Учебно-методический комплекс дисциплины «Медицинская химия»

Скачать 1.36 Mb.

Название	Учебно-методический комплекс дисциплины «Медицинская химия»
страница	8/10
Тип	Учебно-методический комплекс

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Учебно-методический комплекс

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Специальность — 020100.65, химия

г. Владивосток

2011

Модуль 1. Методология твердофазного комбинаторного синтеза¹

Раздел 1. Методология твердофазного синтеза с использованием «Билл-борда»

Краткое описание задачи. Задача состоит из четырех этапов: (1) алкилирование СH2-группы аминокислоты, иммобилизованной на смоле Ванга (W); (2) удаление защитной группы; (3) ацилирование NH2-группы аминокислоты; (4) удаление дважды модифицированной аминокислоты с подложки

Требуемые реактивы: смола 1 (защищенный глицин на смоле Ванга) 2 г, фосфазеновое основание ВЕМР (Aldrich-79432, см. формулу на схеме 1) 5 мл, диизопропилэтиламин (DIEA) 100 мл, трифторуксусная кислота (TFA) (99%) 100 г, водная НСl (1N) 50 мл. Необходимые растворители: 1 л N-метилпирролидона-2 (NMP) и по 100 мл хлористого метилена (DCM), тетрагидрофурана (THF) и диметилформамида (DMF) (последний нужен для ополаскивания крышек реакционных сосудов).

В качестве алкилирующих реагентов используются три бензилбромида (расход от 1 до 5 г): незамещенный бензилбромид, мета-бром- и пара-трифторметилпроизводные. В качестве ацилирующих агентов рекомендованы вещества с большим молекулярным весом — 9-флуоренилхлороформиат (Fmoc-Cl) и 2-нафтоилхлорид (по 5 г).

Лабораторная работа 1. Алкирование глицина, иммобилизированного на полимерном носителе

1. Приготовление изопикнического раствора имина глицина 1, иммобилизованного на смоле Ванга, из расчета 65 мг (50 ммоль) на один эксперимент (емкость смолы равна 0,77 ммоль/г).

К твердой смоле добавляются два растворителя с различной плотностью, например, тетрагидрофуран и хлористый метилен. Варьируя количества этих растворителей удается достичь максимальной гомогенности геля, когда частицы смолы не всплывают и не оседают. В начале первого лабораторного занятия студент получает 6 реакционных сосудов, помещенных в Билл-борд, и раствор смолы 1.

2. Требуемый объем изопикнического раствора распределяют по сосудам, после чего растворителю дают стечь. Для вытеснения остатков растворителя можно использовать простую помпу. Затем, пластиковой пипеткой Бераля (емк. 3,5 мл) промывают смолу в каждом реакционном сосуде (три раза по 3 мл NMP). На всех этапах выполнения работы необходимо выполнять следующие инструкции.

I. Общая процедура промывания. Промывания всегда должны выполняться строго в порядке, указанном в эксперименте. Жидкость для промывания ∼3 мл (это примерно 80% от всего объема реакционного сосуда) добавляется с помощью пипетки объемом 3,5 мл. После добавления растворителя подождать 30 с, пока жидкость не просочится сквозь фильтр под действием силы тяжести. Затем смолу следует полностью просушить («продуть») с помощью помпы. Обязательно подставить стакан под кран на поддоне, из которого стекает растворитель. В конце вылить жидкость из стакана в сливной контейнер.

II. Использование воздушной помпы (груши). «Помпа» —кусок резинового шланга, в один конец которого вставлена пластиковая пипетка Бераля, а второй конец присоединен к септе со сквозной прорезью. После того, как растворитель в сосуде стечет сквозь фильтр под действием силы тяжести (в течение 30 с), присоединить помпу (со стороны септы) к горлышку пузырька и нажать на уширенную часть пипетки. Чтобы избежать обратного всасывания растворителя из сосуда в шланг следует приподнять септу над горлышком и лишь затем разжать пальцы. Процедуру повторять, пока весь растворитель не протечет через фильтр.

III. Манипуляции с крышками реакционных сосудов. Перед тем, как закрыть крышку, нужно сначала удалить любые с помощью мягкой салфетки. Перед тем, как открыть крышку, нужно повернуть Билл-борд вверх той стороной, которую необходимо открыть. Отвинтить крышку, перевернуть Билл-борд и поместить его в поддон. Несколько раз встряхнуть Билл-борд, чтобы убедиться, что все остатки геля удалены с внутренней стороны крышки. Открыть верхние крышки всех реакционных сосудов и положить их в стакан для повторного использования.

3. Поместить Билл-борд в специальный держатель. Завинтить нижние крышки (по расположению — ближайшие к впаянным фильтрам) каждого реакционного сосуда.

4. Подготовить три калибровочных пипетки Бераля для добавления бензилирующих агентов 1R1–Br, 2R1–Br и 3R1–Br (для каждого реагента своя пипетка). Меры предосторожности: очки, перчатки! Добавить по 0,5 мл 0,2 М раствора алкилирующих агентов в NMP (100 ммоль, 2 экв.). Соответственно 1R1–Br добавить к смоле в реакционные сосуды первой вертикальной колонки (А1 и В1); 2R1–Br — в сосуды второй вертикальной колонки А2 и В2, 3R1–Br — в сосуды А3 и В3. Добавить по 0,5 мл 0,2 М раствора основания BЕМР в NMP (100 ммоль, 2 экв.) в каждый из шести реакционных сосудов. Завинтить верхние крышки Билл-борда и поместить Билл-борд во вращающий аппарат. Записать время начала реакции и номер выданного Билл-борда. Время протекания реакции — 24 ч. Эту реакцию (и все последующие) проводят при комнатной температуре. Перед тем, как покинуть лабораторию, промыть поддон ацетоном над контейнером для слива.

Лабораторная работа 2. Снятие защитной группы и N-ацилирование

6. Записать время окончания реакции и вынуть Билл-борд из вращающего аппарата. Открыть крышки, как рекомендовано в инструкции III.

7. Смыть избыток реагентов со смолы. Промыть проалкилированную смолу (продукт 2) один раз 3 мл THF и высушить, используя помпу (инструкция II).

