Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Екатеринбург, в отделении вспомогательных репродуктивных технологий
Научный руководитель
доктор медицинских наук, профессор
Ковалев Владислав Викторович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Долгушина Валентина Федоровна
доктор медицинских наук, профессор
Коновалов Вячеслав Иосифович
Ведущая организация
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится « » марта 2012 года в____часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Автореферат разослан «__» _____________________2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
Казачкова Элла Алексеевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
На сегодняшний день в России остро стоит проблема демографического кризиса. Население страны ежегодно неуклонно снижается. Это ведет к уменьшению трудовых ресурсов и способствует развитию социально-экономических проблем. Если еще в 2003 году численность населения составляла 145,2 млн. человек, то к 2009 году это значение составило уже 141,9 млн. человек (По данным РОССТАТ (www.gks.ru)).
Одним из путей решения демографических проблем являются вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), которые применяются для лечения различных форм бесплодия. Основой для этих методов является процедура экстракорпорального оплодотворения преовуляторных фолликулов и перенос дробящихся эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ) (Кулаков В.И., 2005; Кэй Э., 2008). Этот метод применяется при следующих формах бесплодия: трубно-перитонеальное; гормональное; бесплодие, связанное с эндометриозом, синдромом поликистозных яичников; бесплодие неясного генеза, а также при некоторых формах мужского бесплодия (Назаренко Т.А., 2008; Пересада О.А., 2009).
Причины бесплодия многообразны и, несомненно, их определение и преодоление является важнейшей задачей для реализации репродуктивного потенциала женщины.
По данным РАРЧ (Российской Ассоциации Репродукции Человека) за 2009 год, частота наступления беременности в «свежих» циклах (ЭКО+ИКСИ) в расчете на перенос эмбрионов составила 36,8%, на пункцию фолликулов – 34,0%. Родами (28 недель и более) завершилось 19,3% от общего количества начатых циклов. По отчету ESHRE (European Society of Human Reproduction and Embryology) за 2008 год, во Франции частота наступления беременности составила 23.5% (на пункцию), а частота родов 18,7% (на пункцию), в Германии 24.9% и 18.8% соответственно, в Великобритании 30.7% и 25.5% соответственно. А суммарно в странах Европы, включая Россию, выполнено 283 493 циклов с эффективностью 29% беременностей и 21.5% родов соответственно. Таким образом, реальная эффективность процедуры ЭКО и ПЭ близка к 20% и не имеет тенденции к улучшению.
Учитывая сложную экономическую ситуацию в России, сформировавшуюся на фоне демографического кризиса и высокую стоимость методов ВРТ, эффективность лечения бесплодия, достигнутая на сегодняшний день в ведущих клиниках страны, не может в полной мере удовлетворить потребности населения. Именно поэтому вопросы повышения эффективности методов ВРТ сейчас особенно актуальны.
Достижения молекулярной генетики, сделанные за последние десятилетия, позволяют по-новому взглянуть на проблему бесплодия и на перспективу его лечения. Особенностью многих полиморфных генов является то, что патологические симптомы возникают при наличии дополнительных «провоцирующих» факторов (гормональная стимуляция в протоколе ЭКО и ПЭ, особенности питания, беременность и т.д.). Выяснение этих дополнительных условий позволяет на ранних этапах применять превентивные терапевтические меры для благополучного наступления и течения беременности и эффективно предотвращать развитие осложнений у носителей вариантных генов.
Цель исследования - повышение эффективности программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов путём создания алгоритма обследования, подготовки и отбора пациенток к программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, разработанного на основе изучения роли полиморфизма генов, предрасполагающих к тромбофилии.
Задачи исследования
Провести клинико-статистический анализ результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов у пациенток исследуемых групп.
Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов генов системы фолатного цикла (метилентетрагидрофолат-редуктаза (MTHFR C677T), метионинсинтаза-редуктаза (MTRR A66G), метионинсинтетаза (MTR A2756G)) и генов системы гемостаза (V фактора свертывания (FV G1691A) и протромбина (FII G20210A)) у пациенток с бесплодием.
Установить ключевые факторы, включая генетические предрасположенности, влияющие на эффективность программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.
Разработать решающее правило прогноза исходов программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, на основе которого создать алгоритм обследования и подготовки супружеских пар.
