Среды, изменяющие свой состав при нагревании выше температуры 100 °С и избыточном давлении, подвергают дробной стерилизации текучим паром при 3-разовом кипячении по 30 - 45 мин. через 1 сут.
Пастеризацию, т.е. неполную стерилизацию, используют для обеспложивания сред, не выдерживающих кипячения (вино, виноматериалы). Среды пастеризуют при температуре 75 - 80 °С в течение 15 мин. Пастеризованные среды хранят на холоде.
Для стерилизации жидкостей, которые изменяют свои свойства при нагревании, можно использовать холодную стерилизацию, заключающуюся в фильтровании через обеспложивающие микропористые фильтры, устройство и материал которых обеспечивают задержку микроорганизмов (асбестовые фильтры Зейтца, керамические, порошковые, прессованные или мембранные фильтры).
Приложение 7
(рекомендуемое)
СЕЛЕКЦИЯ, ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР ДРОЖЖЕЙ И ХРАНЕНИЕ
ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ
Производство шампанских вин является той отраслью виноделия, в которой ведущая роль для получения высококачественного продукта принадлежит дрожжам и продуктам их метаболизма.
Сложение своеобразного гармоничного вкуса и тонкого букета шампанского обусловливается сложными биохимическими и микробиологическими процессами взаимодействия дрожжей с шампанизируемым вином. Они катализируются комплексом ферментных систем, которые синтезируются дрожжевыми клетками.
Селекционированные шампанские дрожжи должны обладать комплексом ценных свойств:
- быть жизнедеятельными при высокой активной кислотности среды (рН 2,8 - 3,2) и объемной доле спирта 10 - 12%;
- устойчивыми по отношению к сернистому ангидриду (концентрация сернистого ангидрида в среде до 200 мг/куб. дм);
- холодостойкими, способными развиваться при температуре 10 - 12 °С и обеспечивать энергичное брожение с доведением давления диоксида углерода до 500 кПа при температуре 10 °С;
- выбраживание сахара должно проходить в регламентированные сроки, а вино после брожения быстро и полно осветляться.
Для шампанизации вина классическим бутылочным способом рекомендуются дрожжи с хлопьевидной структурой осадка, а для резервуарной шампанизации - с пылевидной.
Дрожжи шампанского производства должны образовывать ценные продукты брожения, обусловливающие свежий гармоничный вкус и аромат, характерные для шампанского, без посторонних привкусов, запахов и с минимальным количеством нежелательных соединений, в частности летучих кислот и их эфиров.
Характер и направленность процесса шампанизации во многом зависят от правильного выбора культуры дрожжей, ее физиологических и биохимических особенностей, состава вина и условий производства. Поэтому селекция наиболее эффективных рас дрожжей и рациональное регулирование их жизнедеятельности по ходу технологического процесса играют ведущую роль в создании продукции высокого качества. Для получения дрожжевых культур, отвечающих этим требованиям, необходимо систематически вести работу по селекции и направленному воспитанию дрожжей с целью повышения их производственных качеств. Одним из способов направленного улучшения производственно ценных признаков дрожжей является их многократное проведение через процесс производственной шампанизации с непрерывно улучшаемым отбором. Для этого из бродильного аппарата, в котором созданы все необходимые условия для приобретения дрожжами ценных производственных свойств, выделяют культуры дрожжей методом высева в чашки Петри на твердую питательную среду последующей отвивкой выросших колоний.
Объективным критерием оценки и ведущим признаком при селекции дрожжей шампанских рас является ряд физиологических, биохимических и физико-химических показателей, при условии, что избранная культура в процессе шампанизации в количественном отношении превалирует над сопутствующей микрофлорой.
Чистой культурой микроорганизмов называют культуру, полученную из одной клетки. При использовании в производстве чистых культур дрожжей улучшается качество получаемого продукта, уменьшается возможность появления посторонних тонов в букете и вкусе, несвойственных шампанскому. Брожение проходит более равномерно, и шампанское получается однородным по качеству.
Существует несколько методов получения чистых культур. Все они основаны на выделении из популяции единичной клетки. Чаще других используют метод Коха, заключающийся в получении чистой культуры из отдельной колонии, которую считают результатом развития одной клетки. Для получения изолированных колоний суспензию с микроорганизмами высевают на поверхность плотной питательной среды. Рассев проводят при помощи петли штрихом. Изолированные колонии штаммов дрожжей шампанской расы, относящиеся к факультативным анаэробам, лучше получать при глубинном посеве. Выделение чистой культуры анаэробных микроорганизмов по методу Коха требует создания условий, ограничивающих доступ кислорода к культуре. Для этого делают разведения суспензии с микроорганизмами в пробирках с 10 куб. см стерильной водопроводной воды, дважды пересевая одной петлей из пробирки в пробирку. Затем делают высев петлей в предварительно расплавленную и остуженную до температуры 45 - 50 °С агаризованную среду. Засеянный агар в пробирке перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара поверхность среды в чашках заливают смесью парафина и вазелинового масла (1:1) и выдерживают в течение нескольких дней при температуре 15 °С. Посев повторяют 2 - 3 раза. В качестве посевного материала используют культуры, полученные из отдельной колонии.
Можно получать изолированные колонии, пользуясь поверхностным посевом на застывшую агаризованную среду в чашках Петри. Посев необходимо повторять 2 - 3 раза, так как возможен рост колоний из нескольких слипшихся клеток.
Для проверки чистоты выделенных культур просматривают колонии выросших микроорганизмов, отмечают, описывают и зарисовывают преобладающие формы, выбирая изолированные колонии. Каждую из описанных колоний отсевают в пробирки с жидкой питательной средой и на поверхность скошенной агаризованной среды.
Чистоту выделенных культур проверяют визуально, микроскопированием и рассевом на поверхность агаровой пластинки в чашках Петри. Визуально просматривают рост по штриху на скошенной агаризованной среде. Культуры, рост которых однороден по всему штриху, оставляют для дальнейшей работы, а культуры неоднородные по штриху отбрасывают. С помощью микроскопического контроля препарата "раздавленная капля", лучше с фазово-контрастным устройством, выявляют однородность культуры. Чистые культуры дрожжей должны быть морфологически однородны, допустимо лишь некоторое варьирование размеров клетки. После посева изолированных колоний в пробирки на поверхность скошенной агаризованной среды готовят суспензии этих культур смывом стерильной водопроводной воды. Полученную суспензию подвергают микроскопическому контролю и после разведения рассевают на поверхность агаровой среды в чашки Петри. Через 5 - 7 сут. термостатирования при температуре 30 °С просматривают колонии, выросшие в чашках, и сверяют их признаки с отмеченными при выделении. Однородность колоний и совпадение их признаков с описанными ранее - свидетельство чистоты культуры.
Выделенные отселекционированные производственные штаммы чистых культур дрожжей должны храниться в коллекции микробиологической лаборатории заводов шампанских вин. В производстве можно применять только те расы, которые проверены и рекомендованы Отраслевой лабораторией технологии игристых вин Всероссийского научно-исследовательского института пивоваренной безалкогольной и винодельческой промышленности.
Культуры дрожжей должны сохраняться в условиях, максимально приближенных к производственным и обеспечивающих их чистоту. Несоблюдение этих условий может привести к частичной утрате присущих дрожжам производственно ценных свойств и к загрязнению культуры посторонними микроорганизмами. Такие условия легко создать в любой лаборатории. Питательной средой для хранения чистых культур дрожжей в музее в течение длительного времени должна быть только жидкая среда - купаж шампанских виноматериалов или белое сухое вино с добавлением ликера до массовой концентрации сахара от 20 до 30 г/куб. дм.
Культуры хранят в аптечных склянках вместимостью 30 - 50 куб. см с навинчивающимися пластмассовыми пробками. Для этого предварительно пастеризованную питательную среду наливают по 10 - 15 куб. см в стерильные склянки и пересевают в них по 0,5 куб. см чистой культуры дрожжей последней генерации в стадии бурного брожения. Отверстия склянок сразу же закрывают простерилизованными спиртом плоскими резиновыми пробками, завинчивают пластмассовыми колпачками и хранят в холодильнике при температуре 4 - 8 °С. При соблюдении всех вышеуказанных условий пересевать музейные культуры надо не реже чем через 3 мес. Производственная эффективность дрожжей, хранящихся длительное время в музее, снижается.
Приложение 8
(рекомендуемое)
ВЫЯВЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ МОРФОЛОГИИ И ФИЗИОЛОГИИ
НЕКОТОРЫХ СИСТЕМАТИЧЕСКИХ ГРУПП МИКРООРГАНИЗМОВ
Дрожжевая флора производства шампанского бутылочным и непрерывным способами разнообразна по видовому составу и принадлежит к 10 родам - Saccharomyces, Saccharomycodes, Pichia, Hanseniaspora, Brettanomyces, Candida, Kluyveromyces, Hansenula, Dekkera, Torulopsis; из них чаще встречаются первые шесть родов.
Бактерии шампанского производства изучены недостаточно.
Молочнокислые бактерии принадлежат к 3 родам - Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus.
Уксуснокислые бактерии принадлежат к 2 родам - Acetobacter, Pseudomonas.
При изучении любого процесса, связанного с жизнедеятельностью микроорганизмов, необходимо знать их таксономическое положение. В производстве шампанского низшей единицей в классификации является раса или штамм дрожжей, выделенные в пределах одного вида. Штаммы объединяются в виды, виды - в роды, а роды - в семейства.
Для идентификации микроорганизмов используют возможно больше диагностических признаков: морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и других.
Морфология микроорганизмов весьма изменчива и зависит от условий культивирования, возраста, вида и т.д., поэтому при изучении морфологии дрожжей следует пользоваться культурами одного возраста, выращенными в одинаковых условиях. Для этого образцы высевают на агаризованную винную среду с сахаром в чашку Петри и инкубируют в термостате при температуре 28 °С в течение 24 ч. Чистые культуры микроорганизмов отсеивают в бутылочки для хранения под давлением диоксида углерода при температуре 8 °С и в пробирки с жидкой средой, которые используют для идентификации. Форму, размеры клеток, способ размножения, выявление спор, капсул, запасных веществ, кислотоустойчивость, подвижность, а также окраску по Граму изучают при микроскопировании препаратов.
Под культуральными признаками подразумевают характер роста микроорганизмов на жидких и плотных средах. При росте на жидкой среде наблюдают образование пленки, пристенного кольца, осадка, на плотной среде - форму, размеры, оптические свойства, цвет, поверхность, структуру и консистенцию колоний.
К физиолого-биохимическим признакам относятся некоторые особенности обмена веществ клетки, выявляемые по способности изучаемого микроорганизма расти на принятых диагностических средах и вызывать те или иные превращения веществ, входящих в состав этих сред. Как правило, определяют следующие показатели:
- сбраживание различных углеводов (глюкозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, раффинозы) в трубках Дунбара на дрожжевой воде с массовой концентрацией исследуемого сахара 2 г/куб. дм;
- ассимилирующую способность различных углеводов и сахаро-спиртов (обычно используют 30 - 40 углеводных соединений), которую определяют прямым подсчетом количества клеток или нефелометрически;
- способность усваивать нитраты, т.е. превращать их в усвояемый азот, определяют на жидкой среде с добавлением нитрата калия или сернокислого аммония;
- потребность в ростовых веществах изучают на минеральной среде с последовательным добавлением избранных витаминов (биотин, пиридоксин, тиамин, пантотеновая кислота, мезоинозит, никотинамид, парамино-бензойная кислота);
- холодостойкость определяется способностью колоний микроорганизмов расти на солодовом агаре при температуре от 5 до 12 °С;
- спиртоустойчивость дрожжей определяют по сбраживаемости высокосахаристой среды с объемной долей спирта 8 - 12%;
- кислотоустойчивость микроорганизмов подтверждается ростом на среде с рН 3,5; 3,0 и 2,7;
- образование аммиака свойственно микроорганизмам, дезаминирующим аминокислоты;
- образование сероводорода свойственно микроорганизмам, использующим в процессах метаболизма содержащиеся в среде аминокислоты (цистеин, цистин, метионин и др.).
Пользуясь полученными морфологическими, культуральными, физиологическими и биохимическими признаками микроорганизмов, можно при помощи определителей установить их принадлежность к конкретному роду и виду.
Основные микроорганизмы, встречающиеся в шампанском производстве:
Saccharomyces vini Pichia dispora
Saccharomyces oviformis Dekkera bruxelensis
Saccharomyces rosei Dekkera intermedia
Saccharomyces bailii var bailii Hansenula anomala
Saccharomyces rouxii Kluyveromyces bulgaricus
Saccharomyces heterogeicus Torulopsis apicola
Saccharomyces bisporus var bisporus Lactobacillus plantarum
Saccharomycodes ludwigii Lactobacillus brevis
Brettanomyces intermedius Lactobacillus buchneri
Brettanomyces bruxelensis Lactobacillus fermentii
Candida valida Leuconostoc gracile
Candida vini Leuconostoc oinos
Candida rugosa Pediococcus cerevisia
Hanseniaspora uvarum Acetobacter xylinum
Pichia membranaefasiens Acetobacter rancens
Краткая характеристика микроорганизмов
Род Saccharomyces занимает главное место в производстве шампанского. Виды, относящиеся к этому роду, не различаются по морфологии. Клетки разнообразной формы - округлые, овальные или удлиненные. Размеры (10,5 - 18) х (3,5 - 10,5) мкм. Размножение вегетативное, многосторонним почкованием. Общей чертой является активное сбраживание глюкозы. Хорошо различаются по отношению к другим углеводам. Нитраты не усваивают.
Saccharomyces vini - культура на сусло-агаре формирует колонии круглой формы с выпуклым центром и ровными краями, желтовато-белого цвета, маслянистые, гладкие или складчато-шероховатые, морщинистые. Сбраживают и ассимилируют все сахара, ассимилируют этанол, глицерин, маннит, сорбит, фумаровую, уксусную и молочную кислоты. Обладая высокой активностью дыхания и брожения, хорошей способностью к размножению, они быстро становятся доминирующими в брожении вина, придают ему характерный букет и вкус, определяют состав. Однако в осадках старых вин этот вид дрожжей встречается редко, так как после брожения они вытесняются более спиртовыносливыми дрожжами.
Saccharomyces oviformis - штрих-культура маслянистая, иногда ломкая, кремовая или коричневато-кремовая, обычно несколько приподнятая, гладкая, иногда со своеобразными складками, бородавчатая или неровная, блестящая или довольно тусклая. Край может быть цельным или волнообразным. Сбраживают и ассимилируют все сахара, кроме галактозы; не ассимилируют сорбозу, целлюлозу, ксилозу, рамнозу, декстрин, крахмал, инулин, арабинозу, инозит, маннит, сорбит, дульцит; ассимилируют уксусную кислоту и молочную кислоту. Благодаря высокой устойчивости к спирту содержание их непрерывно растет в ходе брожения, и они его завершают.
Saccharomyces rosei слабо ферментируют и ассимилируют все сахара, кроме галактозы и мальтозы; не ассимилируют сорбозу, мальтозу, целлобиозу, декстрин, крахмал, инулин, арабинозу, ксилозу, рамнозу, инозит, сорбит, дульцит, органические кислоты.
Эти дрожжи медленно и равномерно сбраживают сахар, образуя незначительные количества летучих кислот с массовой концентрацией от 0,05 до 0,15 г/куб. дм. Они образуют мало 2,3-бутиленгликоля, но в достаточном количестве - янтарную кислоту.
|