8. Поместить Билл-борд на подставку. Взять 12 чистых крышечек, закрыть нижние крышки каждого реакционного сосуда и добавить примерно 2,5 мл 1н водной смеси HCl-THF (1:2) в каждый сосуд. Закрыть верхние крышки и поставить во вращательный аппарат на 20 мин.

9. Открыть все крышки.

10. Отфильтровать и промыть полученный продукт 3 растворителями: 1 раз 3 мл THF, затем 1 раз 3 мл NMP.

11. Поместить Билл-борд на подставку. Взять 12 чистых крышек. Закрыть нижние крышки каждого реакционного сосуда. Добавить 0,5 мл 0,2 М раствора первого ацилирующего агента 1R2–COCl в NMP (100 ммоль, 2 экв.) к смоле 3 в трех реакционных сосудах, расположенных в первом горизонтальном ряду (А1, А2 и А3). Затем добавить 0,5 мл 0,2 М раствора второго ацилирующего агента 2R2–COCl в NMP (100 ммоль, 2 экв.) к смоле 3 в трех реакционных сосудах, расположенных во втором горизонтальном ряду (В1, В2 и В3). Затем добавить во все шесть реакционных сосудов по 0,5 мл 0,3 М раствора диизопропилэтиламина (DIEA) в NMP (150 ммоль, 3 экв.). Закрыть верхние крышки. Реакцию проводят 24 ч во вращающем аппарате.

Лабораторная работа 3. Снятие N,C-замещенной аминокислоты с подложки

12. Вынуть Билл-борд из вращающего аппарата, открыть крышки.

13. Отфильтровать и промыть полученный продукт 4, добавляя 2 раза по 3 мл NMP, затем 2 раза по 3 мл THF и 3 раза по 3 мл CH₂Cl₂.

14. Поставить Билл-борд на подставку. Закрыть дно чистыми крышками. Добавить в каждый сосуд по 2 мл смеси CF3COOH/H2O (95:5). Работать осторожно! Закрыть верхние крышки и поставить Билл-борд вращаться на 30 мин..

15. Пока протекает реакция расщепления, следует подготовить шесть взвешенных пузырьков, пометить их соответствующими кодами (А1В1, А1В2 и т.д.) и поставить в приемный штатив с шестью гнездами.

16. Продукты 5, которые теперь находятся в растворе (поэтому необходимо сохранить фильтрат), перенести в пузырьки. Для этого надо перевернуть Билл-борд, нижними крышками вверх, открыть эти крышки и надеть приемные пузырьки на реакционные сосуды. Следить за соответствием кодов сосудов и пузырьков. После того, как все пузырьки размещены, поместить на них штатив с гнездами и перевернуть всю конструкцию. Открыть верхние крышки и собрать фильтрат в пузырьки, применяя помпу.

17. Промыть смолы 1 раз 2 мл смеси CF₃COOH-H₂O (95:5) и 1 раз 2 мл CH₂Cl₂, собирая смывные жидкости в приемные пузырьки. Каждый раз тщательно продавливать растворитель с помощью помпы.

18. Снять Билл-борд с пузырьков. Перенести по 0,1 мл образца каждого продукта 5 в емкости для последующего LC/MS анализа. Пузырьки с конечными продуктами поместить для упаривания в вакуумный сушильный шкаф. (Упарить можно и на роторном испарителе в предварительно взвешенных колбах.)

19. Промыть поддон и Билл-борд ацетоном.

Лабораторная работа 4. Определение выходов конечных продуктов и ТСХ анализ

20. Взвесить все конечные продукты. (С учетом того, что реакции проводятся в шкале 50 мкмоль, а молекулярная масса продуктов варьирует в интервале 300—400 г/моль, теоретический выход для каждой реакции должен составлять 15—20 мг.) Фактический выход 10—15 мг.

21. Для тонкослойной хроматографии каждый продукт растворить в тетрагидрофуране (брать примерно 0,1 мл THF на 1 мг продукта) и использовать систему CHCl₃/THF/CH₃COOH (85/15/2). Хроматограммы наблюдать сначала в лучах УФ лампы, затем проявить йодом. В обоих случаях записать значение Rf. В качестве реперов могут быть использованы образцы, синтезированные ранее.

Раздел 2 Применение метода «чайного пакетика»

Лабораторная работа основана на широко распространенной технологии твердофазного синтеза, так называемом методе «чайного пакетика». В качестве контейнера для смолы используется пакетик из пористой пластиковой пленки, заплавленный по всему периметру

Последовательность реакций. В качестве модельной химической реакции была выбрана последовательность, приведенная на схеме. На смолу Ванга иммобилизуют 2-фтор-5-нитробензойную кислоту — соединение, содержащее активированный для нуклеофильного замещения галоген, а также нитрогруппу, которую легко восстановить, и далее проацилировать образующуюся аминную функцию. Теоретически исходная кислота —трехточечный темплат, поскольку третью функцию —карбоксильную — можно также успешно превратить, например, в амидную. В рассматриваемой задаче, однако, используется укороченная последовательность, и целевыми продуктами являются замещенные 2,5-диаминобензойные кислоты 15.

Требуемые реактивы и оборудование. Смола Ванга, пленка для пакетиков и инструментарий для их изготовления. Требуется большой объем различных растворителей, серия вторичных алифатических аминов, а также хлорангидриды ароматических (в том числе гетероароматических) карбоновых кислот, SnCl₂, пиридин, уксусный ангидрид, трифторуксусная кислота. Работа проводится на шейкере (обычно при комнатной температуре); в качестве резервуаров для пакетиков со смолами используются флаконы с крышками разного размера.

Лабораторная работа 5. Иммобилизация 5-нитро-2-фторбензойной кислоты на смоле Ванга

Смолу Ванга 7 (50 г, емкость 2,0 ммоль/г) суспендируют в растворе, содержащем 0,2 моль 2-фтор-5-нитробензойной кислоты 6 (37,41 г) и 25 мг 4-диметиламинопиридина в 400 мл абсолютного хлористого метилена (DCM), затем осторожно добавляют 31,5 мл (0,2 моль) диизопропилкарбодиимида. Реакционную смесь встряхивают двое суток при комнатной температуре. Смолу отфильтровывают и промывают растворителями в следующем порядке 2×DCM, DMF, MeOH, 2×DCM, 2×MeOH, 2×DCM, 2×н-гексан и высушивают в вакууме. Смола 8 готова к дальнейшему использованию.

