4.2. Правила доставки, хранения и подготовки проб к исследованию
Оптимальное время исследования крови – в интервале от 1 до 4 часов после взятия. В промежутке от 5 до 30 минут происходит временная адаптации тромбоцитов к антикоагулянту и их агрегация, что может привести к их ложному снижению в пробе крови.
Нежелательно исследовать кровь позднее 8 часов после взятия, т.к. изменяются некоторые характеристики клеток: снижается объем лейкоцитов, повышается объем эритроцитов, что в конечном итоге приводит к ошибочным результатам измерения и неправильной интерпретации результатов. Только концентрация гемоглобина и количество тромбоцитов остаются стабильными в течение суток хранения крови.
Кровь нельзя замораживать. Капиллярную кровь с К2ЭДТА следует хранить при комнатной температуре и анализировать в течение 4 часов после взятия.
Для обеспечения качественного результата исследований нужно четко контролировать время и условия хранения проб до выполнения анализа.
При необходимости проведения отсроченного анализа (транспортировка на отдаленные расстояния, техническая неполадка прибора и т. д.), пробы крови хранят в холодильнике (4о – 8о С) и исследуют в течение 24 часов. Однако при этом следует учитывать, что происходит набухание клеток и изменение параметров, связанных с их объемом. У практически здоровых людей эти изменения не носят критического характера и не сказываются на количественных параметрах, но при наличии патологических клеток, последние могут изменяться или даже разрушаться в течение нескольких часов с момента взятия крови.
Непосредственно перед исследованием кровь должна быть тщательно перемешана в течение нескольких минут для разведения антикоагулянта и равномерного распределения форменных элементов в плазме. Длительное постоянное перемешивание образцов до момента их исследований не рекомендуется вследствие возможного травмирования и распада патологических клеток.
Исследование крови на автоматическом анализаторе проводится при комнатной температуре. Кровь, хранившуюся в холодильнике, необходимо вначале согреть до комнатной температуры, так как при низкой температуре увеличивается вязкость крови, и форменные элементы имеют тенденцию к склеиванию, что в свою очередь, приводит к нарушению перемешивания и неполному лизису. Исследование холодной крови может быть причиной появления «сигналов тревоги» вследствие компрессии лейкоцитарной гистограммы.
Приготовление мазков крови рекомендуется делать не позднее 1-2 часов после взятия крови.
При выполнении гематологических исследований на значительном удалении от места взятия крови неизбежно возникают проблемы, связанные с неблагоприятными условиями транспортировки. Воздействие механических факторов (тряска, вибрация, перемешивание и т.д.), температурного режима, вероятность пролива и загрязнения проб могут оказывать влияние на качество анализов. Для устранения этих причин при перевозках пробирок с кровью рекомендуется использовать герметично закрытые пластиковые пробирки и специальные транспортные изотермические контейнеры. Во время транспортировки не допускается контакт образца (с нативным материалом) и бланка-направления, в соответствии с правилами биологической безопасности.
4.3. Прием и регистрация биологического материала
Пробирки с образцами венозной крови доставляют в лабораторию в день взятия в в штативах в специальных сумках-саквояжах для доставки биологического материала, в которых пробирки должны находиться в вертикальном положении, а при транспортировке на удаленное расстояние - в специальных контейнерах.
Сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить:
- правильность оформления направления: в бланке–направлении указываются данные обследуемого (фамилия, имя и отчество, возраст, № истории болезни или амбулаторной карты, отделение, диагноз, проведенная терапия);
- маркировку пробирок с образцами крови (на них должны быть нанесены код или фамилия больного, идентичные коду и фамилии в бланке направления материала для исследования). Лаборант должен зарегистрировать доставленный материал, отметить количество пробирок.
4.4 Подсчет клеточного состава крови на гематологическом анализаторе
Подсчет клеточного состава крови на гематологическом анализаторе должен проводиться в строгом соответствии с инструкцией к прибору.
При работе на гематологическом анализаторе следует:
- использовать кровь, стабилизированную К-2ЭДТА в рекомендованной пропорции для конкретной соли и одноразовые пробирки для гематологических исследований (простых или вакуумных);
- перед анализом осторожно, но тщательно перемешать пробирку с кровью (рекомендуется для этой цели использовать устройство для перемешивания образцов крови - ротомикс);
- использовать реактивы, зарегистрированные в установленном порядке; при смене реактивов на продукцию другого производителя следует проверить и установить калибровку прибора;
- запускать прибор, соблюдая все стадии промывки, добиваясь нулевых (фоновых) значений показателей по всем каналам;
- обращать внимание на сообщения прибора о вероятных систематических ошибках: помнить, что увеличение МСНС выше нормальных значений, как правило, результат ошибки измерения;
- при выявлении ошибки обязательно устранить причину, не работать на неисправном приборе;
- выполнять процедуру контроля качества по соответствующей программе. с оценкой полученного результата;
- работать осмысленно, сопоставляя получаемые результаты с клинической характеристикой проб больного;
- после окончания измерений тщательно промыть анализатор;
- при остановке прибора на длительный срок обязательно выполнить все процедуры консервации (по возможности совместно с сервис-инженером);
- при возникновении технических проблем следует воспользоваться помощью сервис-инженера фирмы, имеющей лицензию на техническое обслуживание; не доверять работу необученному персоналу.
Приступая к работе на гематологическом анализаторе, следует учесть границы линейности измерения анализируемых параметров. Оценка проб со значениями анализируемых параметров, превышающих границу линейности измерения, может привести к ошибочным результатам. В большинстве случаев при анализе проб с гиперцитозами анализатор вместо значения измеряемого параметра выдает значок "D" (dilute), что указывает на необходимость разведения пробы и повторного измерения. Разведение необходимо проводить до тех пор, пока не будут получены схожие итоговые результаты при двух ближайших разведениях.
П р и м е р ─ Анализ пробы больного с гиперлейкоцитозом на трех различных гематологических анализаторах представлен в таблице.
Таблица 3
¦Результаты подсчета количества при гиперлейкоцитозе, выполненные на трех различных гематологических анализаторах
Гематологические анализаторы
|
Степень разведения пробы
|
Итоговое значение
|
|
Цельная кровь
|
1:1
|
1:3
|
1:4
|
WBC
|
1
|
D
|
274,5
|
274,5
|
143,1
|
715,5
|
2
|
322,6
|
253,2
|
177,7
|
141,8
|
709,0
|
3
|
D
|
D
|
168,3
|
139,1
|
695,5
|
Из таблицы видно, что при анализе цельной крови только один анализатор (2-й) дал цифровое значение количества лейкоцитов, два других указали на необходимость разведения пробы. Последующее поэтапное измерение пробы в трех разведениях позволило добиться близких конечных результатов на всех приборах только при разведении 1:3 и 1:4. Таким образом, итоговое количество лейкоцитов составило 700,0 - 710,0 x 10 9 /л, что более чем в 2 раза превышает первоначальное значение, полученное в цельной крови на 2-м анализаторе и в 1,5 - при разведении 1:1 на 1-м и 2-м анализаторах.
Калибровка гематологических анализаторов
Под калибровкой понимается процедура настройки анализатора, в результате
которой достигается равенство нулю систематической составляющей погрешности (нулевое смещение) или подтверждается, что смещение равно нулю с учетом погрешности калибровки. Калибровка гематологических анализаторов может быть выполнена двумя основными способами:
- по цельной крови;
- по образцам стабилизированной крови с аттестованными значениями.
5.1 Калибровка по цельной крови
Калибровка по цельной крови может быть выполнена путем сравнения с референтным анализатором, калибровка которого верифицирована и может быть принята за исходную.
Для калибровки путем сравнения с референтным анализатором используется 20 образцов венозной крови пациентов, выбранных произвольно из дневной программы исследований лаборатории, располагающей референтным анализатором. Кровь должна быть взята в вакуумные пробирки с антикоагулянтом К2ЭДТА. После анализа на референтном анализаторе пробирки с кровью доставляются лабораторию для анализа на калибруемом приборе. Время между измерениями на референтном и калибруемом анализаторе не должно превышать 4 часа. Анализ калибровочных проб на калибруемом приборе должен выполняться таким же способом, как и анализ проб пациентов. Полученные результаты заносятся в таблицу по форме, приведенной в Приложении 1. Данные результаты используются для определения соответствующих калибровочных факторов, которые численно равны коэффициентам наклона калибровочных прямых, проходящих на графике через начало координат.
Калибровочные факторы рассчитываются на компьютере с использованием программы EXCEL, входящей в состав пакета Microsoft OFFICE любой версии. Для расчета калибровочных факторов в данной программе строится точечная диаграмма, где по оси Х откладываются измеренные значения, по оси Y – референтные, задается линия регрессии через начало координат. Программа рисует калибровочную прямую и определяет ее наклон, который и является искомым калибровочным фактором. При выявлении грубых ошибок – точек значительно отстоящих на графике от калибровочной прямой, их необходимо удалить из расчета (стереть всю строку в таблице EXCEL). Полученный калибровочный фактор заносится в таблицу Приложения 1 и используется для ручной корректировки калибровки прибора в соответствие с его инструкцией по эксплуатации.
Калибровка по образцам стабилизированной крови с аттестованными значениями
Данный способ калибровки базируется на коммерческих калибровочных и контрольных материалах, представляющих собой искусственную смесь стабилизированных человеческих эритроцитов и фиксированных клеток человека или животных, имитирующих лейкоциты и тромбоциты. Ввиду существенного отличия биологических свойств компонентов данных материалов от натуральной крови аттестованные значения гематологических параметров зависят от конкретного типа анализатора.
Во всех случаях, когда возможно, следует использовать калибраторы, специально предназначенные изготовителем для калибровки конкретного типа анализатора. Погрешности установленных значений в современных гематологических калибраторах в основном соответствуют медицинским требованиям. Однако не для всех типов анализаторов такие калибраторы имеются. Кроме того, ввиду ограниченного срока сохранности (как правило, не более 45 дней) не всегда имеется возможность получать непросроченные образцы.
Контрольные материалы не предназначены изготовителем для целей калибровки: допуски для значений значительно шире, методы аттестации и производственного контроля не такие строгие как для калибраторов. При проведении калибровки, контрольные материалы могут быть использованы лишь как один из источников информации о метрологических свойствах прибора.
Следует, однако, иметь ввиду, что при использовании для целей калибровки как контрольных материалов, так и калибраторов, особенности пробоподготовки и эксплуатации анализаторов оказывают существенное влияние на составляющие систематической погрешности. Данные влияющие факторы не могут быть учтены при калибровке коммерческими материалами. Вследствие этого, во всех случаях, проведенная калибровка должна быть верифицирована путем анализа статистики получаемых результатов в пробах пациентов (эритроцитарные индексы, интервалы нормальных значений).
5.2.1 Периодичность калибровки гематологических анализаторов
Требования к периодичности калибровки обычно содержатся в инструкции по эксплуатации анализатора. Как правило, калибровка требуется после ремонта или в случае выявления значимого дрейфа в процедурах внутрилабораторного контроля качества.
5.2.2 Процедура калибровки
Процедура калибровки выполняется в соответствии с инструкцией по эксплуатации анализатора.
5.2.3 Контроль результата калибровки
Данный контроль заключается в анализе калибровочного образца сразу после выполнения калибровки. Выполненная калибровка принимается, если результаты анализа соответствуют калибровочным значениям с учетом аналитической вариации анализатора.
5.2.4 Верификация калибровки с помощью эритроцитарных индексов
В этом способе проверки и уточнения калибровки используется тот факт, что средние значения эритроцитарных индексов – МСНС, МСН и MCV по пациентам имеют довольно малую вариацию и поэтому могут эффективно использоваться для контроля калибровки и дальнейшего контроля качества. Рекомендуемое число проб для усреднения равняется 20. Для определения среднего значения МСНС могут быть использованы любые пробы пациентов, в то время, как для определения средних МСН и MCV следует исключать пациентов с анемиями.
Многие современные гематологические анализаторы имеют встроенные программы расчета текущих средних, что значительно облегчает обработку данных.
Целевые значения эритроцитарных индексов при усреднении по 20 пробам пациентов в возрасте от 18 до 60 лет независимо от пола приведены в таблице 4.
Таблица 4
Целевые значения эритроцитарных индексов
Параметр
|
Среднее значение
|
Контрольный допуск
|
MCHC (г/дл)
|
34
|
+/- 1
|
MCH (пг)
|
30.5
|
+/- 1.5
|
MCV (фл)
|
90
|
+/- 4
|
Если полученные средние значения вышли за контрольный допуск, то это означает, что калибровка MCV или Hgb или RBC нуждается в корректировки.
При выяснении причин неудовлетворительной калибровки по результатам исследования эритроцитарных параметров при использовании коммерческих калибровочных/контрольных материалов следует принимать во внимание следующую оценку надежности аттестованных значений материалов:
- наиболее точным и стабильным во времени параметром является концентрация эритроцитов;
- стабильным параметром является Hgb, но он может зависеть от применяемых реактивов (например, циановые или бесциановые);
- самым нестабильным параметром является MCV. Значение MCV имеет тенденцию к изменению в течение всего срока годности материала в довольно широком интервале значений. При уточнении калибровки по MCV данные, полученные из анализа средних по эритроцитарным индексам, имеют приоритет над аттестованными значениями в образцах стабилизированной крови.
Считая калибровку по RBC правильной, в таблице 5 указаны возможные причины выхода средних значений индексов за контрольный допуск.
Таблица 5
Причины выхода за пределы средних значений эритроцитарных индексов
Эритро-цитарные индексы
|
Среднее значение индекса
|
Среднее значение индекса
|
Среднее значение индекса
|
Среднее значение индекса
|
MCHC
|
Ниже границы
|
Выше границы
|
Выше границы
|
Ниже границы
|
MCH
|
В границах допуска
|
В границах допуска
|
Выше границы
|
Ниже границы
|
MCV
|
Выше границы
|
Ниже границы
|
В границах допуска
|
В границах допуска
|
Причина
|
Завышен MCV
|
Занижен MCV
|
Завышен Hgb
|
Занижен Hgb
|
|
