Каталог коллекции чистых культур возбудителей грибных болезней картофеля и других пасленовых
|
Скачать 0.68 Mb.
|
|
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха» Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова Каталог коллекции чистых культур возбудителей грибных болезней картофеля и других пасленовых Москва, 2016 УДК: 582.28 Авторы: Г.Л. Белов – к.б.н., старший научный сотрудник отдела защиты ФГБНУ ВНИИКХ С.Н. Еланский – д.б.н., ведущий научный сотрудник биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, руководитель Биобанка «Грибы - возбудители болезней растений семейства пасленовых» депозитария МГУ имени М.В. Ломоносова Л.Ю. Кокаева – к.б.н., научный сотрудник биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова А.В. Александрова – д.б.н., ведущий научный сотрудник биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова В.Н. Зейрук – д.с.-х.н., заведующий отделом защиты ФГБНУ ВНИИКХ Каталог коллекции чистых культур возбудителей грибных болезней картофеля и других пасленовых / Г.Л. Белов, С.Н. Еланский, Л.Ю. Кокаева, А.В. Александрова, В.Н. Зейрук. – М.: ВНИИКХ, 2016. – 32 с. В каталоге представлены характеристики штаммов патогенных для картофеля видов грибов и оомицетов из совместной коллекции ФГБНУ ВНИИКХ и Биобанка «Грибы – возбудители болезней пасленовых культур» депозитария МГУ имени М.В. Ломоносова. Большинство коллекционных штаммов охарактеризованы по структуре ядерных рибосомных генов и межгенных локусов, а также по устойчивости к некоторым популярным фунгицидам. Охарактеризованные коллекционные штаммы могут быть предоставлены по запросу заинтересованных организаций. Рассмотрен и утвержден на заседании НТС по технологии ФГБНУ ВНИИКХ 20 октября 2016 г, протокол № 85 Сбор пораженных образцов, выделение чистых культур и анализ свойств штаммов грибов выполнены при поддержке гранта Российского научного фонда № 14-50-00029, выделение чистых культур и анализ штаммов Colletotrichum coccodes – при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 15-29-02512. © ФГБНУ ВНИИКХ, 2016. Содержание Общая характеристика грибов 4 Выделение фитопатогенных грибов и определение их видовой принадлежности 5 Питательные среды 7 Изучение устойчивости штаммов грибов к некоторым широко применяемым фунгицидам 9 Методы молекулярной диагностики фитопатогенных грибов 10 Общее описание коллекции 11 Colletotrichum coccodes (Wallr.) S. Hughes 12 Thanatephorus cucumeris (A.B. Frank) Donk 16 Helminthosporium solani Dur. et Mont 18 Alternaria solani Sorauer, A. alternata (Fr.) Keissl 22 Виды рода Fusarium 24 Phytophthora infestans (Mont.) de Bary 26 Список использованной литературы 29 Общая характеристика грибов Грибы – это организмы, выделяемые в самостоятельное царство, отличающиеся как от растений, так и от животных. В отличие от растений они лишены хлорофилла и требуют для своего питания готовых органических веществ. В отличие от животных грибы не способны к активному поглощению пищи и питаются, всасывая питательные вещества из окружающей среды. Эти особенности питания наложили отпечаток как на морфологию, так и на физиологию грибов. Тело большинства грибов представлено мицелием, состоящим из тонких, сильно разветвленных гиф. Питание всасыванием заставляет грибы максимально погружать своё тело в субстрат. В то же время для активного распространения и захвата новых площадей споры (грибные семена) должны быть вынесены над субстратом. Для этого у грибов существуют разнообразные структуры (плодовые тела, спорангиеносцы, конидиеносцы и др.). Грибы разделяют на облигатных паразитов (способных жить только на растении, питаясь его соками), факультативных паразитов (живущих на мертвом органическом субстрате, но способных и паразитировать на растениях), сапротрофов, питающихся только мертвой органикой, и симбиотрофов, образующих на корнях растений микоризу. У паразитов мицелий расположен, как правило, внутри пораженного растения. В зависимости от степени паразитизма гриба меняется и характер распространения гиф в тканях пораженного растения. У облигатных паразитов мицелий, как правило, идет по межклетникам, а в клетки проникают особые выросты – гаустории, благодаря которым и осуществляется питание гриба. Такой тип питания обычен, например, для возбудителя фитофтороза. У факультативных паразитов гифы идут не по межклетникам, а через клетки, осмос питательных веществ осуществляется всей поверхностью находящихся в клетках гиф. Гаустории не образуются. Своими ферментами факультативные паразиты не только растворяют оболочку клеток растения-хозяина, благодаря чему проникают внутрь, но и убивают их, после чего гриб питается содержимым убитой клетки как сапротроф. У грибов различаются два способа размножения – вегетативное и репродуктивное. Последнее происходит при помощи спор, образующихся бесполым, половым и вегетативным путем. Грибы могут производить огромное количество спор – одна особь образует десятки тысяч, а иногда и сотни миллионов спор. Все споры грибов можно разделить на две группы – покоящиеся и пропагативные (споры распространения). Для покоящихся спор характерен период покоя, во время которого они обычно не прорастают, в то время как пропагативные прорастают сразу же после образования при наличии необходимой температуры и влажности. Покоящиеся споры образуются как бесполым или вегетативным путем (хламидоспоры, например, у грибов рода Fusarium), так и половым (ооспоры, зигоспоры, некоторые аско- и базидиоспоры). Покоящиеся споры имеют обычно толстую оболочку, довольно крупные размеры и желтую или темную окраску. Они содержат запасные питательные вещества (часто жиры). Покоящиеся споры фитопатогенных грибов обычно появляются в конце вегетации на отмирающих или мертвых тканях растения-хозяина и перезимовывают на них или в почве. Пропагативные споры (споры размножения) в отличие от покоящихся спор имеют тонкую оболочку, содержат меньше питательных веществ и обычно недолговечны. К спорам размножения относятся конидии, пикноспоры, зооспоры, базидиоспоры, аскоспоры и др. Эти споры образуются в огромных количествах в течение вегетационного периода и служат главным образом для распространения патогенов, а, следовательно, для распространения и развития болезни. Помимо образования спор, грибы обычно обладают способностью к вегетативному размножению. Вегетативное размножение патогенов часто происходит при неблагоприятных условиях развития. Так, при недостатке влаги, питательных веществ или воздействии других неблагоприятных факторов, гриб может образовывать хламидоспоры, геммы, склероции, ризоморфы и иные приспособления для своего сохранения, размножения или распространения. Эти структуры можно сравнить с клубнями, так как они служат для вегетативного размножения. С наступлением благоприятных условий склероции и микросклероции вновь прорастают, давая начало развитию гриба. Выделение фитопатогенных грибов и определение их видовой принадлежности Для правильного диагноза, т. е. распознавания (определения) болезни и ее возбудителя, необходимо всестороннее изучение больного растения. Прежде всего, тщательно изучают внешние симптомы поражения (макроскопический метод). При этом наряду с констатацией типа болезни (пятнистость, увядание или гниль, налет и т. д.) обращают внимание на наличие на пораженной ткани самого возбудителя (его плодоношения, мицелия, склероциев и пр.). В некоторых случаях, когда симптомы болезни очень четки и характерны только для определенного вида болезни (например, белый мучнистый налет и плодовые тела на верхней поверхности листа при поражении настоящей мучнистой росой; вытянутые в длину пустулы на стеблях злаков при поражении их линейной ржавчиной и др.), для установления диагноза можно ограничиться и внешними симптомами. Но для большей достоверности лучше прибегнуть к исследованию больного растения под микроскопом. Анализируют форму и строение плодовых тел, форму, размеры и окраску спор и т. д. Если возбудитель на поверхности анализируемого образца не обнаружен, можно прибегнуть к методу влажной камеры, основанному на использовании способности мицелия грибов, находящихся внутри пораженной ткани растения, прорастать наружу и образовывать спороношение в условиях повышенной влажности. Для изготовления влажной камеры обычно используют чашки Петри или Коха. На дно чашки помещают круг фильтровальной бумаги соответствующего диаметра, стерилизуют при температуре 110 °С в течение двух часов и увлажняют стерильной водой. Небольшие части исследуемых тканей после поверхностной стерилизации раскладывают на предметные стекла, положенные на фильтровальную бумагу на дне чашки. В случаях, когда исследование во влажной камере показало присутствие гриба, но определить его не удалось, используют выделение возбудителя в чистую культуру. Чистые культуры используют для самых разнообразных целей, например, для изучения устойчивости штамма к фунгицидам, для выделения ДНК и анализа методом ПЦР или анализа последовательностей нуклеотидов используемых для видовой диагностики генов (секвенирования). В качестве таких последовательностей часто используют участки ядерных рибосомных генов и межгенных спейсеров (ITS). Для выделения чистых культур кусочек пораженной ткани из влажной камеры помещают под бинокулярный микроскоп и остро заточенной стерильной препаровальной иглой, предварительно охлажденной в агаризованной среде, снимают конидии гриба или отделяют кусочек гифы и помещают их в центр чашки Петри с агаризованной средой. Как правило, в среду предварительно добавляют антибиотик для предотвращения роста бактерий. В качестве питательной среды для роста грибов обычно используют картофельно-глюкозный агар, агар на основе пивного сусла, овсяный агар и др. После появления колонии гриба на питательной агаризованной среде с края колонии под бинокулярным микроскопом берут кусочек гифы и переносят на чистую чашку Петри с агаризованной средой. Если в чашке нет видимой контаминации, то пересев можно осуществлять без микроскопа; при этом обычно берут участок гифы вместе с агаризованной средой с края колонии. Некоторые виды грибов требуют особых селективных сред. Так, для Phythophthora infestans (Mont.) de Bary используется овсяная или гороховая агаризованные среды, для видов рода Alternaria картофельно-морковная агаризованная среда (Roberts, 2005). Многие виды фитопатогенов, такие как Botrytis cinerea, Cladosporium fulvum (=Passalora fulva), Colletotrichum acutatum выращиваются на картофельно-декстрозной агаризованной среде (Gonzalez et al., 2006; Mirzaei et al., 2008; Yan et al., 2008). Большинство фитопатогенных грибов способны к росту на среде сусло-агар (Martin, Cobos, 2007). Идентификация патогенов по морфолого-культуральным признакам является наиболее используемым методом и часто вызывает затруднения при определении видового состава патогенной микофлоры. Получаемые изоляты могут быть стерильны, а при их выделении высока вероятность контаминации вторичной микобиотой. Эти методы неэффективны в случае, если заболевание находится в начальной фазе развития или имеет место скрытое заражение семенного материала (латентная инфекция). Многие фитопатогенные виды не способны расти на питательной среде (например, возбудители ржавчины и многие виды головни), в связи с чем их невозможно культивировать в чистой культуре. Поэтому выделение и анализ чистых культур не в полной мере отражает видовой состав патогенной микобиоты пораженных органов, для их идентификации необходимо использовать молекулярные методы (см. ниже). Питательные среды Для получения чистых культур и поддержания их жизнеспособности применяют различные питательные среды. Эти среды разграничивают на твердые и жидкие с известным и неизвестным химическим составом, приготовленные на основе естественных или искусственных компонентов. Выбор того или иного типа питательного субстрата зависит от потребностей грибного организма и целей проводимого исследования. Специфические среды отбирают в процессе экспериментальных работ. Гриб высевают одновременно на разные среды в центре чашек Петри (в трех повторностях) и выдерживают при оптимальных для его развития температурах. Наблюдения проводят в течение 12-15 суток над ростом и развитием гриба (энергия роста, начало и характер спороношения, густота мицелия и т. п.), в результате выбирают наиболее подходящую среду. При использовании стандартных синтетических сред их состав можно изменять, добавляя и исключая различные химические компоненты. Часто возникает необходимость изыскивать среды, на которых бы гриб рос и развивался лучше, чем в природе. Этого можно достичь благодаря тому, что после стерилизации в среде уничтожаются конкурирующие микроорганизмы, а составные вещества ее претерпевают глубокие биохимические изменения, способствующие лучшему усвоению некоторыми грибами. Обычно это агаровые среды с отваром или настоями (вытяжками) из растения-хозяина или стеблей донника. Так, на 1 л воды берут 100 г свежих или 50 г высушенных органов питающих гриб растений. Массу измельчают, кипятят один час, восстанавливают первоначальный объем жидкости, фильтруют, после чего добавляют 2-2,5% агар-агара, растворяют его и стерилизуют (Хохряков, 1966). Для определенных систематических групп патогенных грибов многими исследователями были подобраны естественные питательные субстраты и определены среды с известным химическим составом. Так, опытным путем установлено, что виды рода Fusarium хорошо произрастают на отварных зернах риса. Составы твердых питательных сред для отдельных видов и групп грибов приведены в таблице 1. Таблица 1 – Состав питательных сред для выращивания фитопатогенных грибов
Приготавливая среды, надо иметь в виду следующие обстоятельства:
В ряде случаев (при изучении токсических выделений патогенов, ферментов, наращивании мицелия для выделения ДНК и т.д.) употребляют жидкие питательные среды. Для проведения различных исследований по биологии грибов и устойчивости растений возникает необходимость длительного хранения чистых культур. Широко распространенным способом поддержания чистых культур грибов служат периодические пересевы их на свежие питательные среды. Большинство культур пересевают 2-3 раза в год. При пересевах переносят главным образом споры, а у неспорообразующих форм — мицелий из краевой зоны колонии. Пересевы делают в двух повторениях, а на хранение оставляют 3 экземпляра каждой грибной культуры, считая и пересев предыдущего срока. Один из новых пересевов используют только для будущего пересева, другой — для отсева при проведении экспериментальных работ. Для длительного хранения грибов лучше использовать бедные сахарами крахмальные и целлюлозные среды. Однако после хранения на питательной среде при пониженной температуре большинство патогенных грибов изменяют морфологические и культуральные признаки, а также утрачивают патогенные свойства. Поэтому перед проведением опытов с грибами, взятыми после длительного хранения в чистой культуре, необходимо восстановить их патогенность, проводя пассажи через растение-хозяина. Глубокое охлаждение до –75°С удовлетворительно сохраняет жизнеспособность грибов весьма продолжительный период, однако не следует забывать помещать предназначенные для хранения мицелий и споры в 15% глицерин. Аналогично можно хранить изоляты грибов в жидком азоте. Хорошие результаты показывает также хранение лиофильно высушенного мицелия и спор (высушивание вымораживанием при пониженном давлении). Однако использование этих методов требует громоздкой и дорогой аппаратуры. Все культуры должны быть пронумерованы и зарегистрированы в каталоге. Записывают номер и название культуры, где и откуда она выделена, вид и сорт растения-хозяина, дату и способ выделения, название сред, примененных при пересевах, результаты анализа культурально-морфологических и молекулярных свойств. |
Похожие:
 |
Удаление или уничтожение возбудителей инфекционных (паразитарных)... Дезинфекция удаление или уничтожение возбудителей инфекционных (паразитарных) болезней в (на) объектах окружающей среды. Производится... |
 |
Унифицированный клинический протокол оказания медицинской помощи при инфекционном эндокардите Эти рубрики не используются при первичном кодировании заболевания. Они предназначены для использования в качестве дополнительных... |
|
Донецкой Народной Республики 02. 03. 2017 №285 унифицированный клинический... Эти рубрики не используются при первичном кодировании заболевания. Они предназначены для использования в качестве дополнительных... |
|
Сибирского отделения российской академии наук Название коллекции «Коллекция экстремофильных микроорганизмов и типовых культур» |
|
01. 11 Выращивание зерновых, технических и прочих Выращивание картофеля, столовых корнеплодных и клубнеплодных культур с высоким содержанием крахмала или инулина |
|
Отдел образования муниципального района илишевский район Основной вид лпх приусадебное хозяйство многопрофильного характера с посевами картофеля и овощных культур, плодовыми деревьями и... |
|
Инструкция по дезинфекции Общие положения Основное назначение дезинфекции, дезакаризации, дезинсекции и дератизации на пасеках обезвредить возбудителей и переносчиков заразных... |
|
Временная инструкция о мероприятиях по предупреждению и ликвидации болезней прудовых рыб С целью предупреждения инфекционных и инвазионных болезней рыб в прудовых и других рыбоводных хозяйствах рекомендуется |
|
Установка сетевой версии системы "kadastr" Создайте на жестком диске каталог kadastr (или каталог с другим названием), в котором будут размещены Ваши базы данных и скопируйте... |
|
Подготовка картофеля к посадке Не стоит использовать на посадку смесь сортов картофеля. Из-за неодинаковых сроков созревания они требуют разных сроков посадки и... |
|
Российской федерации фгу «Владимирская государственная зональная... Предназначена для рядковой посадки не пророщенных клубней картофеля с междурядьями 70; 75 и 90см с одновременным внесением минеральных... |
|
Оао «чувашторгтехника» Электрическая фритюрница кухонная ... |
|
2. назначение дезинфекции и подготовка к ее проведению Под дезинфекцией понимают уничтожение на объектах внешней среды или удаление патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Под... |
|
На поставку товара: Реагенты для генодиагностики возбудителей Реагенты для генодиагностики возбудителей инфекционных заболеваний г. Екатеринбург «24» апреля 2013 года |
|
Исследование продовольственного картофеля нашего поселения «Непецинское» Века. Его по праву называют вторым хлебом. Клубни картофеля, в зависимости от его назначения, содержат до 25 сухого вещества, в том... |
|
Инструкция по охране труда для работ на электромеханической картофелечистке... Для обработки овощей и картофеля необходимо предусматривать максимальную механизацию труда. Важнейшая операция при его обработке... |