Лабораторная работа 6. Замещение фтора на диалкиламиногруппу

Смолу 8 расфасовывают в пористые пластиковые пакеты, число которых равно числу конечных продуктов. Масса смолы в пакетике 250 мг (емкость из расчета 1,5 ммоль/г). В соответствии с техническим заданием (в котором указано, сколько опытов и с каким амином следует провести) распределяют пакетики по флаконам, число которых соответствует числу взятых аминов. Пакетики маркируются.

В каждый флакон добавляется требуемый амин в растворе тетрагидрофурана из расчета 5 экв. (1,9 ммоль) на одну порцию смолы. Флаконы помещают в шейкер на 18 ч. Пакетики промывают последовательно 2×THF, DMF, 2×MeOH, 2×DCM, 2×н-гексаном. В итоге атом фтора в смоле 8 замещается на соответствующую диалкиламиногруппу с образованием смол 10. На этой стадии используется одна важная операция (т н. capping). Дело в том, что вторичный амин частично разрушает сложноэфирную связь, которой замещенная бензойная кислота крепится к полимеру. В итоге часть гидроксиметильных групп смолы обнажается и может выступать в качестве конкурентного центра на последующей стадии ацилирования. Поскольку для ацилирования на этапе 4 берутся производные ароматических кислот, то вводимые ацильные остатки сохранятся на смоле до последнего этапа, а на стадии расщепления линкера загрязнят конечный продукт. Для этого нужно прикрыть (защитить) гидроксиметильные группы «безобидным» остатком водорастворимой кислоты, например, уксусной. На практике полученные смолы помещают в раствор пиридина, к которому добавляют уксусный ангидрид.

Количество реагентов рассчитывают, исходя из соотношения 5 экв. (1,9 ммоль, 0,204 мл) пиридина в абс. DCM на один пакетик с последующим добавлением 5 экв. (1,9 ммоль) уксусного ангидрида. Флаконы помещают в шейкер и встряхивают 18 ч при комнатной температуре. Смолы промывают последовательно 2×THF, DMF, 2×MeOH, 2×DCM, затем дважды н-гексаном, высушивают в вакууме и получают продукты 10.

Лабораторная работа 7. Восстановление нитрогруппы

Поскольку реакция одна и та же для всех смол 10, то помеченные пакетики помещают в единый реакционный сосуд. К смолам 10 добавляют 2 М раствор SnCl2×2H2O в DMF (из расчета 50 мл раствора на 1 пакетик) и встряхивают при комнатной температуре 48 ч. Пакетики промывают последовательно 2×DMF, 2×DMF/H2O (1:1 по объему), 2×H₂O, 2×DMF, 2×MeOH, 2×DCM, 2×MeOH, 2×DCM, дважды н-гексаном, высушивают в вакууме и получают смолы 11 со свободной аминогруппой.

Лабораторная работа 8. Ацилирование аминогруппы (получение диацилпроизводного)

Операцию проводят в два этапа. Чтобы предотвратить неполное протекание реакции, подбирают такие условия, в которых идет двойное ацилирование аминогруппы анилинового фрагмента. На следующей стадии следует мягкое удаление одной из ацильных групп, не затрагивающее вторую. В соответствии с техническим заданием (в котором указано, сколько опытов и с каким ацилирующим агентом следует провести) вновь распределяют пакетики со смолами 6 по флаконам, число которых соответствует числу ацилхлоридов. Пакетики вновь маркируются. В каждый флакон добавляется 5 экв. (1,9 ммоль) пиридина в абс. DCM и требуемый ацилхлорид 7 из расчета 5 экв. (1,9 ммоль) на одну порцию смолы. Флаконы помещают в шейкер и встряхивают при комнатной температуре 6—18 ч. Пакетики промывают последовательно 2×DCM, 2×DMF, 2×MeOH, 2×DCM, 2×MeOH, 2×DCM, дважды н-гексаном и высушивают. Образуются диацилпроизводные 13.

Удаление одной из ацильных групп

Пакетики со смолами 13 помещают в 25% раствор водного аммиака в DMF и встряхивают на шейкере при комнатной температуре в течение 18 ч. Промывают 2×DMF, 2×MeOH, 2×DCM, 2×MeOH, 2×DCM, дважды н-гексаном. Получают моноацильные производные 14.

Лабораторная работа 9. Снятие конечного продукта с подложки

Каждый пакетик помещают в индивидуальный флакон и обрабатывают 10%TFA/DCM, выдерживая при комнатной температуре 2 ч. Раствор декантируют, растворитель упаривают при пониженном давлении и получают конечные продукты 15. Выход и чистота получаемых продуктов. При использовании навески исходной смолы в 100 мг масса выделяемого продукта в среднем составляла 150 мг. Анализ конечных образцов 15, проведенный методом LC-MS (UV-254 и ELSD детекторы) свидетельствовал об их чистоте > 90%.

Модуль 2. Методология жидкофазного комбинаторного синтеза

Раздел 1. Применение «скавенджеров» для очистки продуктов параллельного жидкофазного синтеза

Учебная реакция восстановительного аминирования является простым и наглядным примером, демонстрирующим особенности параллельного синтеза органических соединений. Задача включает стадию параллельной очистки получаемых продуктов с помощью простейшего скавенджера — ионообменной смолы.

Каждый студент проводил шесть опытов по синтезу четырех целевых соединений реакцией восстановительного аминирования (из расчета 1 альдегид + 4 амина), причем в трех случаях молярное соотношение альдегида и амина варьировалось. В течение шести занятий (2—3 ч каждое) каждый студент проводил шесть параллельных реакций, предварительную очистку реакционной смеси на катионообменной смоле Dowex и хроматографическую очистку продуктов. Для очищенных продуктов регистрировались спектры ЯМР. На заключительном занятии студенты делали выводы об оптимальных условиях проведения реакций, анализировали выходы продуктов и их чистоту.

