Лечебно-профилактическая эффективность антибака при аэромонозе, псевдомонозе и флексибактериозе рыб
|
Скачать 1.69 Mb.
|
|
3. Препараты фторхинолонового ряда и их характеристика Начиная с 80-х годов ХХ века многочисленные фармацевтические компании акцентировали свой выбор на группу синтетических химиотерапевтических средств - производных 6-фтор-4-хинолон-3-карбоновой кислоты, в дальнейшем получивших название фторхинолоны. Они в полной мере оказались соединениями, отвечающими требованиям, предъявляемым к новым антимикробным препаратам: широкий спектр с преимущественной антибактериальной активностью, общерезорбтивное действие и фармакокинетика, обеспечивающая высокую степень биодоступности, хорошее проникновение в органы, ткани, биологические жидкости и в клетки. К концу ХХ столетия в медицине фторхинолоны заняли одно из ведущих мест среди антимикробных средств для лечения взрослых больных и прочно зарекомендовали себя как высокоактивные препараты с широким диапазоном показаний к применению для лечения различных инфекционных заболеваний и гнойно-воспалительных процессов в неинфекционной клинике (Е.Н. Падейская, 1994; 1998; Е.Н. Падейская, В.П. Яковлев, 1995; The Quin., 1988; The New Gen. of Quin., 1990; Quin. Antimicrob. Agents, 1993). Термин фторхинолоны отражает две основные особенности химического строения этих препаратов: принадлежность к классу хинолонов и наличие в молекуле атома фтора в положении 6 цикла гетероциклической системы хинолона или аналога. В структуре каждого соединения присутствует очень важный для проявления антимикробной активности фрагмент пиридона – шестичленный цикл с кето-группой в положении 3 цикла (В. Буш и др., 1993; D.T.W. Chu, P.B. Fernandes, 1989; Y. Asahi, T. Ishizak, 1992; A. Brysker, J.-F. Chantot, 1995). Важнейшие фармакокинетические свойства этих соединений наряду с высокой антимикробной активностью обеспечиваются не только фторированием в положении 6, но и одновременно наличием пиперазинильного радикала или его аналога в положении 7 цикла. Это позволило получить соединения с широким антибактериальным спектром, включающим не только бактерии, но и хламидии, микобактерии, риккетсии, боррелии. Наиболее широкое применение в клинической практике за рубежом и в нашей стране получили: из бициклических монофторхинолонов (содержат один атом фтора в положении 6 цикла) – пефлоксацин, норфлоксацин и ципрофлоксацин; из трициклических – офлоксацин, а также относящийся к дифторхинолонам – ломефлоксацин (Е.Н. Падейская, В.П. Яковлев, 1998). В настоящее время зарегистрированные в Российской Федерации фторхинолоны подразделяются на препараты первого (пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, ломефлоксацин, норфлоксацин) и второго поколения (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин) (С.В. Яковлев, 2001). Фторхинолоны относятся к антимикробным препаратам с бактерицидным типом действия за счет ингибирования ДНК-гиразы, ключевого фермента бактериальной клетки, ответственного за процесс нормального биосинтеза ДНК, при этом характеризуются высокой бактерицидной активностью. Бактерицидный эффект проявляется на уровне минимальных подавляющих концентраций (МПК) или при концентрациях в 2 – 4 раза превышающих МПК, реже в более высоких концентрациях. Наиболее высокую активность все препараты проявляют в отношении нейссерий, гемофильных палочек, моракселл и аэромонад, а затем – в отношении различных представителей энтеробактерий и легионелл (Е.Н. Падейская, В.П. Яковлев, 1998). Механизм действия хинолонов оказалось возможным установить после 1974 – 1976 г. г., когда была выделена ДНК-гираза – фермент, субъединицы которого катализируют и обеспечивают строго определенные этапы в процессе формирования необходимой укладки ДНК в хромосоме бактерий для подготовки ДНК к процессу репликации (Н.И. Фадеева и др., 1993; D.C. Hooper, J.S. Wolfson, 1993; L.J.V. Piddock et al., 1990; L.L. Shen, 1993; J.T. Smith, C.S. Lewin, 1988). ДНК-гираза бактерий избирательно высоко чувствительна к хинолонам, особенно к фторхинолонам. В результате образования комплекса хинолона (фторхинолона) с ДНК и одной из субъединиц ДНК-гиразы нарушается функция фермента и не осуществляется процесс суперспирализации, что приводит к нарушению деления, бактериостазу и к быстрой гибели клетки, т. е. к бактерицидному эффекту. Высокую бактерицидную активность фторхинолонов связывают с ингибированием не только ДНК-гиразы, но и ее гомолога – топоизомеразы IV (K. Drilca, X. Zhao, 1997). Причем в грамотрицательных бактериях первичной мишенью является ДНК-гираза, а вторичной – топоизомераза IV, которая в грамотрицательных микроорганизмах менее чувствительна к фторхинолонам. В грамположительных бактериях, наоборот, топоизомераза IV является первичной мишенью. Суббактериостатические концентрации фторхинолонов оказывают повреждающее действие на микробную клетку. При этом снижаются адгезивные свойства бактерий, возможно подавление выработки экзотоксинов и экзоферментов, снижение вирулентных свойств в экспериментах как in vitro, так и in vivo (В. Буш и др., 1993; P.A. Todd, D. Faulds, 1991; A.N. Wadworth, K.L. Goa, 1991). Хинолоны более интенсивно, чем большинство других антибиотиков, проникают в макрофаги и гранулоциты и, следовательно, эффективны для лечения болезней, возбудители которых выживают в фагоцитах (Соврем. микробиол. Прокариоты, 2005). Многие авторы считают, что антибиотики могут угнетающе действовать на процессы иммуногенеза и выступать в роли иммунодепрессантов. Однако во многих случаях антибактериальные препараты, как и большинство других ксенобиотиков, оказывают на иммунитет дозозависимый эффект. Б.