Влияние микробных и немикробных факторов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови

Скачать 317.23 Kb.

Название	Влияние микробных и немикробных факторов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови
страница	1/2
Тип	Автореферат

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Автореферат

1 2

На правах рукописи

Рыжкова

Анна Ивановна

влияние микробных и немикробных факторов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Челябинск – 2010

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ,

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Долгушин Илья Ильич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Базарный Владимир Викторович

профессор
доктор медицинских наук, Бурмистрова Александра Леонидовна

профессор

Ведущая организация: Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург

Защита состоится «_29_»_июня_____2010г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03. при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, д. 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «___» _______________20__ г.
Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Л.Ф. Телешева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Более века исследователи всего мира с интересом изучают строение, физиологию нейтрофилов, биохимический состав их гранул, структуры синтезируемых ими метаболитов и роль этих клеток в регуляции иммунного и других звеньев гомеостаза [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1995; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007; Virchow R., 1897; Lehrer R.I. еt аl., 1988; Pabst M.J., 1994; Smolen J.E., 1995].

В 1908 году русский ученый И.И. Мечников получил Нобелевскую премию за открытие центральной роли фагоцитирующих клеток в неспецифической защите организма и указал на их бактерицидные свойства и способность продуцировать «секретины» [Мечников И.И., 1947].

Нейтрофилы обладают способностью захватывать бактерии и другие частицы с помощью специфических рецепторов или без их участия, убивать захваченные микроорганизмы с использованием кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов и переваривать захваченные объекты фагоцитоза [Фрейдлин И.С., 1998]. До недавнего времени нейтрофилы рассматривались как исключительно неспецифические эффекторные клетки врожденного иммунитета, не имеющие возможность четко направлять комплекс иммунных реакций. Наиболее вероятным исходом дифференцированных нейтрофилов считался апоптоз после фагоцитоза инфекционных объектов или некроз, обусловленный, например, бактериальными токсинами.

В последнее время знание об иммунологическом репертуаре нейтрофилов значительно расширилось. Были обоснованы представления о важной роли бактерицидных продуктов, выделяемых этими клетками наружу, в противомикробной защите [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001]. Brinkmann V. и соавторы в 2004 году сообщили, что нейтрофилы выбрасывают во внеклеточное пространство свой хроматин, формируя нейтрофильные внеклеточные ловушки (Neutrophil Extracellular Traps, NETs, НВЛ), состоящие из нуклеиновых кислот, гранулированных пептидов и антимикробных молекул, с ранее неизвестной целью – для изоляции и уничтожения Грам-положительных, Грам-отрицательных бактерий и грибов [Долгушин И.И., Андреева Ю.С., 2009; Brinkmann V., Reichard U., et al., 2004]. Эта кислородзависимая клеточная гибель была названа термином «NETosis» [Steinberg B.E., Grinstein S., 2007]. Позднее подобное явление было обнаружено у тучных клеток и эозинофилов [Von Kockritz-Blickwede M. еt аl., 2008]. Формирование нейтрофилами внеклеточных ловушек – важный механизм врожденного иммунного ответа, когда, погибая, нейтрофил защищает организм от инфекционных патогенов [Fuchs T.A. еt аl., 2007; Wartha F., Henriques-Normark B., 2008].

Однако до сих пор четких представлений о формировании нейтрофилами внеклеточных ловушек нет.
Цель исследования
Оценить влияние представителей нормальной и условно патогенной микрофлоры слизистых оболочек гениталий и кишечника человека (Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans) и иммуномодуляторов различной природы (пирогенал, солкотриховак, циклоферон, интерферон), а также гуморальных факторов (комплемент и специфические Ig) на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови.
Задачи исследования

Определить влияние Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus spp., E. coli, S. aureus и C. albicans на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами в цельной гепаринизированной крови, в лейкоцитарной взвеси и нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина.
Оценить роль плазмы, сыворотки крови и их компонентов (комплемента и специфических Ig) в секреции внеклеточной ДНК нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина, в системе in vitro.
Изучить воздействие пирогенала, солкотриховака, циклоферона и интерферона на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина.