Реактивы и растворители:

1) дихлорэтан (ДХЭ), хлористый метилен, изопропанол, карбонат калия, сульфат натрия безводный, силикагель для хроматографии, запас пластинок силуфола; 2) триацетоксиборгидрид натрия Na[BH(OAc)3] в качестве восстановителя, безводная щавелевая кислота для осаждения оксалатов; 3) ионообменная смола Dowex для очистки продуктов от примесей альдегида; 4) набор из 5—10 вторичных алифатических аминов, например, циклических (пирролидин, пиперидин, морфолин и т.д). Нами дополнительно использовался набор аминов на основе 4-замещенных пиперазинов (4-алкили 4-ацилпроизводных) и амидов пиперидин-4-карбоновой (изонипекотовой) кислоты (для этих аминов вариация заместителей легко достигается при наличии запаса 1-Boc-пиперазина или N-Boc-изонипекотовой кислоты); 5) набор из 5—10 ароматических альдегидов. Использовался специфический набор гетероциклических альдегидов имидазольного ряда общей формулы I, где радикалы R' и R" образуют другое гетероциклическое кольцо (схема 1): пиридиновое (IA), пиримидиновое (IB), тиазольное (IC), либо бензотиазольное (ID). Такие альдегиды I весьма легко получить по реакции Вильсмайера формилированием соответствующих конденсированных имидазолов. Исходные мостиковые гетероциклы III элементарно получать по классической схеме Чичибабина из аминогетероциклов и фенацилбромидов. Выходы на всех стадиях достаточно высоки, и методики синтеза альдегидов I и их предшественников III можно найти в литературе.

В итоге короткая последовательность синтеза альдегидов I позволяет гибко варьировать природу гетероциклического и арильного остатка в альдегиде, а образующиеся в реакции восстановительного аминирования вещества II имеют отчетливое структурное родство (drug-likeness) с известными лекарственными препаратами IVa (зольпидем) и IVb (альпидем).

Требуемое оборудование:

1) набор автоматических одноканальных пипеток различного объема с набором наконечников к ним;

2) набор завинчивающихся стеклянных флаконов с крышками (тройной запас по числу реакций) и любой шейкер для встряхивания;

3) набор пластиковых шприцов с пористой перегородкой для пропускания реакционных смесей через катионит. Шприцы можно использовать и в качестве мини-колонок для хроматографирования, однако предпочтительнее пропускать смесь через обычный короткий стеклянный фильтр с силикагелем. Следует тщательно продумать удобный и компактный крепеж шести шприцов (фильтров) на одном рабочем месте, например, используя простую металлическую гребенку;

4) стандартный набор посуды с большим числом стаканчиков (60—100 мл).

Приобретаемые навыки

В ходе работы студенты знакомятся с деталями реакции восстановительного аминирования и оптимизируют ее условия, осваивают навыки простого параллельного синтеза и очистки, знакомятся с практикой использования скавенджера. Для знакомства с технологическими аспектами параллельного синтеза полезно повторить эту же задачу в варианте работы в плашках.

Лабораторная работа 10. Получение серии иминов исходя из нескольких альдегидов и аминов в условиях параллельного синтеза

Студентам выдается вариант задачи получения четырех целевых соединений реакцией восстановительного аминирования. Требуется получить три целевых соединения в одинаковых условиях (1 альдегид плюс три амина) и одно целевое соединение при различных соотношениях реагентов (тот же альдегид плюс четвертый амин в соотношении 1,2:1, 1:1, 1:2). Пример возможной загрузки реагентов приведен в таблице.

Преподаватель поясняет, что в данном случае (вариант F) для всех опытов берется один и тот же альдегид №5 из набора альдегидов (код СО5), который комбинируется с четырьмя аминами с кодами от NR09 до NR12. Растворы альдегидов и аминов приготовлены и пронумерованы заранее, поэтому студенты выполняют следующие несложные операции.

1. На каждый флакон наклеить этикетку согласно полученному варианту. Например, 1F, 2F, 3F, 4F, 5F, 6F (F — вариант задания, число — номер опыта).

2. В каждый флакон пипеткой перенести 2 мл раствора альдегида в дихлорэтане (0,343 моль/л) или (для малорастворимого альдегида) добавить 2 мл ДХЭ к навеске, соответствующей 0,69 ммоль альдегида.

3. В каждый флакон пипеткой перенести раствор требуемого амина в дихлорэтане. Растворы приготовлены заранее.

В опытах 1—4 добавить к раствору альдегида по1,66 мл растворов каждого из четырех аминов (соотношение альдегид:амин равно 1,2:1). В опыте 5 добавить к раствору альдегида 2 мл раствора четвертого амина (соотношение альдегид:амин 1:1). В опыте 6 добавить к раствору альдегида 4 мл раствора четвертого амина (соотношение альдегид:амин 1:2).

Флаконы закрыть крышками и поставить на шейкер для встряхивания. На данном этапе рекомендуется закончить занятие, поскольку установление равновесия между реагентами с образованием промежуточного имина требует определенного времени. Наилучшие результаты достигаются, если последующее добавление восстановителя проводить через 12—24 ч.

Лабораторная работа 11. Восстановление имина до амина в условиях параллельного синтеза

4. В каждый флакон пипеткой добавить 2 мл суспензии восстановителя (Na[BH(OAc)₃]) в дихлорэтане. Флаконы неплотно (выделяется водород!) закрыть крышками и поставить на шейкер. Реакция обычно завершается за 24—48 ч.

Лабораторная работа 12. Выделение целевого продукта в условиях параллельного синтеза

5. В каждый реакционный флакон добавить 10 мл 20% водного раствора карбоната калия. Флаконы неплотно прикрыть крышками и поставить на устройство для встряхивания на 30 мин.

6. Следует подготовить шесть пустых флаконов с такими же этикетками, как на реакционных флаконах. Из каждого реакционного флакона шприцом отобрать нижний (органический) слой и перенести его в пустой флакон. Водный слой однократно экстрагировать 5 мл хлористого метилена. Органические слои объединить.

7. Поставить хроматограмму органического слоя, сравнив с исходными альдегидом и амином (элюент СНCl₃/MeOH 8:1 или С₆Н₆/EtOAc 2:1). Рекомендуется поставить на первой хроматограмме три первые реакционные смеси плюс три исходных амина и альдегид, а на второй хроматограмме — другие три реакционные смеси плюс четвертый исходный амин и альдегид.

8а. Если в смесях нет исходного альдегида, то к растворам следует добавить безводный Na₂SО₄ в качестве осушителя. Флаконы закрыть крышками и оставить на ночь.

Лабораторная работа 13. Очистка продукта в условиях параллельного синтеза

8б. При наличии в смеси исходного альдегида следует провести дополнительную очистку. Первый способ — провести встряхивание органического слоя с водным раствором бисульфита натрия и проверить по ТСХ степень чистоты получаемых продуктов. Второй способ —нанести органический слой на колонку, содержащую смолу Dowex, насыщенную пиридином. Смола хорошо сорбирует продукт, но плохо сорбирует исходный альдегид. Колонку со смолой промыть метанолом до отсутствия следов альдегида в выходящем растворе. Конечный продукт смывать с колонки, пропуская через смолу метанольный раствор диэтиламина. Метанольный раствор оставить под тягой для упаривания. Для дополнительной очистки требуется хроматография (см. п. 9).

9. При отсутствии в смеси исходного альдегида и наличии исходного амина нужно провести хроматографическую очистку на силикагеле (элюент СНCl₃/MeOH 8:1). Как правило, исходный алифатический амин имеет малую величину Rf, поэтому от его следов легко избавиться, пропуская смесь через короткий стеклянный фильтр, заполненный силикагелем.

10. Конечные продукты восстановительного аминирования (после хроматографической очистки) можно дополнительно очистить осаждением их в виде оксалатов. Для этого к растворам продуктов следует добавить раствор щавелевой кислоты в изопропаноле и оставить до выпадения осадка.

Лабораторная работа 14. Фильтрование осадков и определение выхода продуктов

11. Осадки полученных оксалатов отфильтровать, промыть эфиром и высушить.

12. На флаконы следует наклеить этикетки с кодом продукта, например, 1F-CO5-NR12, где 1F — номер опыта, СО5 — номер альдегида, NR12 — номер амина (см. таблицу). Взвесить пустые флаконы, определить массу продуктов и рассчитать выход. Один из образцов подготовить для съемки спектра ПМР. На итоговом занятии подводятся итоги исследования влияния соотношения реагентов на выход и чистоту продуктов. Как правило, степень превращения при избытке одного из реагентов повышается, однако «расплатой» за это является необходимость отделения оказавшихся в избытке альдегида (скавенджером) или амина (хроматографией).

Раздел 2. Технология микросинтеза в плашках

Для упрощения работ по жидкофазному параллельному синтезу существует несколько простых приемов. Во-первых, используются металлические блоки-штативы для работы с 48 пробирками (формат 6×8). Добавление реагентов и растворителей осуществляется с помощью многоканальных пипеток (6 или 8 носиков). Герметизация всего блока проводится единой тефлоновой прокладкой, причем для упрочнения контакта прокладки с пробирками используется дополнительная металлическая крышка с винтами. Перемешивание осуществляется в барабане, на который устанавливаются сразу несколько блоков.

Лабораторная работа 15. Загрузка плашек реагентами

В блок на 48 стеклянных пробирок (6 мл) загружают суспензию тонко растертого триацетоксиборгидрида натрия в хлористом метилене (по 800 мкл, 3,6 мг, 0,17 ммоль на пробирку; 3,6 г/40 мл CH₂Cl₂ на плашку) с помощью диспенсора Step-Pett.

К восстановителю прибавляют по 400 мкл растворов соответствующих аминов (по 0,2 ммоль) и альдегидов (по 0,26 ммоль) в хлористом метилене. В случае изменения порядка загрузки реагентов следует обращать внимание, чтобы в момент загрузки альдегиды не соприкасались с восстановителем. Если вещество не растворяется, то при необходимости следует увеличить объем раствора. Реагенты загружаются с помощью пипетки на 1000 мкл с длинными носиками Matrix (на 1250 мкл). Носики составляют в соответствующем загрузке порядке в специальный штатив и используют далее на всех стадиях выделения данной загрузки, после чего носики рядами моются с помощью восьмиканальной пипетки).

Пробирки закрывают прямоугольной тефлоновой прокладкой, винтами закрепляют дополнительную металлическую крышку и энергично перемешивают в течение 24 ч в барабане типа «гриль». Растворитель удаляют на воздухе или в сушильном шкафу при 40 °С до конечного объема 100 мкл.

На следующем этапе требуется отделить конечный амин от примеси непрорегировавшего альдегида в каждой из реакционных смесей. Для этого, как и в предыдущей задаче, смесь пропускается через ионообменную смолу (катионит) Dowex. При работе с 48 смесями на колонках сложнее отслеживать степень и полноту сорбции для всего массива веществ.

Лабораторная работа 16. Очистка полученных продуктов на микроплашках

Для очистки реакционной смеси от альдегида упаренные остатки, полученные на 1 этапе эксперимента, растворяют в метаноле и наносят с помощью восьмиканальной пипетки (носики на 5 мл) на колонки с 4 мл суспензии Dоwex-Py. (Для приготовления суспензии 90 г Dоwex и 100 мл метанола перемешивают на магнитной мешалке). Суспензию наносят в колонку с помощью шприцевого восьмиканального дозатора или степ-дозатора на 40 мл.

Далее нейтральные примеси (альдегиды) смывают метанолом (по 5 мл на колонку). Первые 5 мл нейтрального слоя собираются в 48 стеклянных пробирок (на 6 мл), при этом по ТСХ контролируют возможный «проскок» амина. При необходимости подставляется еще одна плашка со смолой и нейтральный слой наносится повторно. Остатки метанола с колонок выдавливают сжатым воздухом.

Конечные продукты смывают с колонок 30% раствором диэтиламина в метаноле в 48 стеклянных пробирок (на 6 мл), размещенных в двух штативах. Наливать раствор амина в фильтрующие колонки надо максимально равномерно, чтобы в конце элюирования все приемники были заполнены доверху. Если при добавлении диэтиламина продукт начинает кристаллизоваться на ионообменной смоле, то после промывки первыми 5 мл смеси метанол/диэтиламин следует перейти на смесь хлороформ/метанол 1:1.