Научная новизна
Установлены генетические маркёры, наиболее часто встречающиеся у пациенток с бесплодием по отношению к женщинам с сохраненной фертильностью.
Определены генетические маркёры системы фолатного цикла и системы гемостаза, наиболее часто встречающиеся у пациенток с неудачами экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, проживающих на территории Свердловской области. Установлена роль этих маркёров в структуре причин неблагоприятных исходов экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.
Разработан способ прогнозирования исходов программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, учитывающий особенности генотипа пациентки.
Практическая значимость исследования
Выявлены наиболее информативные показатели, влияющие на прогноз лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и на течение беременности, определение которых позволяет снизить процент неудачных попыток экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и повысить эффективность программы в целом.
Определены группы риска по неэффективности программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и по неблагоприятному течению беременности, с позиции определения изменений структуры генов.
Разработано решающее правило прогноза исхода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, на основе которого создан алгоритм обследования и подготовки женщин к процедуре экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.
Положения диссертации, выносимые на защиту
Наличие мутаций генов, предрасполагающих к тромбофилии, существенно снижает эффективность процедуры экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, и является основой для формирования групп риска по неблагоприятным репродуктивным исходам экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.
Учет значимых для репродуктивного исхода мутаций, а так же данных анамнеза и результатов клинико-лабораторных методов исследования существенно повышает точность прогноза исходов экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.
Использование алгоритма обследования и подготовки пациенток к процедуре экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в сочетании с решающим правилом прогноза исходов экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов повышает эффективность преодоления бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в практическую работу отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБУ «НИИ ОММ» МЗСР РФ (г. Екатеринбург).
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены на I конгрессе акушеров-гинекологов Урала с международным участием «Высокотехнологичные виды медицинской помощи на службе охраны здоровья матери и ребенка» (Екатеринбург, 2009), на IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010), на итоговой юбилейной научной сессии кафедры акушерства и гинекологии ФПК ГОУ ВПО УрГМА Росздрава и ФГУ «НИИ ОММ» Минздравсоцразвития России «Успешная репродукция: путь от врача к пациенту» (Екатеринбург, 2010), на Международной научно-практической конференции «От эмбриона к человеку» (Екатеринбург, 2011), на научных чтениях посвященных памяти В.И. Кулакова (Москва, 2011), и на VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, включая 31 таблицу и 1 рисунок. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, главы результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций.
Список литературы включает 184 литературных источников, в том числе 43 отечественных и 141 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на базе ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздравсоцразвития России в период с 2008-2011 гг., при участии Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской Академии наук.
Для оценки роли генетической тромбофилии, в эффективности вспомогательных репродуктивных технологий, а именно экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки, из всех супружеских пар, проходящих лечение бесплодия в отделении вспомогательных репродуктивных технологий ФГБУ «НИИ ОММ» МЗСР РФ, нами были отобраны пары с трубно-перитонеальным генезом бесплодия. Всем пациенткам выполнено клинико-лабораторное обследование, по результатам которого исключены инфекции, передающиеся половым путём, гормональные нарушения и мужской фактор бесплодия.
Проведено сравнительное открытое когортное проспективное исследование оценки роли полиморфизма генов, предрасполагающих к тромбофилии, в неэффективных попытках ЭКО и ПЭ.
Основную группу составили 145 пациенток. Критериями включения в группу являлись трубно-перитонеальный генез бесплодия, репродуктивный возраст (от 25 до 42 лет) и сохраненный овариальный резерв (уровень ФСГ не более 11,0
мЕд/л). В качестве контрольной группы было отобрано 145 женщин со спонтанно наступившей беременностью, завершившейся рождением живого здорового ребенка. В группу включались только те женщины, которые не имели бесплодия и невынашивания беременности в анамнезе. Общими критериями исключения из групп являлись мужской фактор бесплодия, миома матки (деформирующая полость матки, или размеры узла в диаметре более 3см), тяжелые формы эндометриоза (аденомиоза), поздний репродуктивный возраст (старше 42 лет).
Основная и контрольная группы не имели существенных различий по месту жительства, возрасту, частоте и структуре экстрагенитальной патологии.
