекции методом ПЦР должны применяться наборы реагентов, предусматривающие возможность использования внутреннего контрольного образца, проходящего все этапы исследования и служащего для выявления возможных ошибок при его проведении. 5.3. Условия безопасного проведения работ Процесс амплификации приводит к накоплению миллионов копий фрагментов ДНК, специфичных для целевых организмов. При вскрытии ПЦР-пробирок, прошедших этап амплификации в "чистых" зонах ПЦР лаборатории или в микробиологической лаборатории, продукты амплификации могут распространяться по лаборатории и обуславливать появление ложно-положительных результатов исследований. Для снижения риска распространения ампликонов и предотвращения контаминации необходимо соблюдать ниже перечисленные правила работы в соответствии с МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности": 1) не открывать ПЦР-пробирки после амплификации, удалять отходы с продуктами ПЦР только в закрытом виде; 2) перед входом в рабочую зону снимать уже использованные перчатки. Заранее готовить новые перчатки, перед тем как покинуть рабочую зону; 3) сбрасывать наконечники с пипеток в пластиковый пакет и выносить его после каждого использования из рабочей зоны; 4) промывать рабочую зону после каждого использования дезсредством <3>; 5) для биологической защиты рабочей зоны использовать ультрафиолетовые облучатели до и после работы в течение 15 - 30 мин.; 6) деконтаминировать пипетки еженедельно согласно рекомендациям производителя (121 °C в течение 30 мин.); 7) обрабатывать охлаждающие блоки в следующей последовательности: обработка дезсредством<3>, ополаскивание водой и протирка сухой салфеткой перед размещением в холодильнике; 8) убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя дезсредства <3>; 9) утилизировать неиспользованные образцы и реактивы. В случае обнаружения контаминации (положительный результат в ПЦР в гибридизационно-флуоресцентной детекцией для отрицательного контрольного образца), вся рабочая зона должна быть подвергнута тщательной санитарной обработке. Для этого необходимо следовать перечисленным указаниям: 10) санитарную обработку проводить в перчатках; 11) протереть наружные поверхности раствором дезсредства <3>. Оставить жидкость на поверхности примерно на 10 мин., затем вытереть насухо одноразовыми салфетками. Затем протереть поверхности 70% этиловым спиртом. Облучить поверхности ультрафиолетом в течение ночи; 12) утилизировать все расходные материалы (наконечники для пипеток, растворы реагентов и т.д.), которые были извлечены из упаковок и частично израсходованы, путем автоклавирования при 121 °C в течение 30 мин.; 13) очистить наружные поверхности всех используемых приборов и инструментов (амплификатор, пипетки и т.д.) с применением дезсредства и спирта; </3></3></3></3></2></2></1></1> |
Похожие:
 |
Методические разработки по аудиторным занятиям утверждаю Принципы и методы лечения инфекционных больных, диагностики и профилактики инфекционных болезней. Основные этапы познания инфекционных... |
 |
На поставку товара: Реагенты для генодиагностики возбудителей Реагенты для генодиагностики возбудителей инфекционных заболеваний г. Екатеринбург «24» апреля 2013 года |
|
На поставку товара: Реагенты и расходные материалы для генодиагностики возбудителей Реагенты и расходные материалы для генодиагностики возбудителей инфекционных заболеваний г. Екатеринбург «08» октября 2013 года |
|
Вакцинопрофилактика инфекционных болезней Широкое распространение инфекционных заболеваний во все времена не только приводило к гибели многих миллионов людей, но и было основной... |
|
1. назначение Наборы реагентов GenePak® dna pcr test предназначены для обнаружения ДНК возбудителей инфекционных заболеваний в биологических пробах... |
|
И стерилизация Рецензенты: доц каф микробиологии, вирусологии и иммунологии, канд мед наук Н. Ф. Казак; зав лабораторией индикации возбудителей... |
|
Удаление или уничтожение возбудителей инфекционных (паразитарных)... Дезинфекция удаление или уничтожение возбудителей инфекционных (паразитарных) болезней в (на) объектах окружающей среды. Производится... |
|
Методическая разработка практического занятия тема: «Устройство и... Методическая разработка предназначена для преподавателей медицинских училищ и колледжей для проведения практического занятия по теме... |
|
Справочник Инфекционные болезни для всех ... |
|
Инструкция № по профилактике сезонных заболеваний по профилактикерррр осень С-витаминизацию организма. Аскорбиновая кислота обладает свойством подавлять вирусы. Особое внимание следует уделить рациону питания,... |
|
Профилактика инфекционных заболеваний Эффективная профилактика инфекционных... Эффективная профилактика инфекционных заболеваний цыплят-бройлеров в первый период выращивания |
|
Приказ 22. 10. 1993 n 223 о сборе, обеззараживания и сдаче использованных... Спида и других инфекционных заболеваний путем возможного повторного использования медицинских изделий однократного применения из... |
|
Рекомендации по эксплуатации и применению Воздействие на организм «мёртвой» воды Подавляет развитие болезнетворных бактерий, вирусов, возбудителей грибковых заболеваний |
|
Оценки уязвимости здоровья населения Российской Федерации в отношении... Российской Федерации в отношении некоторых инфекционных и трансмиссивных заболеваний в региональном аспекте для первой половины XXI... |
|
В пищевых продуктах и кормах Управление по безопасности продуктов питания и потребительских товаров (vwa), Амстердам, Нидерланды |
|
Mini-vidas автоматический анализатор для быстрого обнаружения патогенов... Около 100 всемирно известных референсных лабораторий (usda, fda, другие государственные лаборатории) и крупнейшие международные компании... |