На следующем этапе необходимо полностью избавиться от растворителя и диэтиламина (Ткип = 56 °С). Для этого используется вакуумная центрифуга Savant, принцип действия которой основан на вымораживании растворителя в вакууме. Центробежная сила привращении центрифуги предотвращает вспенивание растворителя, и удается упарить достаточно высококипящие растворители, например диметилсульфоксид. Растворитель упаривают досуха при 40 °С в центрифуге Savant в течение 6 ч, продукты растворяют в 200—400 мкл хлороформа, объединяют и анализируют с помощью ТСХ. Продукты, не требующие дополнительной очистки, переносят в заранее взвешенные пластиковые пробирки (6 мл), помеченные баркодами для электронного считывания данных. При этом 10% от каждого раствора отбирают для ЯМР-анализа и переносят в плашку Marsh (96×1,2 мл). Обе плашки подписывают (положение неподписанных пробирок соответствует листу загрузки), растворитель высушивают на воздухе или в сушильном шкафу при 40 °С, остатки растворителя удаляют в сушильном шкафу в вакууме. Лист загрузки и хроматограммы сохраняется в архиве. Если по данным ТСХ в продуктах обнаружены остатки исходного амина, то продукты растворяют в 300 мкл хлороформа и пропускают через хроматографические колонки. Используют фильтрующие плашки Oros (50 мг силикагеля, что по объему соответствует риске на нижней части колонки).

Лабораторная работа 17. Хроматогрическая очистка полученного продукта

Силикагель загружают с помощью луночного дозатора. Для этого в блок с высверленными полостями засыпают силикагель и разравнивают для равномерного распределения по лункам. Затем отверстия в плашке совмещают с лунками и переворачивают конструкцию. Сорбент равномерно распределяется по 48 (или 96) ячейкам плашки. Вещества вносят на колонки с помощью пипетки. Элюаты собирают в штатив на 48 стеклянных пробирок (по 6 мл), промывают силикагель хлороформом (конечный объем элюата ~3 мл) и анализируют с помощью ТСХ. При необходимости продукты пропускают через силикагель повторно, после чего переносят в заранее взвешенные пробирки. Продукты, требующие препаративной колоночной хроматографии (загрязняющие примеси по Rf выше продукта), собираются отдельно для специальной очистки на стеклянных колонках.

Раздел 3. Жидкофазный параллельный синтез, выполненный на специализированном реакторе параллельного синтеза

Каждому студенту выдается вариант задачи получения четырех целевых соединений IIЕ реакцией восстановительного аминирования одного альдегида и четырьмя различными аминами. Кодировка реагентов и продуктов аналогична приведенной выше (см. таблицу). Реагенты загружаются в соотношении 1:1. Восстановитель берут в трехкратном избытке.

Реактивы и растворители:

1) хлористый метилен, изопропанол, карбонат калия, сульфат натрия безводный, силикагель для хроматографии, запас пластинок силуфола;

2) триацетоксиборгидрид натрия Na[BH(OAc)₃] в качестве восстановителя, безводная щавелевая кислота для осаждения оксалатов;

3) набор вторичных циклических алифатических аминов (от 3—6 до 20) и серия 5-арилфурфуролов (от 4 до 10). Набор подбирается так, чтобы загрузить все 24 сосуда прибора. При выполнении задачи подбирались выборочные сочетания 9 альдегидов и 18 аминов (4 реакции на одного обучаемого, группа 20 человек).

Оборудование

Аппарат SynCore (модули для встряхивания, упаривания, фильтрования) в комплекте с 24 круглодонными пробирками. Ультразвуковая баня (желательно). Металлические штативы-стойки для пробирок с гнездами 3×4 разной высоты. Низкий штатив служит стойкой, и его можно целиком погрузить в ультразвуковую баню. Высокий штатив используется для фильтрования осадков или при пропускании смесей через фильтры со слоем силикагеля. Запас стаканчиков (60—100 мл) и пипеток.

Приобретаемые навыки

В данной задаче студенты знакомятся с аппаратом SynCore, который одновременно является устройством для перемешивания, приспособлением для встряхивания при экстракции, фильтровальным аппаратом для отделения 24 растворов от осушителя и аналогом ротора для упаривания 24 сосудов.

Лабораторная работа 18. Загрузка исходных соединений в реактор параллельного синтеза

1. На каждую пробирку следует наклеить этикетку согласно полученному варианту, например, F-1, F-2, F-3, F-4 (F — выданный вариант, число — номер опыта).

2. В каждую пробирку пипеткой перенести 5 мл раствора альдегида (15 ммоль) в хлористом метилене и затем 2 мл раствора соответствующего амина (15 ммоль) в хлористом метилене. Пробирки поместить в Syncore для встряхивания.

Лабораторная работа 19. Внесение реагентов (восстановителя) в реактор параллельного синтеза

3. В каждую пробирку пипеткой добавить 3 мл суспензии восстановителя (Na[BH(OAc)3]) в хлористом метилене. Для гомогенизации следует на 2—3 мин поместить пробирки в ультразвуковую баню. Затем разместить пробирки в SynСore и включить режим встряхивания. Наилучшие результаты достигаются за 2—3 дня (при 20 °С), в редких случаях для малорастворимых веществ реакция может занимать до 5 дней. Реакционные смеси в конце реакции приобретают консистенцию желатина.

Лабораторная работа 20. Обработка реакционных смесей, высушивание экстрактов в реакторе параллельного синтеза

4. В каждую реакционную пробирку добавить 20 мл 20%-ного водного раствора карбоната калия. Пробирки поместить в SynСore и встряхивать в течение 1 ч. За этот период полностью прекращается выделение водорода. Следует подготовить четыре пустые пробирки с такими же этикетками, как на реакционных пробирках.

5. Из каждой реакционной пробирки пипеткой или шприцом отобрать нижний (органический) слой и перенести его в пустую пробирку. Оставшийся водный слой дважды экстрагировать 10 мл хлористого метилена. Органические слои объединить.

6. К органическому слою добавить безводный Na₂SО₄ в качестве осушителя (присыпать осушитель следует аккуратно, чтобы он не попадал на стенки пробирки). Растворы с осушителем встряхивают 30 мин и оставляют на ночь.