Научная новизна
Впервые было проведено исследование образования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, нейтрофилами цельной гепаринизированной крови, лейкоцитарной взвеси. При этом использовались различные методы обнаружения внеклеточно расположенной нейтрофильной ДНК: фиксированные мазки цельной крови, окрашенные по Романовскому-Гимзе, оценивались при световой иммерсионной микроскопии; фиксированные препараты выделенных нейтрофилов окрашивались раствором акридинового оранжевого или Sytox green и подвергались люминесцентной микроскопии; образцы, содержащие выделенные нейтрофилы и сыворотку или плазму крови, исследовались в нативном состоянии при люминесцентной микроскопии и окраске акридиновым оранжевым. Все эти методы позволили произвести количественную оценку НВЛ по отношению к другим морфологическим формам нейтрофилов (с сегментированным и с недифференцированным ядром).

На основании количественной оценки установлен дозозависимый эффект влияния различных видов микроорганизмов и биологически активных веществ на образование НВЛ. Представители нормальной и условно-патогенной микрофлоры слизистых оболочек гениталий и кишечника человека стимулируют образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина, но не оказывают влияния на нейтрофилы цельной гепаринизированной крови, лейкоцитарной взвеси и нейтрофилы в присутствии сыворотки или плазмы крови, независимо от концентрации микроорганизмов. При сравнительном анализе установлено, что наиболее выраженный стимулирующий эффект на формирование НВЛ оказывают Candida albicans и Lactobacillus spp.

Сыворотка и плазма крови, независимо от присутствия в них специфических иммуноглобулинов и комплемента, оказывают ингибирующее действие на внеклеточный выброс ДНК нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина.

Иммуностимуляторы различной природы (пирогенал, солкотриховак, интерферон и циклоферон) оказывают активирующее влияние на секрецию хроматина нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. Однако различные дозы иммуностимуляторов по-разному влияют на формирование НВЛ. Интерферон в высоких концентрациях ингибирует образование нейтрофильных внеклеточных ловушек. Пирогенал, солкотриховак и циклоферон активнее стимулируют внеклеточный выброс нейтрофильной ДНК в концентрациях, эквивалентных средней терапевтической дозе для каждого конкретного препарата.

На основании проведенного исследования был разработан метод оценки эффективности вакцины «Солкотриховак» [приоритетная справка «Способ оценки эффективности вакцин, участвующих в формировании мукозального иммунитета» № 2009102575 (003293) от 26.01.2009].
Теоретическая и практическая значимость работы
Проведенные исследования позволяют расширить представление о роли нейтрофилов в антимикробной защите организма, в частности их способности к образованию внеклеточных ДНК-овых сетей.

Полученные результаты дают возможность оценить дозозависимый эффект и селективность секреции хроматина во внеклеточное пространство нейтрофильными гранулоцитами в ответ на стимуляцию факторами микробной и немикробной природы и обосновывают возможность использования метода определения НВЛ для оценки иммунотропной активности различных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту

Под действием представителей нормальной и условно-патогенной микрофлоры активируется секреция хроматина во внеклеточное пространство нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина.
Иммуномодуляторы оказывают стимулирующий дозозависимый эффект на образование нейтрофилами внеклеточных ловушек, при этом максимальное влияние оказывает средняя терапевтическая доза препаратов.
Сыворотка и плазма крови блокируют выброс нитей ДНК нейтрофилами во внеклеточное пространство. Участия специфических IgG в данном процессе не выявлено. Аутологичный комплемент в присутствии сыворотки и плазмы крови не оказывает влияния на формирование НВЛ, однако комплемент морской свинки дозозависимо стимулирует секрецию ДНК нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, этот эффект снижается после термической денатурации комплемента.

