Цкп «Генетический полиморфизм» обн ран
|
Скачать 386.13 Kb.
|
|
2 Материалы и методы 2.1 Образцы для исследования Образцы для исследования были любезно предоставлены А. Субботиным и П. Сорокиным (Институт проблем экологии и эволюции им. Северцова, Москва). В нашем распоряжении оказались образцы фекалий четырех тигров: ♀Барышня–Амурский тигр, г. Волгоград. г.р. 2007, собрано 17.12.2013; ♀Матрена–Амурский тигр, г. Волгоград. г.р. 2002, собрано 17.12.2013; ♂Зевс–Амурский тигр, г. Волгоград. г.р. 2002, собрано 17.12.2013; ♀Принцесса–Амурский тигр, Московский зоопарк, г.р. 2002. Также, П. Сорокиным нам были любезно предоставлены образцы мышечной ткани двух самцов, убитых браконьерами на Амуре и 5 образцов ДНК разных амурских тигров (самцов и самок), выделенной из тигриных фекалий в лаборатории Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова, и в дальнейшем использованной в проверке тест-системы. Российской академии наук (ИПЭЭ РАН). 2.2 Очистка ДНК из различного биологического материала тигра Был использован коммерческий набор реагентов компании ДНК-Технология «Проба-ГС». В этом наборе для связывания ДНК используется силикатный сорбент. В пробирку вносят образец биологического материала, к нему добавляют лизирующий раствор и силикатный сорбент. Затем, путем нагревания, центрифугирования, использования промывочных и элюирующего раствора, получают очищенный препарат ДНК. Инструкция по очистке ДНК, применяющаяся в комплекте «Проба-ГС»: Примечание. В лизирующем растворе и в промывочном растворе №1 допускается выпадение осадка, перед началом работы его необходимо растворить нагреванием флакона при 50 °С в течение 15–20 мин.
Надосадочная жидкость, содержащая выделенную ДНК, готова к внесению в реакционную смесь для ПЦР–амплификации. Полученный препарат ДНК можно хранить до 7 суток при температуре 2–8°С или до года при минус 20°С 2.3 Проведение ПЦР-реакции Состав ПЦР-реакции:
Объем реакционной смеси в нашем случае составлял 35 мкл. Табл.1 Порядок и объем внесения реагентов в пробирку для «обычной» ПЦР
Табл.2 Порядок и объем внесения реагентов в пробирку для ПЦР в «реальном времени»
После внесения реакционной смеси в пробирки, мы добавляли в каждую по капле минерального масла, а затем центрифугировали при 13,4 тыс. обор./мин. После этого мы ставили пробирки в прибор (ДТ-322, ДНК-Технология) и запускали соответствующую программу, давали пройти 50 циклов и затем либо анализировали график, если это была ПЦР «в реальном времени», либо делали электрофорез, если это была обычная ПЦР. Программа ПЦР-амплификации Рабочий объем смеси – 35мкл. 9  4,0°C – 10 сек64,0°C – 20 сек (считывание флуоресценции) x 50 циклов 68,0°C – 10 сек 2.4 Электрофорез в агарозном геле Этот метод основан на том, что ДНК, являясь сильно полярной молекулой, в электрическом поле будет двигаться в геле от анода к катоду. Метод позволяет посмотреть прошла ли ПЦР, проверить правильность подобранных праймеров. Для начала делают агарозный гель. На 1 гр агарозы мы брали 5 мкл бромистого этидия, 100 мл буферного раствора TAE x 1, затем все это смешивают и доводят до кипения, дают немного остыть , после чего заливают в форму, в которой стояли гребенки (для лунок в геле). После 20 мин ожидания гель можно класть в камеру для электрофореза, в которой налит TAE x 1. Важно, чтобы буфер полностью закрывал гель. Далее ДНК после ПЦР разносят по лункам, смешивая методом пепетирования с краской, также наносим маркер (Geneladder 50). После заполнения нужных лунок, мы включаем источник постоянного тока (важно, чтобы прибор стабилизировался на напряжении), по прошествии 20-30 мин фиксируем результат. Фотофиксация результата происходит при помощи фотосистемы под действием ультрафиолета на гель. 2.5 Использованное программное обеспечение и программы 1. Для поиска праймеров использовали программу BLAST; 2. Для подборки последовательности олигонуклеотидов использовали Oligo 6.0 3. Для проведения ПЦР использовали программное обеспечение для ПЦР-амплификатора ДТ-322. 2.6 Материалы Если не указано отдельно, использованы химические реагенты производства Sigma-Aldrich (Германия). Синтез олигонуклеотидов выполнен компанией ДНК-Технология. 3. Результаты и их обсуждение 3.1 Разработка тест-системы для определения пола тигра 3.1.1 Отработка методов очистки ДНК из мышечной ткани и фекалий тигра Для определения оптимального объема образца для получения достаточного количества ДНК наилучшего качества, был проведён эксперимент по оценке качества экстракции ДНК из разного количества фекалий тигра. Оценка качества и количества очищенной ДНК из фекалий. В экстракцию были взяты четыре разных количества фекалий: 5мкл, 25мкл, 125мкл, 300 мкл, от одного тигра (Амурский тигр Барышня, собрано 17.12.13) и проведено выделение ДНК при помощи набора реагентов «Проба-ГС» как описано в разделе «Материалы и методы». Для каждого полученного таким образом препарата ДНК была проведена ПЦР «в реальном времени» с праймерами и зондами на Х и Y-хромосомы тигра (описание тест-системы см. ниже). Также были поставлены 2 контрольных образца: К+ – образец ДНК из мышечной ткани самца (всегда хорошо амплифицируется) и К-, где вместо ДНК была внесена вода MQ. Результаты эксперимента представлены на рисунке 8.  Рисунок 8. Протокол ПЦР реакции при оценке выделения ДНК. Подписаны пробирки с удавшейся ПЦР. Как видно из протокола (рис.8), результат амплификации присутствует лишь в образце, полученном из 25 мкл фекалий. Отсутствие продукта ПЦР в образце из 5 мкл фекалий можно объяснить недостаточным количеством получаемой ДНК, а отсутствие продукта в образцах из 125 мкл и 300 мкл – слишком низкой степенью очистки нуклеиновых кислот и, как следствие, ингибированием ПЦР. Срабатывание системы Y1 на образце ДНК самки можно объяснить неспецифичной работой тест-системы (скорее всего амплифицируется гомологичный Y-хромосоме фрагмент Х-хромосомы). По полученным кривым можно примерно оценить количество ДНК в образце после экстракции. Исходя из Ср около 28-29 (для лучше сработавшей системы Х1) и принимая, что ПЦР с одной молекулы как правило даёт Ср около 40-42, можно оценить количество молекул, попавших в ПЦР как 1000. С учётом того, что в реакцию брали 1/50 объема полученного препарата ДНК, общее количество молекул в образце после экстракции можно оценить как 5х104. Отдельно следует указать на проблему гетерогенности фекалий по содержанию ДНК. Этот вопрос достаточно хорошо проработан для образцов биологического материала человека (но можно предполагать, что ситуация аналогична и для фекалий тигра). Как известно из литературы, фекалии человека гетерогенны по содержанию ДНК, то есть ДНК человека распределена в структуре исходного биологического материала крайне неравномерно. Поэтому для получения воспроизводимых данных по количеству нуклеиновых кислот рекомендуется проводить гомогенизацию значительного (несколько миллилитров) препарата фекалий, после чего производят экстракцию ДНК из небольшого объема. Поскольку в нашем исследовании задача стабильного получения и оценки количества ДНК тигра из фекалий не ставилась, мы не прибегали к предварительной гомогенизации образца. 3.1.2 Подбор праймеров для специфичной наработки фрагментов Х и Y хромосом тигра На момент начала исследования в базе данных присутствовал геном амурского тигра [30], но без указания хромосомной принадлежности последовательностей. Поэтому для обнаружения Х и Y- специфичных регионов нами было проведено сравнение генома тигра с геномом домашней кошки (для которой были данные по хромосомной принадлежности последовательностей). В результате были выбраны несколько регионов генома тигра, гомологичных Х или Y-хромосомам кошки. Подбор праймеров осуществляли в программе Oligo 6.0, с учетом следующих требований:
Таблица 3. Подобранные последовательности праймеров.
3.1.3. Проверка специфичности срабатывания праймеров на образцах ДНК самок и самцов тигра Сперва были подобраны 4 системы праймеров: две на Х и две на Y хромосому тигра соответственно. По результатам проверки специфичности срабатывания тест-систем оказалось, что тест-системы на Y-хромосому не специфичны (рис.9, рис.10, рис.11), т.е. срабатывают на самках и самцах одинаково. В этой связи нами были подобраны дополнительно две тест-системы на Y хромосому (названия систем Y3 и Y4), последняя из которых показала специфичное срабатывание (рис.11). При постановке систем на Х хромосому, обе системы срабатывали, однако эффективность и специфичность праймеров Х1 была несколько выше, чем Х2 (рис.9, рис. 12).  Рисунок 9. Электрофореграмма результатов ПЦР с двумя образцами ДНК (M2 и M4-самцы) из мышечной ткани со всеми тест-системами (X1, X2, Y1, Y2, Y3, Y4). M50 – маркер длин, цифрами подписаны длины фрагментов в парах нуклеотидов.  Рисунок 10. Электрофореграмма результатов ПЦР с четырьмя образцами ДНК: Барышня (♀), Матрена (♀), Зевс (♂), М4 (♂) – образцы ДНК из фекалий, М4 – ДНК из мышечной ткани. Использовали 3 тест-системы: Х1, Y3, Y4. M50 – маркер длин, цифрами подписаны длины фрагментов в парах нуклеотидов.  Рисунок 11. Электрофореграмма результатов ПЦР с тремя парами праймеров (Х1, Y3, Y4) и четырьмя образцами ДНК (М1-♂, 001 -♀, Tg2–♀, 001m–♀). M50 – маркер длин, цифрами подписаны длины фрагментов в парах нуклеотидов.  Рисунок 12. Электрофореграмма результатов ПЦР с тест-системой Х1 и 14-ю образцами ДНК (001–♀, 002–♀, 003–♂, 004–♀, М1–♂, М2–♂, М3–♂, М4–♂, Tg1–♀, Tg2–♀, Tg3–♂, Tg4–♀, 001m–♀, 001mn–♀). M50 – маркер длин, цифрами подписаны длины фрагментов в парах нуклеотидов. |
Похожие:
 |
О научно-образовательном центре коллективного пользования фгбун имби «Спектрометрия и хроматография» (далее – цкп) федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт морских биологических... |
|
История россии Ран а. Н. Сахаров (отв редактор). докт ист наук В. П. Дмитренко (зам отв редактора), академик ран и. Д. Ковальченко, член-корр ран... |
 |
Российская академия наук институт социально-экономического развития территорий ран Исэрт ран (ранее внкц цэми ран) продолжает знакомить своих подписчиков с наиболее интересными, на наш взгляд, публикациями, затрагивающими... |
|
Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые... |
|
Сравнительный эколого-генетический анализ микроспоридий и их хозяина... Сравнительный эколого-генетический анализ микроспоридий и их хозяина – байкальской амфиподы gmelinoides fasciatus |
|
Краткая инструкция пользователя асу рид ран (ученого секретаря) Введение Данная инструкция адресована сотрудникам научных организаций ран, осуществляющим сбор данных по оценке результативности деятельности... |
|
О проведении открытого аукциона в электронной форме Наименование государственного заказчика: Учреждение Российской академии наук Институт неорганической химии им. А. В. Николаева Сибирского... |
|
О проведении запроса котировок цен на право заключения государственного контракта Государственный заказчик: Учреждение Российской академии наук Институт неорганической химии им. А. В. Николаева Сибирского отделения... |
|
Извещение о проведении запроса котировок (запрос котировок) Государственный заказчик: Учреждение Российской Академии Наук Больница Пущинского научного центра ран (сокращенное бпнц ран) |
|
Техническое задание Общие требования Учреждение Российской академии наук Ордена Ленина и Ордена Октябрьской революции Институт геохимии и аналитической химии им. В. И.... |
|
Протокол заседания оус Цкп аналитическим оборудованием, оснащенных новейшими прецизионными высокопроизводительными приборами |
|
Указатель литературы обменных фондов библиотек 2 2013 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственная публичная научно-техническая библиотека Сибирского отделения... |
|
Список научных публикаций сотрудников юнц ран Венков А. В. Антироссийское антисоветское движение (1917-1918 гг.) на Украине в годы Гражданской войны. Ростов-на-Дону: Изд-во юнц... |
|
Молекулярно- генетический профиль дофаминовой нейромедиаторной системы... Работа выполнена в фгбу «Национальный научный центр наркологии» Миндзрава России |
|
Конкурс 2015 года По Программам ран программа фундаментальных исследований Президиума ран №1 Программа включает в себя три Подпрограммы (I – III). Подпрограмма I «Физика и технология наноструктур, наноэлектроника и диагностика»... |
|
Инструкция по оформлению текстов докладов для опубликования в сборнике... Объединенный институт высоких температур ран, 111116, Москва, Красноказарменная, 17а |