Лабораторная работа 21. Параллельное фильтрование от осушителя и упаривание в реакторе параллельного синтеза

7. Пробирки поместить в реакционный модуль SynСore для фильтрования от осушителя. Четыре чистые пробирки с этикетками поместить в приемный модуль SynСore в строгом соответствии с их расположением в реакционном модуле. Провести параллельное фильтрование и дополнительную промывку осушителя новой порцией растворителя при подключении аппарата к вакуумной системе. На данном этапе студентам демонстрируется эффективная система параллельной очистки и промывки 24 сосудов и фильтров от неорганического осушителя и органических компонент. Полное промывание прибора — пробирок и фильтров — достигается за 40 мин двукратным пропусканием воды (2×30 мл), затем ацетона (2×30 мл). Далее система высушивается в токе азота.

8. Приемный модуль с собранными фильтратами установить на штатив SynСore, герметично накрыть крышкой, подсоединить к вакуумному насосу (Buchi) и упаривать растворитель при встряхивании при температуре 30—35 °С и вакууме на уровне 300 мм.рт.ст. для предотвращения вспенивания.

Лабораторная работа 22. Хроматография, очистка и определение полученных продуктов

9. Поставить хроматограмму полученного остатка, сравнить с исходными альдегидом и амином (элюент СНCl₃/MeOH 8:1 или С₆Н₆/EtOAc 2:1). При наличии в полученном остатке исходных альдегида и(или) амина провести хроматографическую очистку, используя стеклянный фильтр со слоем силикагеля (диаметр 25 мм, высота слоя 30 мм), элюенты — хлороформ, затем смесь CHCl₃ /MeOH 20:1.

10. Продукт восстановительного аминирования может быть дополнительно очищен осаждением его в виде оксалата. Для этого к раствору продукта без примеси исходного амина в ССl₄ (либо к раствору в хлороформе после хроматографической очистки) следует добавить раствор щавелевой кислоты (15 ммоль) в изопропаноле и оставить до выпадения осадка. Осадок отфильтровать через обычный стеклянный фильтр и высушить на воздухе.

11. Подготовить пустые флаконы и наклеить на них этикетки с кодом продукта (список кодов — у преподавателя). Пустые флаконы взвесить. Определить массу продуктов, рассчитать выход. Один из образцов сдать на спектр ПМР.

Раздел 4. Проведение параллельного жидкофазного синтеза с последующим фильтрованием полученных продуктов

В качестве учебной задачи для студенческого практикума используется один из самых простых вариантов реакции Уги — получение производных аминокислот смешением ароматического изоцианида, алифатических кетонов, бензиламинов и фталилглицина (схема). Данный вариант был выбран не случайно, он позволяет провести практическую работу с минимальными подготовительными стадиями, обеспечивает прекрасную воспроизводимость результатов, не требует использования дорогих или опасных реактивов. Использование фталилглицина дает возможность получать труднорастворимые производные, которые легко кристаллизуются и могут быть выделены параллельными методами. В свою очередь ароматические изоцианиды с полярными группами обладают низкой летучестью и отличаются практически полным отсутствием характерного запаха. Бензиламины и алифатические кетоны, которые должны обеспечить разнообразие боковых заместителей, — доступные и относительно недорогие реагенты. Необходимо отметить, что данный практикум разрабатывался для студентов-технологов, и не ставил целью дальнейшие испытания полученных соединений. Поэтому скаффолд, представленный на схеме, не имеет аналогов, проявивших биологическую активность. Для студентов других специальностей (например, медицинская химия) можно изменить целевое соединение, учитывая данные обзора. При этом все методики, приведенные ниже, остаются без изменений.

Практические навыки, получаемые при проведении работы.

В ходе работы студенты используют оборудование для параллельного синтеза: одно- и многоканальные микропипетки, платы для проведения реакций,шейкер. Если студенты ранее не встречались с этим оборудованием, необходимо провести небольшое вводное занятие. Полученные навыки могут быть использованы в отделах микроскейла фармацевтических и химических компаний, а также в любых аналитических лабораториях.

Материалы и приборы. Для проведения лабораторной работы необходимо подготовить следующий набор оборудования:

1. Пластиковые платы с отдельными тубами 8×12 (объем отдельной тубы 1 мл). В качестве примера можно привести платы Micronic или Falcon (рис. 1а). Ячеистые платы, используемые в аналитической химии, менее удобны.

2. Микропипетки фиксированного объема 50 или 100 мкл (как одноканальные, так и многоканальные), а также набор наконечников к ним.

3. Шейкер (может быть использована практически любая модель).

4. Лабораторная центрифуга с «swing-bucket» ротором. Центрифуги с угловым ротором менее удобны.

5. Набор для тонкослойной хроматографии или аналитический хроматограф.

6. Набор посуды для исходных растворов, весы и другое стандартное оборудование лабораторного практикума.

Реактивы. Для загрузки одной платы требуется около 500 мг каждого реагента или группы реагентов.

1. Фталилглицин получают сплавлением эквимолярного количества фталевого ангидрида и глицина в фарфоровой чашке до образования однородной массы, затем кристаллизуют из смеси спирта с водой. Тпл =198 °С.

2. Изоцианид, например, 4-диметиламинофенилизоцианид получают по методике. Суспензию 3,2 ммоль 4-диметиламинонитрозобензола в 40 мл этанола добавляют к раствору 3,2 ммоль 3-фенилизооксазол-5-она (может быть легко синтезирован из бензоилуксусного эфира и гидроксиламина) в 20 мл этанола. Смесь нагревают на водяной бане 15 мин, охлаждают, осадок отфильтровывают. Полученное соединение нагревают в толуоле при 90 °С 30 ч, отгоняют толуол, остаток возгоняют в вакууме при 75 °С. Общий выход 65—70%, Тпл 61 °С.

Этот реактив можно заменить на другие ароматические изоцианиды: 4-морфолинилфенилизоцианид или 2,4-диметоксифенилизоцианид. Преимуществом данных реактивов является высокая активность и отсутствие характерного запаха изоцианидов. 3. Набор замещенных бензиламинов. 4. Набор кетонов. 5. Метанол (если работа с метанолом не допускается,можно использовать смесь ацетонитрил/вода в соотношении 4:1).