Внедрение результатов исследования
Результаты исследований внедрены в лабораторную диагностику НИИ иммунологии и в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на XΙΙ – XΙΙΙ Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге: Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунокоррекции» (г. Санкт-Петербург, 2008, 2009), VΙ Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург 2009), VΙΙ итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них в ведущих рецензируемых научных изданиях и журналах, рекомендованных ВАК – 10.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего работы 91 отечественных и 128 иностранных авторов. Диссертация изложена на 143 страницах, включает 32 таблицы и 8 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Нами было обследовано 102 условно здоровые женщины в возрасте 18 – 35 лет в первой фазе менструального цикла.

В качестве объекта изучения были выбраны нейтрофилы цельной гепаринизированной крови, лейкоцитарной взвеси, полученной после седиментации эритроцитов, и нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. Исследовалась их способность к образованию НВЛ под влиянием факторов микробной и немикробной природы.

Для выделения нейтрофилов 2 мл гепаринизированной крови (10 ЕД гепарина («Гедеон-Рихтер», Hyngery) на 10 мл крови) смешивали с 3 мл стерильного физиологического раствора, полученную смесь наслаивали на градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden; Spofa, CSSR). Плотность верхнего слоя – 1,075-1,077, нижнего – 1,093-1,095 [Wong L., 1975], объем каждого слоя – 2 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе градиентов образовывалось кольцо гранулоцитов с чистотой 98 – 100%, мононуклеары составляли 2% или отсутствовали. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирали, переносили в стерильную пробирку. Клетки трижды отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором центрифугированием при 1500 об/мин 10 минут, доводили до концентрации 5х10⁶ клеток/мл и использовали в исследованиях.

Для оценки влияния микроорганизмов на формирование НВЛ использовали различные концентрации трехкратно отмытой от питательной среды взвеси суточной культуры контрольных штаммов S. aureus («Cowan 209»), Е. coli (штамм М-17), Lactobacillus spp. (препарат "Лактобактерин сухой", фирма "ИмБио", г.Нижний Новгород), Bifidobacterium spp. (препарат "Бифидумбактерин сухой", ЗАО "Экополис", г.Ковров), С. albicans (штамм 601) и смеси этих бактерий. По стандарту мутности БАК — 10 (ООО "Ормет", г. Екатеринбург) получали концентрацию 1 млрд. микробных клеток в 1мл (1х10⁹/мл) [Иммунологические методы…, 1981], затем разводили в 10 и в 100 раз. Таким образом были получены концентрации бактерий 1х10⁹/мл, 1х10⁸/мл и 1х10⁷/мл. 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина и доведенных до концентрации 5х10⁶ клеток/мл, 1 мл цельной гепаринизированной крови или 1 мл лейкоцитарной взвеси инкубировали при температуре +37⁰С в течение 30 минут в присутствии 0,1 мл взвеси микроорганизмов доведенных до различных концентраций. Для контроля использовали 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина и доведенных до концентрации 5х10⁶ клеток/мл, 1 мл цельной гепаринизированной крови или 1 мл лейкоцитарной взвеси, инкубированных в тех же условиях, но без активаторов.

Для изучения влияния гуморальных факторов сыворотку или плазму крови, полученных из гепаринизированной и негепаринизированной аутологичной крови, помещенной в термостат с температурой 37⁰С на 30 – 60 минут [Мирахмедов У.М., Резникова Л.С., 1975], и взвесь нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, инкубировали в присутствии C. albicans (штамм 601) при 37⁰С в течение 30 минут. Для контроля инкубировали в тех же условиях взвесь нейтрофилов без активаторов, взвесь нейтрофилов в присутствии сыворотки или плазмы и взвесь нейтрофилов в присутствии C. albicans (штамм 601).

Для инактивации естественного комплемента исследуемую сыворотку крови прогревали на водяной бане при 56^оС в течение 30 минут [Мирахмедов У.М., Резникова Л.С., 1975]. Этим же методом инактивировали комплемент в плазме крови. Для сравнения использовали сухой комплемент (ФГУП «НПО „Микроген“», г.Пермь). Дозу препарата подбирали, учитывая нормальные значения активности комплемента в организме человека, в перерасчете на 1 мл клеточной взвеси. Таким образом, комплемент морской свинки тестировали в концентрациях: 400 гемолитических единиц/мл, 40 ЕД/мл (соответствует нормальному уровню активности комплемента), 4 ЕД/мл, 0,4 ЕД/мл и 0,04 ЕД/мл.