В. Виолин с сотр. (2001) сообщают, что фторхинолоны, особенно энрофлоксацин и ципрофлоксацин, в терапевтической дозе повышали фагоцитоз и внутриклеточный киллинг микроорганизмов, а также стимулировали синтез иммуноглобулинов классов G, M и А. Развитие резистентности бактерий в первую очередь связано с мутациями ДНК-гиразы, приводящими к снижению чувствительности фермента к фторхинолонам. Еще одной причиной может быть снижение проницаемости внешней мембраны бактерий в связи с повреждением проницаемости пориновых каналов или нарушение проницаемости липополисахаридного слоя. Это приводит к снижению проникновения не только фторхинолонов внутрь клетки, но и других антибактериальных препаратов, что может быть причиной развития перекрестной устойчивости (С.В. Сидоренко и др., 1996; L.J.V. Piddock, 1995; 1997; H. Yoshida, 1995). Также установлена возможность развития резистентности к фторхинолонам по типу плазмидной. Выделены плазмиды, несущие ген резистентности к нескольких препаратам, включая фторхинолоны. Этим объясняется перекрестная устойчивость бактерий в пределах нескольких классов антибиотических веществ (Е.Н. Падейская, В.П. Яковлев, 1998). Несмотря на то, что частота спонтанных мутаций, обусловливающих устойчивость к фторхинолонам, очень низкая – 10-9 - 10-11, в эксперименте в результате последовательных пассажей на средах с возрастающими концентрациями препарата удается достаточно быстро получить резистентные варианты. На клинических штаммах E. coli, P. aeruginosa и Proteus изучалась способность индуцировать их устойчивость в присутствии субтормозящих концентраций ципрофлоксацина. В результате МПК ципрофлоксацина, офлоксацина, норфлоксацина и налидиксовой кислоты для всех культур in vitro повысились, но не выше, чем в 10 раз в сравнении с МПК дикого штамма (S. Esposito, S. Noviello, 1991). Принципиальным отличием фторхинолонов от нефторированных препаратов является достаточно медленное развитие у них резистентности. Английские исследователи K.D. Culshaw и G.S. Tillotson (1991) на протяжении 4 лет изучали более 30 тыс. штаммов E. сoli, более 5 тыс. штаммов P. аeruginosa, 15 тыс. штаммов энтеробактерий и 2 тыс. штаммов H. Influenzae. Несмотря на резкое возрастание частоты применения ципрофлоксацина, чувствительность к нему изучаемых штаммов бактерий изменилась незначительно. Считается, что резистентность у клинических штаммов бактерий чаще развивается у видов, относительно менее чувствительных к фторхинолонам (S. aureus, P. aeruginosa, S. pneumoniae и др.) in vitro по сравнению с большинством более чувствительных грамотрицательных бактерий. К числу наиболее активных фторхинолонов по действию на большинство грамотрицательных аэробных бактерий, обладая одновременно высокой активностью в отношении стафилококков, является ципрофлоксацин. Препарат разработан фирмой «Bayer» (Германия), представляет собой 1-циклопропил-6-фтор-1,4-дигидро-4-оксо-7(1-пиперазинил)-3-хинолон-карбоновую кислоту.  Рис. 1. Химическое строение ципрофлоксацина. Являясь наиболее активным ингибитором ДНК-гиразы, ципрофлоксацин оказывает бактерицидное действие на размножающиеся и покоящиеся клетки преимущественно грамотрицательных бактерий, и характеризуется более длительным постантибиотическим эффектом. В отличие от других фторхинолонов ципрофлоксацин обладает преимуществом в отношении псевдомонад, для которых МПК составляют 0,016 – 2,0 мг/л, а также является наиболее активным по действию на большинство штаммов P. аeruginosa (Е.Н. Падейская, В.П. Яковлев, 1998; Quinolone Antimicrob., 1993). В организме человека ципрофлоксацин наиболее быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта, достигая максимальных концентраций в крови через 1 – 1,5 часа. Препарат метаболизирует в организме в основном путем биотрансформации пиперазинового кольца в седьмом положении. При этом образуется 4 метаболита, обладающие антибактериальным действием: дезэтил-, сульфо-, оксо- и формил-ципрофлоксацин (В.