Лабораторная работа 23. Загрузка реактивов для проведения многокомпонентной реакции Уги

Каждый студент или группа студентов получает распечатку базы данных, которая соответствует распечатку базы данных, которая соответствует будущей библиотеке. Перед началом работы студенты должны написать уравнение реакций, приводящих к целевой структуре. На коллоквиуме, если он предшествует работе, можно подробно разобрать механизм реакции Уги.

Затем студенты самостоятельно составляют таблицу загрузки исходных соединений, где изоцианид и кислота являются неизменяемыми, а бензиламины и кетоны —изменяемыми параметрами. При этом бензиламины получают цифровое, а кетоны — буквенное обозначение. Следующим этапом является подготовка растворов исходных соединений. Концентрация всех растворов 1 ммоль/мл в метаноле. Всего получается 12 растворов : 1 изоцианида, 1 фталилглицина, 4 кетонов, 6 бензиламинов. Выбор кетонов и бензиламинов должен определяться возможностями каждой конкретной лаборатории.

Далее студенты приступают к загрузке всех исходных реагентов по 0,1 ммоль в платы с помощью микропитеток 100 мкл (50 мкл, если концентрация всех растворов 2 ммоль/мл). Загрузка производится строго в следующем порядке: 1) бензиламины, 2) кетоны,3) изоцианид, 4) фталилглицин. Необходимо отметить, что загружается только часть платы 4×6, причем загрузку лучше начинать от левого верхнего углы (туба А1). Все манипуляции с растворами должны проводиться под тягой. Если у студентов отсутствуют навыки обращения с микропипетками, рекомендуется провести практическое занятие перед тем, как приступать к загрузке реагентов. Полезно замерить время загрузки веществ с помощью многоканальных пипеток, чтобы оценить выигрыш времени по сравнению с традиционными методами. После окончания загрузки платы закрывают, помещают в шейкер и перемешивают при комнатной температуре в течение 20 мин. Студенты должны визуально оценить эффективность перемешивания.

Лабораторная работа 24. Выделение полученных продуктов многокомпонентной реакции Уги

Все целевые соединения при правильной загрузке выпадают в осадок. В зависимости от конкретного набора реактивов, реакция полностью проходит за 4—6 ч. Поэтому второе практическое занятие рекомендуется проводить на следующий день. (Отметим, что длительное выдерживание образцов приводит к снижению выходов.) Перед началом занятия необходимо провести инструктаж по работе с центрифугой, обсудить принципы ее работы. Затем студенты готовят промывную жидкость — этанол/вода (3:1).

Дальнейший ход работы зависит от типа центрифуги, наилучшим вариантом является центрифуга, снабженная специальным ротором для микроплат. Однако можно использовать практически любую модель, которая обеспечивает скорость вращения 3000—4000 об/мин. Влажные осадки в плате помещают в сушильный шкаф (< 50 °С) и выдерживают 5—6 ч.

Лабораторная работа 25. Установление строения полученных продуктов многокомпонентной реакции Уги

При правильном проведении всех предыдущих операций чистота всех продуктов превышает 90%. Так как реакция во всех случаях протекает достаточно полно, выходы продуктов зависят, прежде всего, от их растворимости в промывной жидкости. Параллельная жидкофазная технология, представленная в этом примере, предусматривает одинаковые методики для выделения всех целевых соединений, что обеспечивает высокие скорости выделения, но не позволяет достигать максимальных выходов.

Студенты взвешивают осадки и определяют выходы целевых соединений, которые должны лежать в пределах 40—80%. Затем студенты проводят анализ целевых соединений с помощью тонкослойной хроматографии (можно использовать аналитический хроматограф). Для ТСХ анализа образец каждого продукта растворяют в хлороформе, наносят на пластину и помещают в систему CHCl₃/этанол (95:5). Хроматограммы наблюдают в лучах УФ лампы, записывают значение Rf. Полноту протекания реакции оценивают по наличию или отсутствию пятна изоцианида. В качестве реперов могут быть использованы образцы, синтезированные предыдущей группой студентов. Более полный анализ примесей проводят с помощью ПМР спектроскопии. Более низкие выходы отмечаются для соединений, содержащих полярные группы, например 3-пиридинил или 4-метоксифенил.

Проведенные исследования показывают, что часть целевого соединения удаляется вместе с промывной жидкостью. Соотношение вода/этанол в промывной жидкости влияет на выходы и чистоту получаемого соединения. При оптимизации задачи можно изменить это соотношение, для каждого ряда добиваясь высоких выходов. Для соединений, полученных студентами, снимают ПМР спектры. Дополнительные методы очистки не используют.

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Дальневосточный федеральный университет»

(ДВФУ)
ШКОЛА ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК ДВФУ

МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ОРГАНИЗАЦИИ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ

по дисциплине «Медицинская химия»

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

	Учебно-методический комплекс дисциплины социальная психология специальность 020101. 65 «Химия» Учебно-методический комплекс составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального...		Учебно-методический комплекс дисциплины компьютерный практикум 010707.... Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего профессионального...
	Учебно-методический комплекс дисциплины «организационное поведение» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего...		Учебно-методический комплекс дисциплины «Торговое оборудование» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего...
	Учебно-методический комплекс дисциплины «Русский язык и культура речи» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего...		Учебно-методический комплекс дисциплины «Системное программное обеспечение» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального...
	Учебно-методический комплекс дисциплины Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального...		Учебно-методический комплекс дисциплины обсужден на заседании кафедры... Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального...
	Учебно-методический комплекс дисциплины Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального...		Учебно-методический комплекс дисциплины архитектура ЭВМ 090104. 65... Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального...
	Учебно-методический комплекс дисциплины «коммерческое право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего...		Учебно-методический комплекс дисциплины «Таможенное право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего...
	Учебно-методический комплекс дисциплины «римское право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего...		Учебно-методический комплекс дисциплины «иностранный язык по специальности» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего...
	Учебно-методический комплекс дисциплины «право интеллектуальной собственности» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего...		Учебно-методический комплекс дисциплины «Технология формирования имиджа» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального...

Учебно-методический комплекс дисциплины «Медицинская химия»

Специальность — 020100.65, химия

Похожие: