Цкп «Генетический полиморфизм» обн ран
|
Скачать 386.13 Kb.
|
1.2 Методы геномной идентификация особей живых существ Методы геномной идентификации применяются в различных научных исследованиях и используются в практике многих государственных структур, в том числе и правоохранительных органов. Например, в криминалистике используется совокупность методов геномной идентификации, для того чтобы установить личность человека, причастного к тому или иному правонарушению (используют обнаруженные биологические образцы). Ниже рассмотрены технологические особенности существующих методов геномной идентификации. 1.2.1 Анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ-анализ). Одним из первых методов генетического анализа, использовавшихся для идентификации отдельных организмов внутри вида, был метод ПДРФ-анализа. Суть метода заключается в том, что полученную геномную ДНК разрезают при помощи ферментов (эндонуклеаз рестрикции), затем при помощи гель-электрофореза выполняют разделение фрагментов с проявкой положения фрагментов в геле мечением изотопами (рис. 4). Эти ранние методы были вытеснены методами ПЦР-анализа. [22]  Рисунок 4. Пример ПДРФ-анализа. 1, 2, 3, 4– используемые образцы ДНК. [23] 1.2.2 ПЦР-анализ С изобретением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК-идентификация сделала огромный шаг вперёд как в отношении дифференциации, так и в возможности восстановления информации по очень малым образцам. ПЦР позволяет наработать конкретный регион ДНК, используя олигонуклеотидные праймеры и термостабильные ДНК-полимеразы 1.2.2.1 Анализ коротких тандемных повторов (КТП-анализ, STR-анализ) Метод ДНК-профилирования, используемый в настоящее время, основан на ПЦР и использует короткие тандемные повторы (КТП). В этом методе анализируются участки с высокой степенью полиморфизма, которые имеют короткие повторяющиеся последовательности ДНК (чаще всего для человека используют 4-х нуклеотидные повторы, но встречаются и другие длины повтора, в том числе 3 и 5 оснований). Поскольку разные люди имеют разное число повторяющихся звеньев, эти участки ДНК могут использоваться для установления различий между индивидуумами. Эти КТП локусы являются целью специальных праймеров и усиливаются с помощью ПЦР. Результирующие фрагменты ДНК затем отделяются и распознаются с помощью электрофореза. Есть два распространенных методов разделения и распознавания: обычный гель-электрофорез (рис. 5) и капиллярный электрофорез. Метод ПЦР был адаптирован для анализа локусов тандемного повтора. В США ФБР стандартизировало набор из 13 тандемных повторов для ДНК-профилирования, а также организовало базу данных CODIS для судебно-медицинской идентификации в уголовных делах. Подобные анализы и базы данных были созданы и в других странах. Кроме того, разработаны комплекты инструментальных средств, которые позволяют анализировать одиночный нуклеотидный полиморфизм (ОНП). В другом варианте, для человека при STR-анализе применяется 16 маркеров, каждый из которых имеет несколько десятков аллелей. [24]  Рисунок 5. Пример STR-анализа. М –маркер длин. S1, S4, S2, S3, R1, R4 – образцы ДНК. VC – негативный контроль. [http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3168162_IJHG-13-69-g002&req=4] 1.2.2.2 Анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP-анализ) Single nucleotide polymorphism (SNP) – это отличия последовательности ДНК размером в один нуклеотид (A, T, G или C) в геноме (или в другой сравниваемой последовательности) представителей одного вида или между гомологичными участками гомологичных хромосом. Например, если две последовательности ДНК — AAGCCTA и AAGCTTA — отличаются на один нуклеотид, в таком случае говорят о существовании двух вариантов: C и T. SNP возникают в результате точечных мутаций. При таком подходе для идентификации человека с выполнением требования криминалистических баз данных достаточно 40 маркеров, каждый из которых имеет два варианта (при условии примерно равной частоты каждого из вариантов в популяции). Важным преимуществом SNP-анализа перед методами ПДРФ и КТП является отсутствие этапа электрофоретического анализа фрагментов ДНК (что снижает вероятность загрязнения лаборатории продуктами ПЦР), а также возможность полной автоматизация исследования. В настоящее время подход используется наряду с КТП-анализом при идентификации личности.[25] 1.2.2.3 Митохондриальный анализ Для сильно деградировавших образцов иногда бывает невозможно получить полную информацию о коротких тандемных повторах. В таких ситуациях анализируется ДНК (мтДНК), поскольку в клетке существует много копий мтДНК, тогда как ядерной ДНК может быть не более 1-2 копий. Митохондриальный анализ является полезным дополнением в определении чёткой идентификации в таких случаях, как поиск пропавших без вести лиц, когда имеются только родственники, связанные по материнской линии. Митохондриальная ДНК может быть получена из такого материала, как волосы и старые кости или зубы. [26] 1.3 Применение генотипирования животных на практике Генотипирование животных широко используется в области сельского хозяйства для различения пород сельскохозяйственных животных. Например, при генотипировании пород крупного рогатого скота учитываются аллели, влияющие на такие важные факторы как мясная и молочная направленность породы, также одна из важных целей таких исследований – поиск пород с хозяйственно ценным генотипом [Столповский и др., 2013]. При генотипировании овец ведутся исследования генетической структуры породы. Исследования ведутся с использованием оценок полиморфизма различных участков ДНК. В частности, в работах Столповского обнаружен высокий уровень гетерозиготности, оцениваемый по разным типам молекулярно-генетических маркеров [Столповский, 2008]. Другой любопытный пример использования генотипирования – идентификация домашних животных. Так, власти города Петах Тиква (пригорода Тель-Авива, Израиль) решили отслеживать нарушителей общественного порядка (хозяев, не убирающих за своими питомцами на прогулке) с помощью анализа ДНК фекалий. Для этого в городе создается специальная база данных (пока для собак). Чиновники Петах Тиквы уже обратились к горожанам с просьбой показать свое животное местному ветеринару. Ветеринар берёт у собаки образец слюны, а затем в лаборатории определяют генотип животного. Экскременты, найденные на улице, будут «пробивать» по созданной базе, после чего владельцу животного будут высылать муниципальный штраф. Как уверяют авторы эксперимента, горожане, заботящиеся о чистоте улиц и выбрасывающие фекалии своих собак в специальные контейнеры, будут получать награды — купоны на еду для питомцев и собачьи игрушки. В будущем созданную базу ДНК собак планируют использовать, чтобы исследовать генетические болезни животных и изучить собачью родословную. Также в нее войдут данные о беспризорных животных, а это даст возможность отказаться от создания электронного чипа для каждого пса. Местные жители уже согласились участвовать в эксперименте, если через полгода его признают успешным, то постановка домашнего питомца на ДНК-учет станет принудительной для всех собаководов страны [27]. 1.4 Метод ПЦР В современной молекулярной биологии одним из лидирующих методов является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакция была изобретена американским биохимиком Кари Маллисом в 1983 году, после чего она стала рутинным и ежедневным инструментом в каждой молекулярно-биологической лаборатории [Теликов, 2006]. С помощью ПЦР можно увеличить содержание (концентрацию) нужного для исследований участка ДНК, не прибегая к сложной методике. Для наработки определённого участка ДНК нужно подобрать последовательности и синтезировать олигонуклеотидные затравки (праймеры), комплементарные границам этого участка, и, во время реакции, этот участок будет нарабатываться в пробирке. Основными компонентами ПЦР-реакции являются: 1. 10-ти кратный ПЦР-буфер (в дальнейшем PCRB). Он обеспечивает постоянство pH во время реакции. 2. Нуклеотиды (в дальнейшем dNTP). Из них строится амплифицированная ДНК. 3. Taq-полимераза. Это специальный белок, участвующий в синтезе новой цепи ДНК. 4. Праймеры. Это олигонуклеотиды, которые являются границами амлифицируемого участка. 5. Деионизованная вода (в дальнейшем MQ). 6. В случае ПЦР «в реальном времени» - зонд: специальный олигонуклеотид, разрушающийся во время амплификации и дающий свечение. 7. Минеральное масло. Для предотвращения изменения объема смеси и испарения Для приготовления смеси для ПЦР эти компоненты нужно смешать в таком порядке: MQ, PCRB, dNTP, праймеры, зонд, ДНК, Taq-полимераза. Существуют также приборы – ДНК-амплификаторы. Они работают, охлаждая и нагревая пробирки по температурам, которые вводятся в программу на компьютере. Количество и время циклов также вводятся пользователем в специальной программе [Ребриков и др., 2009]. 1.4.1 Стадии ПЦР Денатурация Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись (см рис.6). Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно, перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров. Отжиг Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей (см. рис.6). Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифичных продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 сек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой отжига выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72 °C. Элонгация ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки (см. рис. 6). Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5'- к 3'-концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато». [28]  Рисунок 6. Стадии ПЦР. 1 - Денатурация, 2 – Отжиг, 3-4 – Элонгация, Р – ДНК-зависимая ДНК полимераза.[29] В дополнение к обычной ПЦР в середине 90-х годов XX века появилась также ПЦР «в реальном времени». Этот метод, в общем случае, подразумевает определение количества амплифицированной ДНК по уровню флуоресценции, возникающей в пробирке, которую в ходе реакции фиксирует детектирующий амплификатор ДНК (рис.7). Этот метод имеет ряд преимуществ. Во-первых, при нем не происходит открывания пробирки после реакции, что снижает вероятность загрязнения лаборатории продуктами реакции [Higuchi et al., 1992]. Во-вторых, есть несколько разных способов проявки продуктов реакции, например, способ с добавлением интеркалирующего красителя [Higuchi et al., 1993] или использование флуоресцентной метки на праймере или зонде [Christopher J. et al, 2005]. Применение же ПЦР «в реальном времени» на практике, наряду с ответом на вопрос о наличии или отсутствии в исследуемом образце мишени, позволяет оценить её количество [Ребриков и др., 2009].  Рисунок 7. Пример графиков накопления продукта реакции в ходе ПЦР «в реальном времени». Cp – номер цикла, нужный для сравнения количества выделенной ДНК между разными образцами. Fam, Hex – типы флюоресценции, считываемые прибором. 1.5 Некоторые работы в области генотипирования животных по различному биологическому материалу Работа: Fecal DNA analysis and risk assessment of mountain lion predation of bighorn sheep [Holly et al., 2002]. В этой работе были проанализированны образцы ДНК из фекалий горных львов (Puma concolor) с целью идентифицировать особей, охотящихся на редкого толсторогого барана (Ovis canadensis) в Калифорнии с 1993-1999 год. Были идентифицированы 18 горных львов. Работа: Noninvasive monitoring of wolves at the edge of their distribution and the cost of their concervation [Echegaray et al., 2009]. В течение 2003-2004 года были собраны 136 фекалий, идентифицированных, как принадлежащие серым волкам за границей их привычного ареала обитания. В 86 случаях удалось генетически идентифицировать эти образцы, 31 – серые волки, 2 – красные лисы, 53 – собаки. Индивидуально были идентифицированны 16 разных волков по 20 микросателлитам. Работа: Noninvasive methodology for sampling and extraction of DNA from free-ranging Atlantic spotted dolphins (Stenella frontalis) [Michelle et al., 2007] Были собраны 15 образцов фекалий атлантических пятнистых дельфинов, которые были протестированы на пригодность к использованию в генетических исследованиях, включая ядерную и митохондриальную ДНК. Полученые митохондриальные сиквенсы были очень похожи на уже известные гаплотипы .Также были идентифицированы мать и детеныш как при помощи митохондриального гаплотипа, так и при помощи наследования алелей детеныша. Работа: Noninvasive genotyping and mendelian analysis of microsatellites in African savannah elephants [Okello et al., 2005]. Были исследованы 202 (133 пары мать-детеныш) образца фекалий саванных слонов, которые были генотипированны по 20 микросателлитам. 1.6 Некоторые работы в области ДНК-идентификации представителей семейства кошачьих (Felidae) Работа: In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger [Henry et al., 2009]. В этой работе описывается исследование генетической структуры и демографической истории группы амурских тигров и сравнение данных полученных в неволе и природе. По результатам этой работы было установлено, что генетическая вариабельность в неволе и в природе одинакова, однако в неволе сохраняются те варианты генов, которые были утеряны в природе. Также, было найдено историческое сокращение численности популяции, хотя и не получилось доказать недавнее «бутылочное горлышко», а оценки численности были ниже всех, предложенных ранее. Работа: A Genetic Linkage Map of Microsatellites in the Domestic Cat (Felis catus) [Menotti-Raymond et al., 1999]. В этой работе авторы провели генетическое картирование генома домашней кошки (Felis catus), в результате которого была составлена карта генетической связи в микросателлитных локусах, включающая 246 аутосомальных и 7 локусов, связанных с Х хромосомой. Было идентифицировано около 235 динуклеотидных и 18 тетрануклеотидных повторов, причем они были генотипированны в два семейства, включающих 108 членов, полученных при межвидовом обратном скрещивании родословных домашней кошки и бенгальской кошки. Также было получено 34 группы, идентифицирующихся несколькими маркерами, связанными с 229 локусами. Было выяснено при помощи соматического клеточного гибридного анализа, что представительные маркеры из каждой группы принадлежали к специальным хромосомам кошки. Был установлен приблизительный размер генома – 2900 сМ, а генетическая длинна усредненной половой карты – 3300 сМ. Работа: Population size estimation of Amur tigers in Russian Far East using noninvasive genetic samples [Sugimoto et al., 2012]. В этой работе была произведена приблизительная оценка численности популяции и идентификации особей амурского тигра с помощью неинвазивных генетических образцов (шерсти, фекалий, слюны), собранных в Приморском Крае на протяжении четырех зим (2000–2001, 2001–2002, 2002–2003, и 2004–2005). В течение этих зим было идентифицированно 12 тигров (7 самок и 5самцов) при помощи 10 микросателлитных маккеров. Оценочна численность популяции составила 12 особей, что совпалоло с другими данными. Было установлено, что из неинвазивных генетических образцов самыми лучшими для генотипирования являютсяч фекалии. Работа: Неинвазивная индивидуальная идентификация амурских тигров (Panthera Tigris altaica) молекулярно-генетическими методами [Рожнов и др., 2009]. В этой работе была успешно проверена методика неинвазивной индивидуальной идентификации тигров молекулярно-генетическими методами, и с ее использованием определены число, пол и родственные связи особей в группировке тигров на территории заповедника «Уссурийский» ДВО РАН. Сопоставление результатов выделения, амплификации и анализа ядерных фрагментов ДНК из различных образцов (кровь, шерсть и экскременты) показало значительное их сходство по длинам микросателлитных фрагментов ДНК. Это свидетельствует о возможности использования экскрементов и шерсти, собранных в местах обитания амурского тигра, для неинвазивной индивидуальной идентификации этих животных. На момент начала нашей работы данных о существовании тест-систем для определения пола амурских тигров методом ПЦР «в реальном времени» и определения SNP в геноме амурских тигров методом ПЦР «в реальном времени» не обнаружено. |
Похожие:
 |
О научно-образовательном центре коллективного пользования фгбун имби «Спектрометрия и хроматография» (далее – цкп) федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт морских биологических... |
|
История россии Ран а. Н. Сахаров (отв редактор). докт ист наук В. П. Дмитренко (зам отв редактора), академик ран и. Д. Ковальченко, член-корр ран... |
 |
Российская академия наук институт социально-экономического развития территорий ран Исэрт ран (ранее внкц цэми ран) продолжает знакомить своих подписчиков с наиболее интересными, на наш взгляд, публикациями, затрагивающими... |
|
Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые... |
|
Сравнительный эколого-генетический анализ микроспоридий и их хозяина... Сравнительный эколого-генетический анализ микроспоридий и их хозяина – байкальской амфиподы gmelinoides fasciatus |
|
Краткая инструкция пользователя асу рид ран (ученого секретаря) Введение Данная инструкция адресована сотрудникам научных организаций ран, осуществляющим сбор данных по оценке результативности деятельности... |
|
О проведении открытого аукциона в электронной форме Наименование государственного заказчика: Учреждение Российской академии наук Институт неорганической химии им. А. В. Николаева Сибирского... |
|
О проведении запроса котировок цен на право заключения государственного контракта Государственный заказчик: Учреждение Российской академии наук Институт неорганической химии им. А. В. Николаева Сибирского отделения... |
|
Извещение о проведении запроса котировок (запрос котировок) Государственный заказчик: Учреждение Российской Академии Наук Больница Пущинского научного центра ран (сокращенное бпнц ран) |
|
Техническое задание Общие требования Учреждение Российской академии наук Ордена Ленина и Ордена Октябрьской революции Институт геохимии и аналитической химии им. В. И.... |
|
Протокол заседания оус Цкп аналитическим оборудованием, оснащенных новейшими прецизионными высокопроизводительными приборами |
|
Указатель литературы обменных фондов библиотек 2 2013 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственная публичная научно-техническая библиотека Сибирского отделения... |
|
Список научных публикаций сотрудников юнц ран Венков А. В. Антироссийское антисоветское движение (1917-1918 гг.) на Украине в годы Гражданской войны. Ростов-на-Дону: Изд-во юнц... |
|
Молекулярно- генетический профиль дофаминовой нейромедиаторной системы... Работа выполнена в фгбу «Национальный научный центр наркологии» Миндзрава России |
|
Конкурс 2015 года По Программам ран программа фундаментальных исследований Президиума ран №1 Программа включает в себя три Подпрограммы (I – III). Подпрограмма I «Физика и технология наноструктур, наноэлектроника и диагностика»... |
|
Инструкция по оформлению текстов докладов для опубликования в сборнике... Объединенный институт высоких температур ран, 111116, Москва, Красноказарменная, 17а |