П. Яковлев, 1993). Опыты на собаках показали, что препарат из тканей выводится значительно медленнее: период полувыведения из тканевой жидкости после однократной дозы составлял 17 – 20 часов, а из крови – 4 – 4,5 часа (C.E. Green, S.C. Budsberg, 1993). Опыты на экспериментальных животных (мышах, крысах, кроликах, собаках) показали, что фторхинолоны являются относительно малотоксичными соединениями. Препараты, рекомендованные для медицинского применения, не проявляют канцерогенной и тератогенной активности, не оказывают мутагенного действия на клетки эукариотов. Отсутствие токсических эффектов при лечении инфекций у человека и животных объясняется тем, что фермент топоизомераза II эукариотов не катализирует в хромосомах человека процесс суперспирализации ДНК и отличается очень низкой чувствительностью к действию фторхинолонов (K. Hoshino et al., 1989; 1991; R.C. Moellering, 1995; K. Sato et al., 1989). В экспериментах на крысах показано, что ципрофлоксацин в высоких дозах при щелочной реакции мочи может вызывать образование кристаллов, представляющих собой нерастворимые комплексы фторхинолона и его метаболитов с солями магния и белком (P.S. Lietman, 1995; R. Stahlmann, H. Lode, 1988; A.P.R. Wilson, R.N. Grüneberg, 1997). Применение высоких доз фторхинолонов в эксперименте (до 20 – 60 мг/кг в сутки) может оказывать супрессивное действие на гемопоэз человека, которое является кратковременным и обратимым. Медицинская практика показывает, что эти препараты являются безопасными для лечения и профилактики инфекций у больных с заболеваниями гемопоэтической системы (Е.Н. Падейская, В.П. Яковлев, 1995). 3.1. Применение фторхинолонов при бактериальных болезнях сельскохозяйственных животных и рыб В условиях интенсивного животноводства, когда длительное применение традиционных антибиотиков способствовало появлению устойчивых ассоциаций бактерий, возникла потребность в более эффективных и удобных для групповых обработок химиотерапевтических средствах. В 1990-е годы в России были впервые проведены опыты по внедрению в ветеринарную практику фторхинолонов на основе энрофлоксацина, обладающего широким спектром антимикробной активности в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, а также некоторых видов анаэробных патогенных бактерий и микоплазм. Аналоги данного препарата, производимого разными зарубежными фирмами, известны под названиями байтрил, энроксил, энрофлон, дадтрил. Они оказались эффективными лечебными препаратами при респираторных и желудочно-кишечных заболеваниях животных (А.В. Голиков и др., 1994; В.Ф. Ковалев и др., 1996; Е.М. Сазонова и др., 1998; А.А. Климов, 2004). Также были испытаны другие фторхинолоны. Флумеквин - фторированный аналог офлоксацина, не содержащий пиперазинильного заместителя в положении 7, применялся для лечения респираторных и желудочно-кишечных заболеваний свиней, телят, овец, птицы, а также различных инфекций мочеполовых путей с.-х. животных. Квинабик показал эффективность при лечении бронхопневмоний свиней и телят (В.Ф. Ковалев и др., 1996). Абактан использовался в хозяйствах, неблагополучных по колибактериозу, сальмонеллезу, отечной болезни, паратифу, гемофилезу, гастроэнтериту и дизентерии. При этом регистрировалось снижение отхода телят, поросят, щенят и цыплят в 1,5 – 5,6 раза (А.В. Киселев и др., 1998). Политрил рекомендован для применения в птицеводстве, а также для широкого производственного испытания при диспепсии телят (Н.Н. Олейник, 2003; Р.Т. Маннапова и др., 2002). Однако несмотря на то, что фторхинолоны характеризуются отличными фармакокинетическими свойствами и низким уровнем токсичности, применение их в ветеринарии ограничено из-за высокой стоимости и отсутствия их производства в нашей стране. В последнее время за рубежом увеличивается количество синтетических антибактериальных препаратов, в том числе фторхинолонов, рекомендуемых для аквакультуры. В Германии и Франции в 1990-е годы для лечения бактериальных инфекций рыб применялся в основном флумеквин. При продолжительности лечебного курса 6 – 7 дней смертность рыб снижалась уже на 4 – 5 день после начала лечения. Высокими антибактериальными свойствами обладал энрофлоксацин, что подтверждено экспериментально на лососевых рыбах, пораженных А. salmonicida, при введении им 10 мг/кг в течение 10 дней (P.R. Bowser a. o., 1990). В.Н. Воронин и Е.В. Кузнецова (2003) считают, что в силу существенных недостатков левомицетина и тетрациклина им на смену должны придти, либо чередоваться с ними высокоэффективные фторхинолоны (флубактин и энрофлоксацин). Польские исследователи определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) 22-х антимикробных препаратов для A. hydrophila и A. sobria, выделенных от карпов методом разведения на агаре Мюллера – Хинтона. Наиболее активным оказался энрофлоксацин, для которого МПК90 составила 0,25 мг/л (L. Guz, A. Kozinska, 2004). Высокую лечебно-профилактическую эффективность показал в опытах на угрях и белых амурах препарат «Энротим-10», действующим веществом которого также послужил энрофлоксацин (Э.К. Скурат и др., 2005). Антибиотик вводили перорально при помощи катетера одновременно с заражением вирулентными аэромонадами и на 2 – 3 сутки после заражения при появлении признаков болезни. В нашей стране с недавнего времени стал применяться для борьбы с бактериальными болезнями рыб новый антибактериальный препарат «Антибак» на основе ципрофлоксацина, разработанный научно-внедренческим центром «Агроветзащита». Препарат защищен патентом РФ и внесен в «Кадастр лечебных препаратов, используемых и апробированных в аквакультуре России и за рубежом» (П.П. Головин и др., 2005). Впервые 2 модификации – Антибак 100 и Антибак 500 были испытаны в крупных рыбоводных хозяйствах «Черепетском» Тульской области и «Клинском» Московской области, где показали высокую терапевтическую активность при лечении карпа, пораженного аэромонозом и псевдомонозом (К.