Тема 1.2 Выбор оптимального соотношения молочнокислых бактерий и бифидобактерий в комбинированной закваске (8 часов).
Лабораторная работа №3 Методы исследования биологических свойств пробиотических штаммов
Санитарно-эпидемиологическая оценка штаммов должна базироваться на обязательных характеристиках безопасности и потенциальных пробиотических свойств видов культур, а также на их дополнительных характеристиках, получение которых является необходимым для определенных изучаемых микроорганизмов.
Дополнительное тестирование проводится в случаях, если: а) штаммы относятся к видам, среди представителей которых известно о наличии болезнетворных для человека штаммов, б) – у штамма наряду со способностью улучшать состав и биологическую активность микрофлоры ЖКТ или помимо таковой предполагается наличие дополнительной (специфической) функциональной активности.
Основные методы исследования безопасности штаммов в тестах in vitro
Определение фенотипического профиля чувствительности/резистентности штамма к антимикробным препаратам
Чувствительность/резистентность штаммов к антимикробным препаратам определяют диско-диффузионным методом (ДДМ) с наложением стандартных бумажных дисков, пропитанных антимикробными препаратами, на поверхность плотной среды и/или методом серийного разведения антибиотика в жидкой питательной среде. Метод основан на способности антимикробных препаратов, диффундирующих в питательную среду, угнетать рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара, вокруг дисков с образованием зон задержки роста, или подавлять рост микробов в жидкой среде с внесенными в нее различными концентрациями препаратов. В этом случае для характеристики чувствительности штаммов к антимикробным препаратам устанавливают минимальную ингибирующую концентрацию (МИК), при которой отсутствует видимый рост культуры. Эта концентрация определяет степень чувствительности штамма к антибиотику.
Для оценки следует использовать не менее 25…30 наименований из числа основных употребляемых в медицине групп антимикробных препаратов (пенициллины, цефалоспорины 1 и 3 поколений, карбапинемы, аминогликозиды 1, 2, 3 поколений, тетрациклины, макролиды, линкозамины, гликопептиды, полимиксины, хинолоны и фторхинолоны).
А. Тестирование бифидобактерий диско-диффузионным методом
Используют модифицированный в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Габричевского» диско-диффузионный метод на основе МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» и рекомендаций Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов, NCCL, 2002 г., США. Используют диски с антибиотиками производства НИИЭМ им. Пастера (Россия, Санкт-Петербург).
Бактериальную культуру готовят общепринятым методом из лиофилизированного материала. Третью генерацию бульонной культуры из разведения 10-4 в количестве 0,1 мл наносят на поверхность агаризованной БС-среды для культивирования и выделения бифидобактерий производства НИИ Прикладной микробиологии, г. Оболенск, разлитой в чашки Петри слоем не меньше 4…5 мм непосредственно перед постановкой опыта. Круговыми движениями шпателя быстро равномерно втирают материал в агаризованную среду, раскладывают антибиотики по трафарету (не более 5 дисков с антибиотиками на чашку), с учетом зон задержки роста культур для каждого из антибиотиков (зоны оценивали в предварительном эксперименте). Чашки помещают в анаэростаты с атмосферой, содержащей 10% CO2 , генерируемой газпаками фирмы Биомерье. Учет зон задержки роста бактериальной культуры проводят через 24 ч выращивания при (37,5 +/- 1) °С.
Интерпретацию полученных результатов проводят при использовании пограничных значений чувствительности бифидобактерий, разделяющих их на три категории.
Б. Тестирование лактобактерий диско-диффузионным методом
Используют агаризованную питательную среду МРС, которую вносят в чашки диаметром 90 мм в объеме 20 мл для достижения слоя агара (4,0 +/- 0,5) мм.
Изтестируемых культур готовят суспензии, соответствующие по плотности оптическому стандарту мутности на 5 единиц (с содержанием микробных тел около 1,5…5 х 108 КОЕ/мл), которые наносят на поверхность агара по стандартной методике.
Диски с антимикробными препаратами наносят по 5 штук на поверхность агара через 15 мин. после его инокуляции взвесью испытуемого штамма.
Инокулированные чашки с дисками инкубируют при температуре 35 °С в течение 18…24 ч, после чего измеряют диаметры зон задержки роста кронциркулем с точностью до 1 мм. Исследование осуществляют в трехкратной повторности, результаты выражают в виде средней арифметической.
В. Тестирование чувствительности бифидобактерий и лактобактерий методом серийных разведений
Тестирование проводится в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».
Постановка метода серийных разведений для оценки антибиотикорезистентности включает следующие этапы:
а) приготовление растворов антибиотиков;
б) приготовление питательных сред с растворами антибиотиков;
в) приготовление суспензии исследуемого штамма и контрольного штамма, стандартизация суспензии и инокуляция;
г) инкубация;
д) интерпретация результатов исследования.
Общими этапами в методе серийных разведений являются: приготовление растворов антибиотиков, питательных сред, смешивание растворов антибиотиков и питательных сред.
Приготовление растворов антибиотиков
Используют основные растворы антибиотиков (пригодные для хранения) и рабочие, используемые «ex tempore» для приготовления питательных сред.
Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора проводят по формуле:
Вес (мг) = Объем растворителя (мл) х Необходимая концентрация (мкг/мл) / Активность субстанции (содержание антибиотика в мкг/мл)
Из основных растворов готовят рабочие двукратные концентрации антибиотиков. Для приготовления рабочих растворов используется стерильная дистиллированная вода. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора в случае, если активность антибиотика измеряется в ЕД, производится аналогично.
Приготовление сред, содержащих антибиотики, для серийных разведений
Наиболее предпочтительным для метода серийных разведений в бульоне при исследовании штаммов-пробиотиков является микрометод (в планшетах), для которого серийные разведения антимикробных препаратов делают не в дистиллированной воде, а в жидкой питательной среде. Жидкая питательная среда, прошедшая контроль качества, готовится в соответствии с инструкцией изготовителя.
При постановке методов серийных разведений проводят контроль роста культуры на среде без препарата, а качество среды и антибиотиков контролируют с использованием референтных штаммов данного вида. Контролируется также чистота суспензии микроорганизма, использованного для инокуляции, путем высева на неселективные среды.
Допускается использование готовых тест-систем для определения МИК, зарегистрированных в РФ в установленном порядке.
Учет результатов
Учет результатов при постановке микрометода проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За МИК принимают концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.
Лабораторная работа № 4. Определения отсутствия трансмиссивных генов антибиотикорезистентности
Отсутствие у штамма генов, кодирующих трансмиссивную антибиотикорезистентность дополнительно к фенотипическому профилю антибиотикорезистентности (в случае необходимости), устанавливается в соответствии с методикой, включенной в МУК 4.2.2305-07 «Определение генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно-модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией». Тестирование наличия последовательностей ДНК, кодирующих трансмиссивную устойчивость к медицинским и ветеринарным антибиотикам – ermC (к эритромицину, плазмиды pE194 Staphylococcus aureus), tetO (к тетрациклину, хромосомы Streptococcus pneumoniae), amp (к ампициллину, плазмиды pBR322 Esherichia coli), hph (к гигромицину, хромосомы Streptomyces hygroscopicus), sh ble (к блеомицину, хромосомы Streptomyces verticillus), проводится многокомпонентным набором праймеров производства НИИЭМ им. Гамалеи РАМН «ГМ-БАКТ-1» по ТУ 9398-001-01897357-08 по инструкции, прилагаемой к тест-системе.
Гены, кодирующие трансмиссивную антибиотикорезистентность, могут также быть выявлены методом определения нуклеотидной последовательности ДНК штамма (секвенирование).
Нуклеотидную последовательность ДНК определяют по методу Sanger. Реакцию проводят по протоколу фирмы «Promega» в 3 стадии:
1. Радиомаркирование (кинирование) праймера.
Реакция кинирования праймера проходит в объеме 10 мкл в следующих условиях: 50 мм Tris-HCl pH 7,5; 10 мм MgCl2; 5 мм DTT; 0,1 мМ спермидина; 10 pmol праймера; 10 pм [гамма 32P] dATP; 5 ед. Т4-полинуклеотид-киназы. Инкубировать 30 мин. На 37 °С, затем активность фермента T4-Kinase останавливают повышением температуры до 90 °С в течение 2 мин.
2. Синтез меченых цепей методом ПЦР.
Кинированный праймер используется для синтеза методом ПЦР меченых 32P цепей ДНК разной длины, терминированных случайным включением ddNTP. Реакция проводится в 17,5 мкл в условиях: 50 мМ Tris-HCl, pH 9,0; 10 мМ MgCl2; 1,5 pmol кинированного праймера; 40 fmol матричной ДНК; 5 ед. Taq-полимеразы. В заранее подготовленные 4 пробирки, содержащие ddNTP, 50 мМ NaCl, раскапывают по 4 мкл реакционной смеси, сверху наслаивают вазелиновое масло и проводят амплификацию. Реакция проходит в следующих условиях: плавление цепей – 95 °С – 0,5 мин.; отжиг затравок – 42 °С – 0,5 мин.; элонгация цепей ДНК – 70 °С – 1 мин. Продолжительность амплификации составляет 30 циклов. Останавливают реакцию добавлением 4 мкл буфера для нанесения (95% формамида, 20 мм ЭДТА; 0,05% бромфенолового синего и 0,05% ксиленцианола FF).
3. Электрофорез.
Полученные образцы прогревают 2 мин. при 70 °С и наносят на 6%-ный полиакриламидный денатурирующий гель. В каждый слот геля наносят по 3 мкл соответствующего образца. Электрофорез проводят при постоянном напряжении (25…30 V/cm) при температуре 55 °С. По окончании электрофореза проводят фиксирование геля в 10%-ной уксусной кислоте, затем гель сушат 30 мин. на стекле при температуре 60 °С. Экспонирование с рентгеновской пленкой «Кодак» проводят в течение 15…48 ч при комнатной температуре.
Секвенирование генома испытуемого штамма сопоставляют с базой данных для референс-штаммов вида, используемых в пищевых продуктах, для выявления генов, кодирующих трансмиссивную антибиотикорезистентность.
Тема 1.3 Технология производства жидкой комбинированной закваски (8 часов).
Лабораторная работа № 5. Определение отсутствия (наличия) плазмидного материала.
Сущность метода определения плазмидного материала, в т.ч. плазмид, кодирующих трансмиссивную антибиотикорезистентность, заключается в выделении плазмидного материала и визуализации результатов с использованием электрофореза в агарозном геле для определения наличия плазмидной ДНК и плазмид, кодирующих признаки устойчивости к антибиотикам.
Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы, инструменты, питательные среды, реагенты
Набор реагентов GeneJETТМ для выделения плазмидной ДНК
Наконечники Omnitip до 300 мкл, 10 х 96 запасной блок
Микроцентрифужные пробирки 1,5 мл
Наконечники Omnitip до 200 мкл, 10 х 96 запасной блок
GeneRulerТМ 100+ п.н. ДНК-маркер
10X TBE буфер для электрофореза
TopVisionТМ LE GQ агароза
Пипетка Research. Объем 0,5 – 10 мкл
Пипетка Research. Объем 2,0 – 20 мкл
Пипетка Research. Объем 10 – 100 мкл
Пипетки Research. Объем 20 – 200 мкл
Пипетка Research. Объем 100 – 1000 мкл
Источник питания Эльф-4
Весы Scout Pro, 120 г/0,001 г
Центрифуга/вортекс Микроспин
Камера, 170 х 120 мм
UV-cleaner box
Центрифуга MiniSpin plus
Система регистрации результатов электрофореза Gel Imager
Подготовка к анализу
Исследование должно проводиться в специально оборудованных помещениях, состоящих из комнаты для работы с микроорганизмами, ПЦР-оборудованного помещения для работы с препаратами ДНК и комнаты для постановки электрофореза и учета результатов. Не допускается проведение микробиологических этапов исследования, выделения ДНК и анализа присутствия плазмидной ДНК в образцах в помещениях, не предназначенных для этих целей, во избежание контаминации и неверной интерпретации результатов.
Методика выделения плазмидной ДНК обеспечивает получение низкоразмерной ДНК с высокой степенью чистоты из культур клеток бактерий. Для анализа используется набор типа К0503, основной составной частью которого является микроколонка, протекание жидкости через нее обеспечивается центрифугированием. Колонка содержит специальную мембрану на силикатной основе. Набор позволяет получить до 20 мкг высококопийной плазмидной ДНК за одно выделение. Оптимальный объем клеточной культуры, используемой на начальном этапе, и реальное количество выделяемой ДНК зависят от среды, применяемой для роста клеточной культуры, и количества копий плазмиды.
Проведение анализа:
1) Отбор и подготовка проб
Выращенная при оптимальной температуре инкубации культура исследуемого штамма бактерий анализируется на присутствие в составе плазмидной ДНК.
Процедура выделения ДНК производится с использованием описанного выше лабораторного оборудования и набора реагентов GeneJETТМ для выделения плазмидной ДНК (Ферментас) строго в соответствии с прилагаемой инструкцией фирмы-производителя.
2) Принцип метода
Осажденные бактериальные клетки ресуспендируют и подвергают щелочному лизису в присутствии додецилсульфата натрия для высвобождения плазмидной ДНК. Полученный лизат нейтрализуют. Клеточный дебрис и додецилсульфат натрия удаляют центрифугированием. Раствор, содержащий плазмидную ДНК, наносят на мембрану микроколонки GeneJETТМ. Адсорбированную ДНК промывают для удаления примесей. Очищенную плазмиду элюируют небольшим объемом буфера или воды.
3) Применяемые растворы и материалы
раствор для ресуспендирования бактериальных клеток (70 мл)
раствор для щелочного лизиса клеток (70 мл)
раствор для нейтрализации клеточного лизата (100 мл)
концентрированный раствор для промывки плазмидной ДНК, адсорбированной на мембране (100 мл)
рибонуклеаза А (700 мкл)
буфер для элюирования плазмидной ДНК (30 мл)
микроколонки GeneJETТМ (250 штук).
Набор реагентов типа GeneJETТМ может храниться при комнатной температуре (15…25 °С), если срок хранения не превышает 12 месяцев. При более длительном использовании рекомендуется хранить набор при 4 °С. Если в процессе хранения в растворах выпадает осадок, то его следует растворить прогреванием раствора при 37 °С. Перед использованием растворы охладить до 25 °С. Не рекомендуется интенсивно перемешивать раствор для щелочного лизиса клеток.
После добавления рибонуклеазы А раствор для ресуспендирования бактериальных клеток должен храниться при 4 °С и быть использован в течение 6 месяцев.
4) Ход определения
Все процедуры очистки должны выполняться при комнатной температуре. Центрифугирование проводится в настольной мини-центрифуге. Скорость вращения ротора должна превышать 12000 об./мин. Для выделения высококопийных плазмид достаточно использовать 1 – 5 мл культуры E. coli, выращенной в среде LB. Для выделения низкокопийных плазмид следует использовать 10 мл культуральной жидкости.
Анализ осуществляется строго поэтапно:
1. Перед первым использованием набора добавить рибонуклеазу А к раствору для ресуспендирования бактериальных клеток и перемешать. Ресуспендировать осажденные клетки в 250 мкл этого раствора, перемешивая до исчезновения комков. Перенести клеточную суспензию в пробирку для микроцентрифугирования.
2. Добавить к клеточной суспензии 250 мкл раствора для щелочного лизиса клеток и перемешать, переворачивая пробирку 4…6 раз. Раствор должен стать вязким и слегка прозрачным. Нельзя перемешивать смесь на шейкере-встряхивателе типа «Vortex», так как это может способствовать разрушению хромосомной ДНК. Нельзя инкубировать смесь дольше 5 мин., чтобы избежать денатурации суперскрученной плазмидной ДНК.
3. Добавить к клеточному лизату 350 мкл раствора для нейтрализации, немедленно тщательно перемешать, переворачивая пробирку 4…6 раз.
4. Центрифугировать смесь 5 мин. для осаждения клеточного дебриса и хромосомной ДНК.
5. Нанести полученный раствор на мембрану микроколонки GeneJETТМ.
6. Центрифугировать 1 мин. Удалить прошедший через мембрану раствор из пробирки и поместить микроколонку в ту же пробирку.
7. Перед первым использованием набора к концентрированному раствору для промывки плазмидной ДНК, адсорбированной на мембране (100 мл), добавить 170 мл 96…100%-ного этанола. 500 мкл полученного раствора нанести на мембрану микроколонки GeneJETТМ. Центрифугировать 30…60 с и удалить раствор, прошедший через мембрану. Поместить микроколонку в ту же пробирку.
8. Повторить процедуру промывки (стадия 7).
9. Удалить раствор, прошедший через мембрану. Центрифугировать микроколонку еще 1 мин. для удаления раствора для промывки плазмидной ДНК. Эта операция необходима для того, чтобы избежать следовых количеств этанола в препарате ДНК.
10. Перенести микроколонку GeneJETТМ в чистую пробирку на 1,5 мл (не включена в набор). Нанести 50 мкл буфера для элюирования плазмидной ДНК в центр мембраны. Нельзя касаться мембраны наконечником пипетки. Выдержать 2 мин. И центрифугировать 2 мин. Дополнительное проведение стадии 10 с использованием буфера для элюирования или воды позволяет увеличить выход выделенной плазмидной ДНК на 10…20%.
11. Удалить микроколонку и хранить выделенную плазмидную ДНК при -20 °С.
Электрофорез выделенной плазмидной ДНК проводится с использованием камеры для электрофореза SE-2 (Хеликон) строго в соответствии с прилагаемой к аппарату инструкцией фирмы-производителя. Препарат выделенной ДНК наносится в лунки агарозного геля и разгоняется в электрическом поле в течение 45 мин. при напряжении 15 В/см.
При проведении электрофореза должны соблюдаться следующие требования:
при проведении электрофореза температура буферного раствора не должна превышать 45 °С;
необходимо менять буфер после 2 – 3 электрофорезов;
не допускается контакт составных частей изделия с органическими растворителями;
при подключении к блоку питания соблюдать полярность;
перед заливкой геля в заливочное устройство раствор агарозы остужать до 60 °С.
5) Учет результатов
Учет результатов анализа проводится с использованием гель-документирующей системы типа Gel Imager-2 в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией фирмы-производителя. В тех дорожках, где обнаруживается светящийся в УФ-свете фрагмент, – присутствует плазмидная ДНК того штамма, чей образец наносился.
Система типа Gel Imager-2 предназначена для ввода в компьютер изображений люминесцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием. Изображение выводится непосредственно на компьютер. Сигнал изображения формируется ПЗС-камерой с ручной наводкой на резкость, диафрагмированием и 2-кратным плавным масштабированием. При работе не требуется дополнительного затемнения помещения. Программное обеспечение Gel Imager поддерживает функции контрастирования, масштабирования, преобразования позитив/негатив, позволяет накапливать кадры в буфер приложения, что значительно поднимает соотношение сигнал/шум. Имеется возможность записи в файл, сжатия, ведения базы данных и печати на принтере полученных изображений.
Системные требования к компьютеру:
Intel 166 MHz процессор (или выше);
200 MB свободной памяти на жестком диске;
не менее 16 MB RAM;
Microsoft Windows 95(98)/XP и выше;
видеоадаптер, поддерживающий режим True Color (24 бит);
PCI – слот;
Microsoft Office 97 (с компонентами DAO 3.5 для работы базы данных).
6) Интерпретация результатов
Положительным результатом, говорящим о присутствии плазмидной ДНК, служит наличие плазмидного материала в геле после проведения электрофореза, визуализации в УФ-свете и его фиксирования с использованием компьютерной системы гель-документирования. Длина фрагментов ДНК, полученных после электрофоретического разделения продуктов ПЦР, сопоставляется с низкоразмерными маркерами 16 – 500 п.н.
Требования безопасности
При осуществлении данного анализа должны соблюдаться требования, предъявляемые к исследовательской работе с микроорганизмами III – IV групп патогенности.
Раствор для щелочного лизиса клеток и раствор для нейтрализации клеточного лизата содержат вещества, вызывающие раздражение кожи. Работать с ними необходимо в перчатках.
|