Всем пациенткам основной группы была выполнена программа экстракорпорального оплодотворения, завершившаяся переносом эмбрионов в полость матки. Для выполнения контролируемой овариальной гиперстимуляция (КОГ) применялись короткие протоколы с агонистами гонадотропин релизинг гормона (Бусерелин-спрей назальный, ООО Фарм-Синтез, Россия) и протоколы с антагнонистами гонадотропин релизинг гормона (Цетротид – 0,25мг, SERONO Europe Ltd, Великобритания). Для стимуляции роста фолликулов применялись мочевые и рекомбинантные гонадотропины: Пурегон (фоллитропин-бета)(производитель Organon, Нидерланды), Гонал-Ф (фоллитропин альфа) (производитель
SERONO Europe Ltd, Великобритания) и Менопур (менотропин) (производитель Ferring Gmbh, Германия). В качестве триггера овуляции применялись: Прегнил (гонадотропин хорионический) (производитель Organon, Нидерланды) и Овитрель (хориогонадотропин альфа) (производитель
SERONO Europe Ltd, Великобритания). Гонадотропины вводились с 3-го дня менструального цикла в протоколах с агонистами гонадотропин релизинг гормона и со 2-го дня менструального цикла в протоколах с антагонистами гонадотропин релизинг гормона в суточной дозировке: Пурегон – 75-375 МЕ подкожно, Гонал-Ф – 75-375МЕ подкожно, Менопур – 75-300МЕ подкожно. Триггер овуляции вводился на 10-13 день цикла, при наличии лидирующего фолликула более 17мм в диаметре и хотя бы 2 фолликулов более 15 мм в диаметре. Используемые дозировки: Прегнил – 10 000 МЕ внутримышечно, Овитрель – 6500МЕ подкожно. Введение препарата ХГ осуществлялось за 36 часов до предполагаемой пункции. Аспирацию ооцитов и фолликулярной жидкости выполняли через 36 часов после введения овуляторной дозы ХГ раздельно из правого и левого яичника. С целью получения ооцитов и фолликулярной жидкости из фолликулов яичников производили трансвагинальную пункцию с помощью влагалищного пункционного датчика ультразвукового аппарата B-K Medical Sandtoften 9.
Для переноса эмбрионов использовали одноразовые катетеры фирмы
COOK MEDICAL INC. (США).
Для работы с эмбриологическим материалом использовались среды MediCult (Дания).
Перенос эмбрионов производился на 3-5 сутки после трансвагинальной пункции фолликулов. Через 14 дней после переноса эмбрионов у пациенток определялся уровень ХГ в крови, а через 21 день после переноса выполнялось УЗИ.
Обследование супружеских пар проводилось по единой схеме, включавшей: соматический, акушерско-гинекологический анамнез, клинико-лабораторное обследование, УЗИ на базе лабораторий ФГБУ «НИИ ОММ» МЗСР РФ, консультирование терапевтом, по показаниям – эндокринологом, маммологом, андрологом. Предварительное обследование супружеских пар соответствовало приказу №67 МЗРФ «О применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия» и было дополнено исследованием генетических полиморфизмов (MTHFR, MTR, MTRR, FV, FII) и определением уровня гомоцистеина в плазме.
Для определения различных вариантов генов использовали набор реагентов и протокол для выделения ДНК из различного биологического материала фирмы НПО "ДНК-Технология" (Россия) – «Проба-Рапид». Полученный материал подвергали ПЦР-амплификации в режиме "реального времени" с использованием комплектов реагентов и протоколов фирмы НПО "ДНК-Технология" (Россия). Детекция результатов осуществляли на приборе ДТ-96, производства НПО "ДНК-Технология". Анализ результатов ПЦР обеспечивается программным обеспечением прибора ДТ-96.
Определение уровня гомоцистеина в плазме выполнялось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартных тест-систем Axis EIA AXH00001, согласно инструкции производителя. Определение уровня гомоцистина было выполнено на 80 образцах плазмы (36 из группы контроля и 44 из основной группы, отобранных в случайном порядке).
Статистическую обработку материала проводили на IBM PC с использованием программ Microsoft Exel 2007 для Windows 7 и Statistica 6,0. Полученные результаты обработаны методом вариационной статистики. Для построения модели прогноза использовали метод дискриминантного анализа с пакетом прикладных программ Statgraphics. Достоверность различий средних величин вычисляли по методу Стьюдента и точному критерию Фишера, а достоверным считали различие при уровне значимости p < 0,05. Для оценки относительного риска неудачи программы ЭКО и ПЭ рассчитывали отношение шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI - 95%).