О. Ярошевич, 2003; Л.И. Грищенко, В.Г. Енгашев, Л.Н. Юхименко, 2003; В.Г. Енгашев и др., 2005). Сравнительное изучение антибактериальной активности и широты спектра действия окситетрациклина, бактопура и Антибака выявило явное преимущество последнего. Применение при аэромонадной инфекции у декоративных карпов кои подтвердило его высокую лечебную и профилактическую эффективность (В.Г. Енгашев, В.Н. Дементьев, 2005; К.В. Гаврилин и др., 2005). Выделенные культуры A. hydrophila от 12 видов заболевших прудовых и декоративных рыб в Шри-Ланке оказались высокочувствительными к норфлоксацину и флумихину. При этом все изоляты аэромонад были устойчивы к тетрациклину, триметоприму, сульфаметаксазолу, стрептомицину (D.C. Hettiarachchi, C.H. Cheong, 1994). Изучение фармакокинетики некоторых фторхинолонов показало, что они быстро всасываются и сохраняются в организме рыб на бактериостатическом уровне в несколько раз дольше, чем у теплокровных животных и человека. G. Lewbart et al. (1997) установил, что максимальная концентрация энрофлоксацина в плазме крови Colossoma brachypomum через несколько часов после внутримышечного, перорального введения и обработки рыб в растворе препарата составила: 1,64; 0,94; 0,17 мкг/мл соответственно. Через 48 – 72 часа после внутримышечного введения и обработки в растворе средняя плазменная концентрация энрофлоксацина была значительно выше МПК для большинства грамотрицательных патогенов рыб. При этом был обнаружен ципрофлоксацин как активный метаболит энрофлоксацина. J.F.M. Nouws et al. (1988) проводил исследование фармакокинетики ципрофлоксацина в организме карпа, африканского сома и радужной форели при внутривенном и внутримышечном введениях в дозе 15 мг/кг. Препарат сохранялся в организме рыб на терапевтическом уровне 2 – 5 суток. После внутримышечного введения максимальные концентрации в плазме крови у карпа и форели были достигнуты через 1 час и составили 3,49 и 2,37 мкг/мл соответственно. Период полураспада при внутривенном введении у 3-х видов рыб оказался на уровне 14 часов, а при внутримышечном введении у карпа – 20 часов, у форели – 23 часа, в то время как у человека, свиней и телят этот показатель составлял 2,5 – 5 часов. Японскими учеными (R. Palmer, K. Kawai, R. Kusuda, 1992) установлено, что новые хинолоны, особенно офлоксацин, ципрофлоксацин, тозуфлоксацин проявляли in vitro более высокую активность, не только в отношении грамотрицательных патогенов рыб, но и в отношении некоторых штаммов грамположительных бактерий, устойчивых к ранним хинолонам (флумихину, оксолиновой, налидиксовой, пиромидиновой кислотам, милоксацину). Причем на активность новых хинолонов меньше влияли сыворотка, рН или добавление Mg, чем на таковую ранних хинолонов. Бактерии рода Aeromonas, выделенные из разных источников, в том числе из рыбы, могут значительно различаться по чувствительности к антибиотикам. Так, результаты исследований, полученные мексиканскими исследователями (G. Castro-Escarpulli et al., 2003) свидетельствуют, что наилучшим антибактериальным эффектом против аэромонад, изолированных от замороженной товарной тиляпии Oreochromis niloticus niloticus, обладали хинолоны первого поколения (налидиксовая кислота). В отличие от ципрофлоксацина, к которому число чувствительных культур составило всего 41,5%, к налидиксовой кислоте оказались чувствительными 100% выделенных культур. Другие авторы сообщают, что 100% аэромонад (A.hydrophila, A. cavia, A. sobria), выделенных из внешней среды и от человека, чувствительны к ципрофлоксацину, а также к цефалоспоринам II и III поколения (P. Kämpfer et al., 1999; J. Vila et al., 2002). Несмотря на активное применение в рыбоводстве фторхинолоновых препаратов за рубежом и перспективу внедрения их в России до сих пор остаются недостаточно изученными фармакологические свойства ципрофлоксацина при бактериальных болезнях рыб. Это послужило для нас основанием провести максимально полное изучение препарата Антибак в экспериментальных и производственных условиях, дать оценку его лечебно-профилактической эффективности при аэромонозе, псевдомонозе и флексибактериозе рыб и безопасности применения в рыбоводстве. II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Материал и методы Работа выполнена в 2002 – 2009 г.г. на кафедре пчеловодства, рыбоводства, болезней пчел и рыб МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, рыбхозе «Клинский» Московской обл., Новомичуринском рыбхозе Рязанской обл., частично в ООО «Русская рыбалка», рыболовно-спортивном комплексе «Ромашково». Изучение лечебно-профилактической эффективности и безопасности препаратов серии Антибак проводили согласно методикам и требованиям по испытанию и стандартизации лекарственных средств для животных, предъявляемым к новым лекарственным средствам с учетом особенностей рыб как водных пойкилотермных животных. Исследования включали в себя следующие этапы (рис. 1.):
В лабораторных опытах использовали 865 сеголеток карпа. Производственная проверка проведена на 411000 двух-, трех- и четырехлетках карпа, 20000 сеголетках радужной форели, 15000 мальках и сеголетках сибирского осетра. В качестве испытуемых лекарственных средств использовали готовые лекарственные формы антибактериальных препаратов Антибак 100, Антибак Определение лечебно-профилактической эффективности препаратов в лабораторных и производственных условиях  Рис. 2. Схема исследований и постановки опытов 500 и Антибак 250, любезно предоставленные в наше распоряжение Научно-внедренческим центром «Агроветзащита». Действующим веществом обоих препаратов является ципрофлоксацин. Антибак 100 представляет собой нерастворимый в воде порошок, содержащий в 1 г 100 мг действующего вещества ципрофлоксацина гидрохлорида моногидрата и вспомогательный компонент лигносульфонат. Препарат предназначен для перорального применения с комбикормом. Антибак 500 – растворимый в воде порошок, содержащий в 1 г 500 мг действующего вещества ципрофлоксацина гидрохлорида в форме лактата, а также вспомогательный компонент лактозу. Он применялся в форме лечебного раствора наружно и внутрибрюшинно. Антибак 250 – растворимая в воде таблетированная форма, содержащая в 1 г 250 мг субстанции ципрофлоксацина, использовался только в виде лечебного раствора. Для бактериологических исследований использовали 178 рыб из неблагополучных по аэромонозу прудовых хозяйств – ЗАО «Рыбхоз Клинский» и ООО «Русская рыбалка», по псевдомонозу из рыболовно-спортивного комплекса «Ромашково» (Московская обл.), по флексибактериозу из тепловодного хозяйства – Новомичуринского рыбхоза (Рязанская обл.). При аэромонозе и псевдомонозе отбирали карпов с острой септической, подострой септико-язвенной и хронической язвенной формами болезней. При флексибактериозе отбирали форель и сибирского осетра с кожными и жаберными поражениями. С целью выделения возбудителей аэромоноза и определения микробного пейзажа проводили эпизоотологическое обследование и бактериологическое исследование в «Рыбхозе Клинский» с июня по сентябрь 2002 года с периодичностью 1 раз в 14 дней в нагульных прудах №1, 2 Владимирского, №2, 3, 4 Дятловского и №1, 3, 4 Яузского участков. В Новомичуринском рыбхозе с марта по октябрь 2003 года проводились периодические исследования по диагностике флексибактериоза среди сеголеток форели, мальков и сеголеток сибирского осетра: в марте, апреле, мае, заключительное – в октябре. Выделение возбудителей аэромоноза, псевдомоноза и флексибактериоза и их идентификацию проводили по схеме, принятой в ихтиопатологии (В.А. Мусселиус и др., 1983; Сб. инстр. по борьбе с бол. рыб, 1998; Л.И. Грищенко и др., 1999). Первичные посевы из крови, асцитной жидкости, печени, почек, селезенки осуществляли на чашки Петри с агаром Эндо и инкубировали в термостате при температуре 26 - 28ºС в течение 48 часов. Полученные изолированные колонии отсевали на скошенный МПА для получения чистой культуры и инкубировали при той же температуре 18 – 20 часов. Групповую дифференциацию выделенных бактерий проводили с использованием окраски по Граму классическим методом и синькой Леффлера. Для определения оксидазной активности применяли диметил-парафенилендиамина дигидрохлорид. Культуры пересевали в пробирки со средой Хью-Лейфсона с целью определения родовой принадлежности бактерий по ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях. Биохимические свойства аэромонад и энтеробактерий изучали на пластинах биохимических дифференцирующих энтеробактерии (ПБДЭ). Для типирования бактерий до вида использовали таблицы и схемы, изложенные в «Определителе бактерий Берджи» (1997), «Определителе зоопатогенных микроорганизмов» (под ред. М.А. Сидорова, 1995), «Медицинской микробиологии» (под ред. В.И. Покровского, 1999) и Методических указаниях по лабораторной диагностике псевдомонозов рыб, утвержденных Департаментом ветеринарии, 1998 (в Сб. инстр. по борьбе с бол. рыб, 1998). Для определения патогенности выделенных культур ставили биопробы на сеголетках карпа массой 25 – 30 г, завезенных из благополучного по бактериальным болезням хозяйства. Предварительно готовили 2х-суточную культуру на скошенном МПА. Затем делали смыв стерильным физиологическим раствором, доводя концентрацию микробных тел по оптическому стандарту мутности до 10 ед. (1 млрд. м. т./мл). Полученную взвесь вводили рыбам внутрибрюшинно в количестве 0,2 мл (200 млн. м. т.). Контролем служили группы рыб, которым вводили в той же дозе стерильный физраствор. Рыб содержали в ваннах объемом 180 л при температуре 18 - 21ºС. Наблюдение за рыбами вели 10 дней. Полученные результаты оценивали положительно при наличии характерных клинических признаков заболевания, патологоанатомических изменений, смертности не менее 50% рыб и выделению исходного возбудителя от больных и погибших рыб (А.И. Канаев, 1971; Инструкция по борьбе с аэромонозом карповых рыб, 1998 в Сб. инстр. по борьбе с бол. рыб, 1998). Чувствительность аэромонад, псевдомонад и флексибактерий к фторхинолоновым препаратам определяли методами диффузии в агар и серийных разведений в жидкой питательной среде (В.С. Дмитриева, С.М. Семенов, 1965; М.О. Биргер и др., 1973). Метод диффузии в агар использовали для сравнительного определения чувствительности к ципрофлоксацину, энрофлоксацину и норфлоксацину штаммов аэромонад A. sobria «Кл-152», A. hydrophila «Кл-222», A. schubertii «ХК-5» и псевдомонад Pseudomonas sp. – «Кл-3», «Кл-39», «Кл-241», выделенных от условно здоровых и больных карпов. Стандартные чашки Петри заполняли МПА, приготовленным на 1,5%-ном агаре Хоттингера рН 7,0 – 7,4 с содержанием не менее 100 мг% аминного азота, слоем в 4 – 5 мм. После застывания агар подсушивали в термостате при температуре 37ºС в течение 20 минут. Предварительно высевали на скошенный МПА соответствующие культуры бактерий и инкубировали 18 – 20 часов при температуре 28ºС. На поверхность агара наносили 1 мл смыва испытуемой культуры с концентрацией 1млрд. м. т./мл физраствора, равномерно распределяли, избыток суспензии удаляли пипеткой, а чашки подсушивали в термостате. В каждой чашке с агаром стерильным щупом пробивали по 3 лунки и в каждую вносили дозатором по 0,1 мл раствора, содержащего 1 мкг ДВ/мл исследуемого препарата, после чего инкубировали в термостате 18 – 20 часов при температуре 28ºС. Результаты оценивали путем измерения диаметра зоны задержки роста бактерий для каждого препарата. Метод серийных разведений в МПБ применялся для определения бактериостатической и бактерицидной концентраций ципрофлоксацина в отношении аэромонад и псевдомонад, выделенных от клинически больных карпов, осетров, форели. Для приготовления серийных разведений использовали основной раствор ципрофлоксацина, содержащий 1 мг д. в. в 1 мл раствора. Культуры бактерий, проверяемые на чувствительность к препарату, выращивали на МПА 18 – 24 часа, готовили взвесь, эквивалентную 1млрд. м. т./мл. В штатив устанавливали 12 пробирок и в каждую наливали по 2 мл бульона. В первую пробирку вносили 2 мл основного раствора препарата, взбалтывали и затем последовательно переносили 2 мл жидкости из первой пробирки во вторую, после этого 2 мл смеси из второй пробирки – в третью и т. д. до одиннадцатой пробирки включительно. Из одиннадцатой лишние 2 мл взвеси удаляли. Таким образом, каждая последующая пробирка содержала в 2 раза меньше препарата, чем предыдущая. Контролем служила 12-я пробирка, не содержащая ципрофлоксацина. Затем в каждую пробирку вносили по 0,2 мл суспензии бактерий концентрацией 1 млн. м. т./мл. Посевы инкубировали при 28ºС 18 – 24 часа. За бактериостатическую или минимальную подавляющую рост микроорганизма концентрацию (МПК) принимали наименьшую концентрацию препарата, при которой отсутствовал рост микроорганизма. Для определения бактерицидной концентрации препарата из пробирок с отсутствием видимого роста производили высевы на МПА. Из каждой пробирки брали по 0,05 мл содержимого, тщательно смешивали с 15 мл расплавленного и охлажденного до 42ºС агара и выливали в чашки. Количество выросших колоний учитывали через 48 часов инкубирования в термостате. За наименьшую бактерицидную концентрацию принимали концентрацию препарата в той пробирке, посевы из которой не давали роста на МПА или давали рост единичных колоний. Изучение фармакокинетики ципрофлоксацина в организме сеголеток карпа проводили методом диффузии в агар (В.С. Дмитриева, С.М. Семенов, 1965; М.О. Биргер и др., 1973). В качестве тест-микроба использовали штамм Bacillus subtilis АТСС 6633, полученную во «Всероссийском государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»). Тест-культуру выращивали 18 – 20 часов при температуре 37ºС на скошенном агаре. Делали смыв физраствором и готовили взвесь с концентрацией 5 ед. по оптическому стандарту мутности. Для получения микробного газона на поверхность МПА в чашки Петри вносили по 0,1 мл полученной микробной взвеси и равномерно распределяли шпателем. Через 20 – 30 минут в агаре с помощью трафарета стерильным щупом пробивали по 6 лунок диаметром 8 мм. Основной раствор стандарта готовили путем растворения 1 мг д. в. ципрофлоксацина в 1 мл дистиллированной воды. Из раствора, содержащего 10 мкг/мл ципрофлоксацина готовили 17 растворов, содержащих от 10 до 0,1 мкг/мл испытуемого вещества. С помощью стандартной капельницы в каждую лунку вносили по 0,1 мл приготовленных растворов стандарта (по 2 чашки на каждую концентрацию). Чашки выдерживали в термостате 18 – 20 часов при 37ºС, после чего при помощи линейки и циркуля измеряли зоны задержки роста тест-микроба. Таким образом, для каждой концентрации стандарта вычисляли среднее арифметическое значение из 12 показателей. По полученным значениям строили стандартную кривую на полулогарифмической сетке. По ней определяли концентрацию и распределение ципрофлоксацина в организме карпов после введения препарата разными способами. Вначале у рыб, которым не вводили препарат, подвергали исследованию кровь и внутренние органы на наличие ингибиторов, способных подавлять рост тест-культуры, тем же методом и с тем же тест-микробом. Для перорального применения Антибак 100 смешивали с водой с таким расчетом, чтобы концентрация действующего вещества препарата в 1 мл соответствовала испытуемым дозам 20 мг/кг и 100 мг/кг живой массы рыб. Суспензии вводили в передний отдел кишечника однократно с помощью зонда, присоединенного к шприцу в количестве 1 мл на сеголетка карпа. Для внутрибрюшинного применения Антибак 500 растворяли в дистиллированной воде и вводили рыбам однократно с помощью шприца под брюшной плавник в 3-х дозах по д. в.: 2,5; 5; 10 мг/кг живой массы рыб. При наружном применении рыб помещали в раствор Антибака 500 с концентрацией 25 мг/л. Содержание препарата определяли после однократной 5-ти часовой обработки и ежедневной обработки рыб в течение 5 дней подряд с той же экспозицией. Опыты ставили на сеголетках карпа массой 15 – 25 г в бытовых ваннах на дехлорированной водопроводной воде, отвечающей рыбоводным требованиям, при температуре 18 - 21ºС. В каждой опытной группе исследовали не менее 6 экз. рыб. Концентрацию ципрофлоксацина определяли через 1, 2, 3, 4, 5, 24 часа после введения препарата, а затем ежедневно до получения отрицательного результата. С этой целью отбирали по 3 рыбы для приготовления смешанной пробы. Предварительно засевали чашки Петри с МПА тест-культурой вышеописанным методом и пробивали по 6 лунок. Кровь брали пастеровской пипеткой из сердца, помещали в стерильные пробирки. После отстаивания сыворотку крови вносили в 2 лунки по 0,1 мл. К смешанным пробам паренхиматозных органов (печени, почек, селезенки), а также пробам мышц и кишечника с его содержимым добавляли дистиллированную воду в соотношении 1:1 и растирали в ступке с песком. Полученную взвесь каждой пробы вносили также в 2 лунки по 0,1 мл для расчета средней зоны задержки роста тест-культуры по 2-м значениям. Инкубацию проводили 18 – 20 ч. при 37ºС. Изучение токсического действия препарата проводили на сеголетках карпа в острых опытах при температуре воды 20ºС путем внутрибрюшинного и перорального введения ципрофлоксацина, содержащего 100% действующего вещества. Для внутрибрюшинного введения препарат растворяли в водопроводной кипяченой воде и вводили однократно в дозах по д. в.: 200, 500, 1000, 1500 мг/кг живой массы рыб. Контрольным рыбам вводили водопроводную кипяченую воду без препарата. Для перорального введения препарат сначала растворяли в воде при нагревании до 90 - 100ºС, затем добавляли 2%-ный раствор крахмала. Полученную суспензию вводили через зонд с помощью шприца в дозах по д. в.: 1000, 2000, 2500, 3000 мг/кг. Каждую дозу вводили 1 раз в сутки 3 дня подряд. Контрольным рыбам вводили 2%-ный крахмальный клейстер. Длительность опытов составляла 6 суток. В конце опытов дополнительно брали кровь из сердца, вырезали кусочки органов для гистологических исследований. Гематологические исследования проводили на 48 рыбах. Они включали: определение числа эритроцитов и лейкоцитов с помощью камеры Горяева (Г.Г. Голодец, 1955), содержания гемоглобина по Сали, выведение лейкограммы. Окраску мазков крови проводили по Паппенгейму. Оценку качественных изменений клеток крови карпов проводили по Н.Т. Ивановой (1983) и Л.Д. Житеневой и др. (1989). Для гистологических исследований патматериал отбирали от 23 свежепогибших и вынужденно убитых рыб с ярко выраженными признаками отравления, условно здоровых и контрольных рыб. В качестве патматериала использовали печень, почки, селезенку, кишечник, сердце, которые фиксировали 5 – 10%-ным раствором нейтрального формалина. Окраску срезов проводили гематоксилин-эозином общепринятым методом. В условиях Новомичуринского рыбхоза были поставлены ориентировочные опыты по определению токсичности Антибака 250 для мальков сибирского осетра. Для этого по 5 мальков помещали в ванночки емкостью 30 л с концентрациями растворов препарата 500, 100, 50 и 20 мг/л (по д. в.). Учет результатов опыта проводили по клиническим признакам интоксикации и выживаемости рыб. По результатам опытов определяли параметры токсичности препарата при разных способах введения. Среднесмертельную дозу рассчитывали по Керберу:  , где ЛД100 – доза препарата, которая вызывает смертельный исход у всей группы рыб; Е – интервал между каждыми двумя смежными дозами; Д – среднее арифметическое из числа рыб, у которых наблюдался летальный исход под влиянием каждых двух смежных доз; n – число рыб в каждой группе.С целью изучения антибактериальной активности Антибака при болезнях рыб в лабораторных условиях поставлены 2 серии опытов: - по определению профилактической эффективности; - по определению лечебной эффективности с использованием разных способов и кратностей введения препаратов в организм рыб. Опыты ставили по сходным методикам в аквариумах емкостью 40 л или бытовых ваннах (180 л) при температуре 18 - 21ºС на сеголетках карпа массой 20 – 25 г, полученных из благополучного по инфекционным болезням хозяйства (ЭПБ ВНИИР). Воспроизведение соответствующего заболевания проводили путем внутрибрюшинного заражения сеголеток карпа вирулентными культурами A. sobria и Pseudomonas sp., выделенными от клинически больных рыб. Рыбам вводили препараты одно-5-тикратно разными способами, а лечебно-профилактический эффект оценивали путем заражения рыб вирулентными культурами A. sobria и Pseudomonas sp. в предварительно оттитрованных дозах инфекционного материала. Взвесь 2-х суточных агаровых культур бактерий вводили внутрибрюшинно в дозах 100 – 200 млн. м. т. (0,1 – 0,2 мл с концентрацией 1 млрд. м. т./мл) на одну рыбу: в первой серии опытов – до обработки Антибаком, во второй – после обработки Антибаком. Контролем служили зараженные теми же культурами рыбы, не подвергавшиеся обработке Антибаком. В опытные и контрольные группы брали не менее 10 экз. рыб, наблюдение за которыми вели в течение 10 дней. В ходе всех опытов рыб кормили гранулированным комбикормом. Результаты учитывали по заболеваемости и смертности рыб. От всех погибших рыб делали высевы их патматериала для выделения исходных культур. Производственные испытания препарата Антибак проведены по разрешению Департамента ветеринарии МСХ РФ в рыбхозах Московской и Рязанской областей на двух-, трех- и четырехлетках карпа, сеголетках радужной форели, мальках и сеголетках сибирского осетра. В неблагополучном по аэромонозу карпов рыбхозе «Клинский» Московской области в июне – июле 2002 г. проведен производственный опыт по испытанию эффективности Антибака 100 на 2-х-, 3-х-, 4-х и 5-ти летках карпа в нагульных прудах при применении его в составе лечебного комбикорма. Гранулированный комбикорм с добавлением Антибака 100 из расчета 1 – 2 г/кг корма скармливали в течение 3 – 5 дней по норме кормления 5% к массе рыб. В последующие годы (2003 – 2008) эффективность Антибака при аэромонозе анализировали по результатам его применения и в других рыбхозах («Нарские острова» Московская область, «Рыбколхоз им. И.В. Абрамова» Ростовская область). В рыбхозе «Новомичуринский» Рязанской области в марте – июне 2003 года поставлены полупроизводственные опыты по определению эффективности Антибака 100 и Антибака 250 при флексибактериозе мальков и сеголетков форели и сибирского осетра. Результаты производственных опытов учитывали по изменению клинической картины до и после обработок, выживаемости рыб в конце опытов, а также по результатам бактериологического контроля динамики обсемененности органов рыб. Схемы опытов представлены в разделе 2. «Результаты собственных исследований». Количественные показатели результатов исследований подвергали вариационно-статистическому анализу с использованием программного обеспечения PC Microsoft Excel 2003. Достоверность различий оценивали на основании критерия Стьюдента. |
Похожие:
 |
Временная инструкция о мероприятиях по борьбе с миксобактериозами лососевых рыб общие положения Миксобактериозы широко распространенные бактериальные заболевания пресноводных рыб, вызывающие поражения жабр и кожи рыб при их выращивании... |
 |
Министерство здравоохранения российской федерации Профилактическая витаминизация детей в дошкольных, школьных, лечебно-профилактических учреждениях и домашних условиях |
|
Программа наименование дисциплины ветеринарная санитария Рекомендуется... Общая эпизоотология, терапия и лечебно-профилактические мероприятия при инфекционных болезнях; ветеринарная санитария; частная эпизоотология.... |
|
Временная инструкция о мероприятиях по предупреждению и ликвидации болезней прудовых рыб С целью предупреждения инфекционных и инвазионных болезней рыб в прудовых и других рыбоводных хозяйствах рекомендуется |
|
Должностная инструкция На должность гигиениста стоматологического назначается лицо, имеющее среднее профессиональное образование по специальности "Стоматология... |
|
Временная инструкция Небольшая глубина прудов (до 2 3 м), быстрое прогревание воды выше 17°, обилие промежуточных хозяев, большая концентрация рыб, разновозрастные... |
|
Инструкция о мероприятиях по борьбе с бранхиомикозом рыб общие положения Бранхиомикоз опасное инфекционное (микозное) заболевание рыб разных видов и возрастов, возникающее в прудовых, садковых рыбоводных... |
|
М. Д. Махлин (среда обитания, обзор рыб и растений) Ю. А. Митрохин (корма и кормление, как создается новое); Г. Л. Куприянов (практика аквариумной гидрохимии); канд биол наук А. Е.... |
|
Сокращения Рекомендуются те методы и препараты, которые имеют убедительные доказательства преимуществ в безопасности, эффективности перед другими,... |
|
Согласовано Рекомендуются те методы и препараты, которые имеют убедительные доказательства преимуществ в безопасности, эффективности перед другими,... |
|
1. Вещества, применяемые при изготовлении лечебно-косметических препаратов 4 Группы растений, наиболее часто применяемые при изготовлении лечебно-косметических средств 10 |
|
Экспериментальная и клиническая фармакология лекарственных препаратов... Лекарственных препаратов на основе диоксидина и доксициклина и их эффективность при мастите |
|
О совершенствовании службы функциональной диагностики в учреждениях... Медицинскому страхованию граждан становится чрезвычайно актуальной задача разработки и внедрения в практику новых медицинских технологий,... |
|
Психотерапевтическая мишень в психотерапии или как повысить эффективность... Что делают психотерапевты, чтобы повысить свою эффективность и «не свихнуться» |
|
Выпускная квалификационная работа по направлению «Экономика» повышение... Эффективность менеджмента и факторы влияния на эффективность менеджмента предприятий 4 |
|
Учебно-методический комплекс для преподавателя по профессиональному... «Участие в лечебно-диагностическом и реабилитационном процессах» мдк 02. 01 «Сестринский уход при различных заболеваниях и состояниях»... |