В ряде опытов для оценки влияния специфических иммуноглобулинов сыворотки и плазмы крови, участвовали лица с подтвержденным повышенным содержанием антител класса IgG к С. albicans, которое устанавливалось с помощью иммуноферментного анализа (Кандида-IgG-ИФА-БЕСТ, г.Новосибирск-117). К осадку С. albicans (штамм 601) (1х10⁹ клеток/мл) добавляли 0,5 мл свежей сыворотки крови, инкубировали в режиме, исключающем активацию комплемента, при +4°С в течение 30 минут, встряхивая каждые 5 минут [Маянский А.Н. и др., 1982]. Затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут и использовали в опытах как истощенную по специфическим иммуноглобулинам сыворотку, так и опсонизированную специфическими IgG С. albicans (штамм 601). Плазму крови истощали по специфическим иммуноглобулинам так же.

Для оценки влияния различных иммуностимуляторов на формирование НВЛ in vitro, нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, инкубировали 30 минут при 37⁰С в присутствии различных концентраций тестируемых препаратов. Для контроля гранулоциты инкубировали в тех же условиях, но без активатора.

Интерферон человеческий лейкоцитарный (интерферон альфа) (ФГУП «НПО „Микроген“», г.Пермь) – препарат для местного применения на слизистые оболочки полости носа и рта, поэтому было невозможно точно произвести перерасчет средней терапевтической дозы на 1 мл клеточной взвеси. Исходя из этого, препарат тестировался в широком диапазоне концентраций: 500 МЕ на 1 мл взвеси нейтрофилов, 50 МЕ/мл, 5 МЕ/мл, 0,5 МЕ/мл, 0,05 МЕ/мл, 0,005 МЕ/мл и 0,0005 МЕ/мл.

Выбранные нами иммуномодуляторы – «Циклоферон» (ООО «НТФФ „ПОЛИСАН“», г.Санкт-Петербург), «Пирогенал» (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи / Медгамал, Россия) и «Солкотриховак» (SOLCO BASEL AG, Швейцария), – имеют точную, описанную в инструкции по применению, дозировку для парентерального применения, поэтому тестируемые концентрации подбирались в соответствии со средней терапевтической дозой для конкретного препарата, в перерасчете на 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина.

Для циклоферона была определена концентрация, соответствующая средней терапевтической дозе, – 0,5 мкг/мл, в 10 раз меньше – 0,05 мкг/мл, а также в 10 и в 100 раз больше – 5 мкг/мл и 50 мкг/мл, соответственно.

Вакцину «Солкотриховак» использовали в концентрациях 0,002 мкл/мл, 0,02 мкл/мл (эквивалент средней терапевтической дозы), 0,2 мкл/мл и 2 мкл/мл.

Действие пирогенала исследовали в концентрациях: 0,002 мкг/мл, 0,02 мкг/мл (соответствует разовой терапевтической дозе), 0,2 мкг/мл и 2 мкг/мл.

Клеточную взвесь после инкубации, в зависимости от активирующего агента, исследовали различными способами.

Нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, активированные микроорганизмами или иммуномодуляторами (интерферон-α, пирогенал и солкотриховак), наносили на обезжиренное предметное стекло, высушивали и фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали 0,04% раствором акридинового оранжевого. Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм. При этом способе окраски мы оценивали процентное содержание нейтрофилов с сегментированными ядрами, с недифференцированными ядрами и нейтрофильных внеклеточных ловушек; активность фагоцитоза, фагоцитарное число; эффективность нейтрофильных внеклеточных ловушек и индекс нейтрофильной внеклеточной ловушки [Долгушин И.И., Андреева Ю.С., патент РФ на изобретение № 2384844].

Нейтрофилы, активированные препаратом «Циклоферон», также наносили на предметное стекло, высушивали, фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали 0,002% раствором Sytox green. Учет проводили также, как при окраске акридиновым оранжевым.

Препараты лейкоцитарной взвеси и нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, инкубированных в присутствии сыворотки или плазмы крови, оценивали в нативном виде при окраске акридиновым оранжевым. Учет проводили в люминесцентном микроскопе с процентным количеством нейтрофилов с сегментированным и недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек.

Из цельной крови готовили мазки, высушивали, фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали по методу Романовского-Гимзе. Учет проводили при иммерсионной световой микроскопии х100х10х2, оценивали процентное содержание нейтрофилов с сегментированным ядром, с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек.

Полученные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке на ПК под управлением операционной системы Windows ХР с использованием пакета статистических программ «Statistica for Windows 6.0» с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М ± m), n – количество наблюдений в выборке. Различия между сравниваемыми группами считали достоверными при р ≤ 0,05, по непараметрическим критериям Mann-Whitney, Wald-Wolfowitz [Гублер Е.В., 1973; Гланц С., 1999; Боровиков В.П., 2003]. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони [Гланц С., 1999]. Представленные цифровые данные были округлены до второго десятичного знака.

1 2

	Исследование клеточных элементов в периферической крови является одним из Стандартизованная технология «Исследование клеточного состава крови с применением гематологических анализаторов»		Программа государственного междисциплинарного экзамена профессиональная... Факторы внешней среды и их влияние на организацию. Влияние общеполитических факторов и государственной политики на деятельность фирмы....
	Влияние транексамовой кислоты на смертность, тромбоэмболические осложнения... Имеются вводные данные, что транексамовая кислота может снижать кровопотерю у пациентов, подвергнувшихся избирательной операции....		Курсовая работа по технологии лекарств тема: «Производство мазей... «Производство мазей Влияние фармацевтических факторов на биофармацевтические характеристики мазей»
	Диссертация на тему: «Влияние кросс-культурных факторов на содержание... «Влияние кросс-культурных факторов на содержание стандартов и практик учр в гостинице Novotel MoscowCentre»		1. Влияние природно-климатического, геополитического и религиозного... Влияние природно-климатического, геополитического и религиозного факторов на российский исторический процесс
	Особенности учета донорской крови и расчетов с донорами в отделениях... Многие больницы имеют в своем составе отделения переливания крови. Существуют также специализированные станции переливания крови		Особенности учета донорской крови и расчетов с донорами в отделениях... Многие больницы имеют в своем составе отделения переливания крови. Существуют также специализированные станции переливания крови
	Инструкция по заготовке и консервированию донорской крови (в ред... Заготовка крови от доноров осуществляется с учетом необходимости удовлетворения потребности лечебно-профилактических учреждений здравоохранения...		Инструкция по применению компонентов крови общие положения Переливанием... ...
	Инструкция по применению компонентов крови общие положения Переливанием... В целях совершенствования медицинской помощи населению Российской Федерации и обеспечения качества при применении компонентов крови...		Инструкция по применению компонентов крови общие положения Переливанием... В целях совершенствования медицинской помощи населению Российской Федерации и обеспечения качества при применении компонентов крови...
	Инструкция по применению компонентов крови общие положения Переливанием... В целях совершенствования медицинской помощи населению Российской Федерации и обеспечения качества при применении компонентов крови...		Влияние полиморфизмов генов Системы биотрансформации ксенобиотиков на формирование врожденных пороков развития плода у женщин
	Ii. Влияние экологических факторов среды обитания на здоровье населения О состоянии окружающей среды и природопользовании в Ставропольском крае в 2008 году		Крови в учреждениях службы крови рсфср В 1988-1989 гг в службе крови рсфср зарегистрировано 3 случая осложнений после крово- и плазмодачи, закончившихся летально

Влияние микробных и немикробных факторов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови

На правах рукописи

Похожие: