Учебно-методический комплекс дисциплины «Промышленная микробиология»
|
Скачать 2.32 Mb.
|
|
Производство кормовых белковых продуктов. Как промышленный процесс, микробиологическое производство белка не требует посевных площадей, не зависит от климатических и погодных условий, поддается точному планированию и высокому уровню автоматизации, позволяет получать продукцию стандартного качества. Продукты микробиологического синтеза можно назвать своеобразными видами кормов и пищи, но неверно считать их синтетическими или искусственными. Разнообразие микроорганизмов и типов их питания позволяют микробиологический промышленности легко маневрировать в использовании различных видов сырья для биосинтеза. Получение белковых веществ – крупнейшее по тоннажу и важнейшее по значению производство микробиологической промышленности. Идею использования микроорганизмов как белковых компонентов в питании в 1980-х годах начал пропагандировать Дельбрюк, рекомендовавший применять для этой цели пивные дрожжи. Первое производство пищевых дрожжей на мелассе возникло в Германии в первую мировую войну. Нехватка белка в питании отрицательно сказывается на здоровье взрослого человека, понижает физическую и умственную работоспособность, а у детей замедляет физическое, а иногда и умственное развитие. При выращивании животных и птиц недостаток белка приводит к перерасходу корма, ухудшению здоровья животных. Главной характеристикой питательной ценности белка является сбалансированность его аминокислотного состава. На микробную биомассу, предназначенную для использования в качестве компонента корма или пищи, полностью распространяются ограничения, налагаемые на другие кормовые и пищевые добавки. Это относится к допустимым нормам содержания патогенных микроорганизмов, канцерогенов, токсинов, тяжелых металлов и т.д. Вместе с тем к микробной биомассе предъявляются специфические требования, связанные как с особенностями микроорганизмов вообще, так и с особенностями конкретной биомассы, обусловленными спецификой штамма и условий его выращивания. Нуклеиновые кислоты являются непременным компонентом клетки. В быстро растущих микроорганизмах их содержится больше, чм в клетках животных и растений. Входящие в состав нуклеиновых кислот пуриновые основания в организме животного превращаются в мочевую кислоту. У беспозвоночных, рыб, амфибий и многих млекопитающих, включая сельскохозяйственных животных превращение мочевой кислоты в более растворимый аллантоин катализуется ферментом уриказой. Поэтому даже довольно высокое содержание пуринов в корме практически не опасно для сельскохозяйственных животных. В организме человека уриказы мало, основной продукт катаболизма пуринов у человека – плохо растворимая мочевая кислота. Она выводится из организма в основном с мочой. Поэтому ВОЗ ввела рекомендации по ограничению употребления нуклеиновых кислот: не более 2 г в сутки. При более высоком потреблении этих кислот в плазме крови и в моче может повыситься содержание мочевой кислоты, а это увеличивает риск заболеть подагрой и привести к образованию камней в мочевыводящих путях у предрасположенных к этому людей. На содержание нуклеиновых кислот у микроорганизмов, особенно бактерий, значительное влияние оказывает скорость их роста: чем выше удельная скорость роста, тем больше в полученной биомассе нуклеиновых кислот и тем ниже отношение белок/нуклеиновые кислоты. Обычно 2 г нуклеиновых кислот содержится в 20-30г высушенной биомассы дрожжей или 10-20 г бактерий. Клетки могут быть освобождены от подавляющей части нуклеиновых кислот по методу так называемого теплового шока, вызывающего активизацию внутриклеточных РНКаз. По этому методу дрожжи в течение нескольких секунд подвергают действию высокой температуры, а затем выдерживают несколько часов при 50-550С. Другие способы снижения содержания нуклеиновых кислот в клетках основаны на применении экзогенных рибонуклеаз либо на обработке клеток растворами некоторых кислот, щелочей и метанолом. В липидах микроорганизмов встречаются компоненты, физиологическое действие которых на организм животного недостаточно изучено. У ряда бактерий широко распространен полимер β-оксимаслянной кислоты, безвредность которого исследована лишь частично. Содержание полимера может колебаться в очень широких пределах в зависимости от условий культивирования микроорганизмов. В липидах бактерий имеются циклопропановые кислоты, способные угнетать окисление жирных кислот в организме животного. Неблагоприятное воздействие биомассы водородных бактерий на организм человека частично связывается с наличием в их клетках С17-циклической кислоты. В клетках у некоторых бактерий обнаружены разветвленные жирные кислоты, которые могут нарушать обменные процессы микроорганизма. Все эти компоненты липидов отсутствуют в дрожжах. В этом отношении дрожжи не вызывают опасений. В стандартах на кормовые дрожжи, получаемые на углеводородах, содержатся ограничения и так называемые остаточные углеводороды. Эти разнообразные вещества одно время рассматривали как не свойственные биологическим объектам, попадающие в организм человека из нефти через посредство кормовых дрожжей и сельскохозяйственных животных. Для снижения содержания углеводородов в дрожжах разработаны специальные технологические приемы. Дрожжи, выращенные на дизельном топливе или нефтяных дистиллятах, должны быть подвергнуты глубокой экстрационной очистке органическими растворителями, а полученные на алканах, выдерживают в режиме голодания по органическому субстрату, а затем подвергают промывке. Некоторое количество углеводородов удаляется из дрожжей в процессе сушки. Для производства белка используют микроорганизмы, не вызывающие аллергических реакций у производственного персонала и не обладающие патогенными свойствами. При оценке штаммов дрожжей по этим показателям в качестве стандарта непатогенности используются пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Оценка показателей безвредности конкретной микробной биомассы дается на основании химических, санитарно-гигиенических, ветеринарно-зоотехнических и медико-биологических исследований. Анализу подвергаются как собственно кормовая добавка, так и пищевые продуктя животноводства, полученные при ее использовании. Белоксодержащие продукты, предназначенные непосредственно для питания человека, подвергаются более тщательному исследованию. Все это позволяет разработать технологии производства и способы применения белоксодержащих продуктов микробного происхождения, гарантирующие их полную безопасность для человека. Рациональный процесс выращивания осуществляют при лимитировании роста микроорганизмов кислородом или близко к такому лимитированию. Поэтому при рациональном проведении процесса выращивания, когда массообменная характеристика ферментера используется наиболее полно, скорость физиологической теплопродукции в ферментере постоянна, она не зависит от используемого органического субстрата и применяемого штамма микроорганизма. Описание принципиальной технологической схемы производства кормовых дрожжей: Выращенные клетки дрожжей отделяют от водной среды сепарированием, или фильтрованием, если используют мицелиальные грибы. Разработаны и другие методы отделения биомассы, например флотация, для концентрирования мелких бактериальных клеток. Их обычно промывают, концентрируют, после чего подвергают термической обработке при 80-900С, приводящей к отмиранию клеток. Полученную в результате такой обработки сметанообразную массу высушивают, используя, как правило, распылительные сушилки. После высушивания получают порошкообразный или хлопьевидный продукт, который можно подвергнуть гранулированию. Продукт упаковывают и направляют на комбикормовые заводы и другим потребителям. Такие белоксодержащие добавки микробного происхождения имеют то или иное коммерческое название в зависимости от применяемого органического сырья, штамма микроорганизма и особенностей технологии, используемой на различных предприятиях. Для микробиологического производства белковых веществ используются штаммы и процессы, не приводящие к образованию и накоплению в среде значительного количества органических продуктов метаболизма. Важнейшими обобщающими физиологическими характеристиками роста микроорганизмов являются его скорость и эффективность. Эффективность роста является технологическим показателем первостепенной важности и выражается через энергетический выход. Нет условий оптимальных для роста вообще, а есть условия оптимальные для скорости роста, и условия, оптимальные для эффективности роста. Локализация оптимума для этих двух характеристик может быть различной. При микробиологическом получении белка на любом конкретном субстрате важно, чтобы ферментер работал с наибольшей производительностью, т.е. его массообменная характеристика использовалась бы в максимальной мере. Вместе с тем избыток органического субстрата подавать в ферментер не целесообразно, так как он не будет использован, затруднит очистку сточных вод, а при выращивании микроорганизмов на углеводородах в избыточном количестве попадает в продукт. Процесс наращивания белковой биомассы лимитируется различными факторами, такими как
И описывается уравнениями материально-технического баланса. Эти уравнения сейчас разработаны в виде специальных компьютерных программ, которые помогают контролировать процесс производства на предприятии. Основные виды сырья и используемые микроорганизмы Гидролизаты растений. На гидролизатах растений основано производство кормовых дрожжей. Для этой цели используются гидролизаты древесины, подсолнечной и рисовой лузги, кукурузных кочерыжек, стеблей хлопчатника, богассы (жом, оставшийся после извлечения сахара из сахарного тростника) и других целлюлозосодержащих материалов. Сырье ежегодно возобновляется и, как правило, является отходами. К недостаткам гидролизно-дрожжевого производства относится сложность сбора и транспортировки сырья на предприятия. Список штаммов, используемых для производства кормовых дрожжей из гидролизатов растительного сырья, весьма обширен, он включает роды вида Candida и других родов (Trichosporon, Hansenula, Zygofabospora). Перспективно получение биомассы микроорганизмов на ферментативных гидролизатах целлюлозосодержащего сырья. Затруднением для промышленной реализации такого процесса является то, что в целлюлозосодержащем сырье имеется лигнин, препятствующий контакту целлюлоз с субстратом. Кроме того, сырье нуждается в обработке, позволяющей понизить содержание в нем кристаллической формы целлюлозы и преревести ее в аморфное состояние, после чего ферментативный гидролиз значительно ускоряется. Углеводород. Способности к утилизации углеводородов часто встречаются у представителей дрожжей, в первую очередь это род Candida, у представителей мицелиальных грибов (Aspergillus и Fusarium) у многих видов грибов семейсива Mucoraceae и разных бактерий. Для выделения быстро растущих микроорганизмов, не требующих добавления в среду для культивирования витаминов, используется метод элективных (избирательный метод) культур в сочетании с длительным непрерывным культивированием на среде с углеводородами при стабилизированных параметрах выращивания. Изучение роста различных микроорганизмов на углеводородах выявило ряд специфических особенностей, свойственных отдельным группам. Глубинное культивирование мицелиальных грибов на средах с углеводородами осложняется из-за слабого контакте мицелия и частиц углеводорода при перемешивании среды. Многие микобактерии при росте на средах с углеводородами покрываются воскообразной капсулой, способствующей агглютинации. В результате этого образуются сгустки клеток, достигающие нескольких миллиметров в диаметре. Токсичные компоненты, содержащиеся в липидах сапрофитных микобактерий, выращенных на н-алканах, не позволяют разрешить использование их биомассы в качестве кормовой добавки. Результаты исследования роста микроорганизмов на средах с метаном и другими газообразными углеводородами показывают, что такие субстраты могут оказаться перспективными для синтеза биомассы бактерий, хотя аппаратурно-приборное оформление культивирования отличается дополнительными сложностями. Перспективным признано культивирование на природном газе искусственных ассоциаций культур, состоящих из метаноторофной бактерии, растущей за счет окисления метана – основного компонента природного газа, и бактерии, растущей за счет использования этана, пропана, а также этанола и других метаболитов, выделяемых в среду метаноокисляющим видом. Сравнительная оценка твердых и жидких углеводородов как сырья для биосинтеза показала несомненное преимущество соединений, температура плавления которых значительно ниже температуры культивирования микроорганизмов. Все классы углеводородов могут служить субстратами для микроорганизмов, однако, как правило, процесс роста наиболее интенсивно происходит на среде, содержащей н-алканы с различной длиной цепи. Некоторые углеводороды, в особенности, имеющие длинные прямоцепочные радикалы, могут окисляться микроорганизмами, но процесс останавливается на определенной стадии и образовавшиеся продукты не используются в процессе роста. Поскольку трудно добиться полной переработки микроорганизмами ароматических полициклических углеводородов, для биосинтеза может быть использовано сырье, не содержащее их. Проникновение углеводородов в дрожжевые клетки через клеточные стенки осуществляется как по имеющимся в них порам, так и путем растворения в липидах стенок. Проникновение через клеточную мембрану, идет путем растворения углеводородов в ней с последующим перемещением по системе канальцев эндоплазматического ретикулума и связанного с ним вакуоллярного аппарата, а по некоторым данным (особенно в случае вязкой консистенции углеводорода) путем пиноцитоза. Наиболее распространенный путь окисления микроорганизмами н-алканов включает три основных этапа:
Теоретические и практические основы микробиологического получения бактериальных удобрений. Биологической альтернативой минеральным азотным удобрениям в сельском хозяйстве является биологическая фиксация молекулярного азота атмосферы. Как известно, азотные минеральные удобрения стали очень дорогими из-за сокращения добычи ископаемого топлива, а кроме того, в последнее время повышается общественно-политическая озабоченность возможностью химических загрязнений, в частности минеральным азотом, окружающей среды. Следовательно, внимание в настоящее время концентрируется на азотфиксации как альтернативе удобрениям. Широкие исследования по изучению механизмов азотфиксации и взаимодействия микроорганизмов и растений показали необходимость разработки и использования методов генной инженерии для создания новых азотфиксирующих систем, которые являлись бы основой высокоэффективных биопрепаратов нового поколения. Это биопрепараты комплексного действия — они улучшают питание растений (как за счет фиксации атмосферного азота, так и за счет более эффективного использования питательных элементов удобрений и почвы), стимулируют рост растений, подавляют развитие фитопатогенной микрофлоры. Эти достоинства ярко проявляются при сравнении с химическими препаратами — пестицидами. В целом ряде случаев обработка препаратами полностью заменяет химическое протравливание семян. Применение биопрепаратов повышает продуктивность растений, улучшает их качество за счет повышения содержания белка, крахмала, витаминов и других соединений, позволяет получить более раннюю продукцию, улучшает ее сохранность. Биопрепараты обладают широким спектром действия, но наибольшую эффективность они проявили на овощных и кормовых культурах. Кроме того, их использование позволяет снизить норму минеральных азотных удобрений, что положительно сказывается на уровне нитратов и нитритов в продукции. Для практического использования предложен бактериальный землеудобрительный препарат фосфоробактерин. Действующим началом в нем служит спороносная бактерия Bacillus megaterium, способная разрушать фосфорорганические соединения и переводить их в доступную для растений форму. В. megaterium легко образует споры, которые после размножения культуры смешивают с инертным наполнителем. В жизнеспособном состоянии споры могут сохраняться длительное время. Фосфоробактерин наносят на семена перед посевом. Предполагается, что в почве бактерии переходят на развивающуюся корневую систему растений. Здесь их размножение и биохимическая деятельность вызывают разложение органических соединений фосфора, что улучшает питание растений. Препарат оказывает положительное влияние на рост растений и увеличивает урожай примерно на 10%. Вместе с тем оказалось, что эффективность фосфоробактерина на почвах, удобренных суперфосфатом, не снижается, как это можно было ожидать, а, наоборот,часто возрастает. Установлено, что фосфоробактерин усиливает рост корневой системы растений. Это можно объяснить тем, что В. megaterium вырабатывает биологически активные вещества, среди которых имеются тиамин, пиридоксин, биотин, пантотеновая и никотиновая кислоты, витамин В12 и другие соединения. Эти вещества несколько усиливают рост растений на первых этапах развития. Для высвобождения калия из алюмосиликатов в целях улучшения питания растений В. Г. Александров предложил использовать препарат «силикатных» бактерий, который представляет собой спорообразующую культуру — Ваcillus muciaginsus vаr. Siliceous Разрушение алюмосиликатов происходит под влиянием разных кислот и даже диоксида углерода, образуемого микроорганизмами. Это неспецифический процесс. Гидролиз силикатов под влиянием, например СО2 (угольный кислоты), идет по следующей схеме: К2SiO3 + Н2СО3 = К2СО3 + Н2SiO3 = К2СО3 + Н2О + SiO2 Препарат «силикатных» бактерий применяют для бактеризации семян, так как предполагается, что при прорастании семян микроорганизм будет размножаться в ризосфере растений. Однако бациллы в зоне корней растений размножаются плохо, поэтому предложенную культуру нельзя признать удачной. В производственных опытах препарат «силикатных» бактерий дает небольшие и нестабильные прибавки урожая, поэтому он не получил широкого применения. Препарат АМБ предложен Н. М. Лазаревым для активации биодинамики окультуриваемых почв северной зоны. Готовят препарат на месте использования из измельченного низинного торфа или торфяной почвы. На 1 т торфа прибавляют 100 кг мелко раздробленного известняка, 2 кг фосфоритной мухи и 1 кг маточной культуры. Полученный компост увлажняют и выдерживают в теплом помещении при температуре около 20°С в течение трех недель, периодически перелопачивая. На 1 га вносят 0,5 т компоста. В состав маточной закваски препарата АМБ входит большой комплекс микроорганизмов (аммонификаторы, целлюлозоразлагающие микроорганизмы, автохтонная микрофлора и т. д.). Препарат целесообразнее применять в защищенном грунте. Однако в связи со сложностью изготовления широко его не используют. В настоящее время в сельском хозяйстве применяется целый ряд биопрепаратов, активизирующих почвенно-микробиологические процессы. Бактогумин — отселекционированный биопрепарат микроорганизмов комплексного действия. Биопрепарат предназначен для изготовления биологически активных: грунтов, используемых для выращивания овощных и цветочных культур в теплицах. Биологически активные грунты способствуют ускоренному разложению пестицидов, снижению их токсичности и оздоровлению грунтов за счет антагонизма микроорганизмов биопрепарата к фитопатогенам. Вамил — биоудобрение из отходов животноводческих комплексов. Бамил содержит значительное количество органического азота, фосфора, широкий набор микроэлементов. Основным исходным компонентом бами-ла является высушенная микробная биомасса, полученная при переработке животноводческих отходов. Бамил наиболее эффективен на овощных культурах в закрытом грунте, где он повышает урожай на 40—60%. При этом значительно улучшается качество продукции. Биотрон — комплексный биопрепарат почвенных микроорганизмов, применяемый пол овощные и плодовые культуры (производство США). Е-2001 — комплексный биопрепарат почвенных бактерий, применяемый поя овощные культуры (производство Греции). Производство вакцин, бактериофагов и медицинских препаратов. Вакцины. Под общим названием вакцины объединяют препараты, способствующие созданию активного иммунитета у людей и животных. Вакцины получают как из мамих патогенных микроорганизмов, так и используя продукты их жизнедеятельности. Первая вакцина была поллученаи в конце 18 века Э. Дженнером, котрый предложил прививки против оспы.Дальнейшее развитие учения о вакцинах связано с работами Л. Пастера. Вакцины делят на 4 группы: живые, убитые, анатоксины и химические вакцины. Этапы производства: накопление биомассы микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности; инактивация микроорганизмов; концентрация; очистка; лиофилизация, расфасовка. Вирусные препараты. В последнее время среди живых вакцин распространение получили вирусные препараты. Культивирование вирусов проводится на куринных, утинных, перепелинных эмбрионах либо в тканевых культурах. Вирусные препараты требуют особо тщательного соблюдения правил стерильности и строгой изоляции помещений от других видов работ. Для культивирования тканей используются питательные среды сложного состава. Накопление осуществляется в специальных сосудах и использованием приспособлений для вращения сосудов. При приготовлении вирусных вакцин проводится концентрация и очистка накопленной массы вируса путем сепарирования или стерилизующей фильтрации. После тщательного контроля вакцины расфасовываются. Вирусные вакцины могут быть и убитыми. Бактериофаги. Бактериофаг - ультрамикроскопический, внутриклеточный паразит - вирус, лизирующий бактерии и актиномицеты. Впервые явление бактериофагии наблюдал в 1898г. Н.Ф. Гамалея. Бактериофаг обладает всеми основными свойствами, присущими вирусам, а именно: 1)имеет элементарные частицы величиною в пределах от 20 до 200 нм; 2)содержит в своем составе нуклеиновую кислоту и белок; 3)не растет на искусственных питательных средах, размножаясь только внутри клеток микробов; 4)обладает высокой специфичностью в отношении поражаемой клетки; 5)имеет антигенную обособленность от клетки хозяина. Бактериофагу присуща наследственность, изменчивость, приспособляемость и другие свойства вирусов. Корпускулы бактериофагов имеют форму сперматозоидов или головастиков и состоят из сферической, цилиндрической или многогранной головки и короткого или длинного прямого или изогнутого отростка. Фаговая частица состоит из белковой оболочки и внутреннего содержимого, в основном представляющего собой фибриллы дезоксирибонуклеиновой кислоты. В отростке фаговой корпускулы имеется центрально расположенный стерженек белковой природы. На конце отросток имеет утолщение в виде пластинки, от которого отходят белковые нити диаметром не более 2 миллимикронов. В настоящее время описаны бактериофаги различных аэробных и анаэробных патогенных и сапрофитных бактерий (кокков, палочек, вибрионов, бацилл, микобактерий) и актиномицетов. Бактериофаг вступает в определенное взаимодействие с микробной клеткой. Это взаимодействие, называемое литическим циклом, включает следующие этапы: 1)адсорбция фаговых частиц на поверхности бактерий; 2)внедрение активного фагового материала внутрь клетки; 3)внутриклеточное размножение бактериофага; 4)разрыв клеточной оболочки и выход новообразованного бактериофага во внешнюю среду. Бактериофаги широко распространены в природе. Почти везде, где условия обитания благоприятны для размножения бактерий и актиномицетов, удается обнаружить паразитирующие в их клетках бактериофаги. Их можно выделить из открытых полостей организма человека и животных, различных водоемов, сточных вод, из влажной, унавоженной почвы, из соответствующих культур бактерий и актиномицетов. Много бактериофагов находится в выделениях больных людей и животных, особенно в период выздоровления от инфекционных заболеваний. Так, бактериофаги против возбудителей брюшного тифа, паратифов А и Б, дизентерии, холеры можно выделить из испражнений, против гноеродных кокков - из гнойного отделяемого ран и воспалительных очагов, против туберкулезной палочки - из мокроты и т.д. Большую роль в распространении и сохранении бактериофагов в природе играют так называемые лизогенные бактерии и актиномицеты, постоянно выделяющие бактериофаги во внешнюю среду. Для выделения бактериофага исследуемый материал (воду, испражнения, гноя, почву и др.) засевают в жидкую питательную среду, наиболее благоприятную для развития тех микроорганизмов, против которых ищут бактериофаг. Среду оставляют в термостате на 18-20 часов. Иногда производят предварительное обогащение среды чистой культурой соответствующего микроба, заведомо нелизогенного, т.е. не выделяющего бактериофаг. Помутневшую питательную среду пропускают через бумажный, а затем через бактериальный фильтр, асбестовые пластины, керамические свечи. Полученный фильтрат испытывают на присутствие бактериофага путем засева совместно с соответствующей микробной культурой на плотные (методом стекающей капли - проба Отто) или жидкие питательные среды. При наличии бактериофага после 18-часовой инкубации на поверхности агара, обнаруживается сплошной налет культуры, а на месте растекающейся, капли, в зависимости от содержания частиц бактериофага в фильтрате, бактериальный рост полностью отсутствует или наблюдаются округлые «стерильные пятна» - колонии бактериофага. На жидкой питательной среде присутствие бактериофага обусловливает просветление культуры. Для выделения чистой культуры бактериофага материал из развившегося отдельного стерильного пятна переносят бактериологической иглой в суспензию молодой микробной культуры. Для гарантии чистоты бактериофага операцию выделения из изолированного стерильного пятна последовательно повторяют 5-10 раз. Материал из последнего стерильного пятна снова засевают вместе с фагочувствительными микробами на жидкую питательную среду. После 6-18-часовой инкубации культуру фильтруют, проделывают несколько пассажей для увеличения количества бактериофаговых корпускул и получают чистую культуру бактериофага. Выделенный из внешней среды, бактериофаг, культивируемый в лабораторных условиях на соответствующей культуре бактерий, называется маточным штаммом соответствующего бактериофаг. В настоящее время выпускаются и применяются следующие виды бактериофагов: коли жидкий, коли-протейный жидкий и протейный жидкий бактериофаги, бактериофаг брюшнотифозный поливалентный (жидкий и сухой), диагностический брюшнотифозный бактериофаг, дизентерийный поливалентный лечебный (сухой) и диагностический бактериофаг, холерный бактериофаг, стафилококковые антифагин и диагностические типовые бактериофаги и стрептококковый жидкий бактериофаг Бактериофаг широко применяется для диагностики, профилактики и лечения ряда инфекционных заболеваний бактериальной этиологии - дизентерии, брюшного тифа, холеры, чумы, геморрагической септицемии, стафилококковых, стрептококковых и анаэробных инфекций и др. В связи с его высокой специфичностью он применяется также как диагностический препарат для идентификации бактериальных культур в медицинской, ветеринарной, технической микробиологии и фитопатологии. Метод фаготипажа, основанный на исключительной специфичности определенных штаммов бактериофага, позволил распределить на фаготипы ряд штаммов бактерий, которые неотличимы друг от друга по другим признакам. Фаготипаж с успехом применяется при идентификации бактерий брюшного тифа, сальмонелл, стафилококков и ряда других бактерий. Этот метод дает возможность эпидемиологу точно проследить за цепочкой заразных заболеваний и определить источник инфекции (бациллоноситель, больной). Известное диагностическое значение для клиники имеет выделение бактериофага из испражнений больного при некоторых кишечных инфекциях, в особенности при дизентерии. Важное значение имеет бактериофаг для быстрого обнаружения очень небольших количеств патогенных бактерий во внешней среде путем определения нарастания титра специфического бактериофага. Бактериофаг применяется и для борьбы с бактериальными вредителями различных технических брожений и в производстве ферментов, продуцируемых бактериальными культурами. В то же время бактериофаг, заражая культуры микробов, является опасным вредителем денных производственных штаммов микроорганизмов (вакцинных, возбудителей молочнокислого, ацетонобутилового и некоторых других брожений, продуцентов антибиотиков), вызывая серьезные нарушения технологического процесса. Бактериофаг - один из наиболее мощных факторов изменчивости бактерий и актиномицетов. Он играет определенную роль в самоочищении воды и почвы. Технология производства и контроль бактериофагов. В производственных условиях для изготовления препарата бактериофага применяются только апробированные штаммы бактериофагов и культуры соответствующих микробов, обладающих типичными морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами. Штаммы бактериофагов должны быть музейными и рабочими. На производстве они часто называются маточными бактериофагами. Музейные производственные штаммы бактериофагов ежегодно обновляются путем выделения новых или пассажами имеющихся штаммов бактериофага через организм больного, а также адаптацией к свежевыделенным, резистентным к данному бактериофагу культурам. Маточный бактериофаг должен размножаться и пассироваться только на соответствующей культуре в жидкой питательной среде, например, брюшнотифозный бактериофаг пассируется на культуре брюшнотифозной палочки в бульоне Мартена. Рабочий маточный бактериофаг готовится из очередной серии музейного штамма бактериофага, отдельно на каждом из производственных штаммов микробов. Препарат бактериофага представляет собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом. Он содержит большое количество размножившихся фагов, обладающих специфическими лизирующими свойствами. Получение бактериофага в настоящее время осуществляется в специальных аппаратах - реакторах, емкостью от 250 до 1000 л, с применением аэрации как фактора, стимулирующего развитие микроорганизмов. Для производства бактериофага берется его рабочая маточная раса и соответствующие культуры микробов. В реактор наливается жидкая питательная среда, например, бульон Мартена или Хоттингера для изготовления брюшнотифозного и дизентерийного бактериофагов с рН7,4-7,6 и стерилизуется при температуре 110°С в течение 40минут. После стерилизации среда охлаждается до 39°С и засеивается соответствующей микробной культурой и маточным бактериофагом одновременно. Для засева употребляются 18-часовые агаровые культуры, которые прибавляются из расчета 50млн. микробных тел на 1мл среды. Бактериофаг добавляется в количестве не более 0,3% по отношению к объему питательной среды. Среду с засеянными в ней культурой и бактериофагом оставляют при температуре 37°С на 6-18часов. Бактериофаги активно размножаются внутри бактериальных клеток, увеличиваясь в количестве и вызывая их лизис, что внешне проявляется полным просветлением среды. К полученному лизату добавляется в качестве консерванта хинозол (0,01%) или фенол (0,25%) и не позже чем через 2 часа после этого содержимое реактора фильтруется через бактериальные фильтры (асбестовые пластины, свечи Шамбеолена или свечи ГИКИ соответствующей пористости) для удаления оставшихся микробных клеток. Полученный препарат-бактериофаг должен иметь вид, совершенно прозрачной жидкости желтого цвета большей или меньшей интенсивности. Он проходит контроль на стерильность, безвредность и литическую активность, т.е. вирулентность. Стерильность бактериофага проверяют обычным способом. Безвредность препарата проверяют путем введения животным, например, брюшнотифозный и дизентерийный бактериофаги вводят подкожно трем мышам по 1мл, либо внутривенно одному кролику 5мл. Наблюдение за животными ведется в течение 3-4 суток; если препарат безвреден, они должны оставаться бодрыми и здоровыми. Литическая активность бактериофага, его вирулентность определяются методом титрования на жидкой и плотной питательной среде. Определение вирулентности методом Аппельмана проводится по следующей схеме: набирается ряд пробирок, содержащих по 4,5мл мясо-пептонного бульона; в первую из них добавляется бактериофаг в количестве 0,5 мл, тщательно перемешивается другой пипеткой и в количестве 0,5 мл переносится в следующую пробирку, из второй - 0,5мл в третью и т.д. В серии пробирок бактериофаг разводится 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. Во все пробирки, включая и контрольную, содержащую только 4,5 мл бульона, вносят по 250млн микробных тел суточной культуры соответствующих бактерий, затем ставят их на 18-20часов в термостат, после чего учитывают результат. Степень лизиса отмечается плюсами следующим образом: четыре плюса (++++) - абсолютная прозрачность среды, равная стерильному бульону; три плюса (+++) - почти полная прозрачность, лишь незначительно отличающаяся от стерильного бульона; два плюса (++) - муть, значительная по сравнению со стерильным бульоном, но незначительная по сравнению с контрольной пробиркой; один плюс (+) - явная муть, но все же более слабая, чем в контрольной пробирке, минус (-) - муть, как в контрольной пробирке. Определение вирулентности на плотной питательной среде методом Отто заключается в следующем: на определенные сегменты агаровых пластинок в бактериологических чашках, хорошо подсушенных в термостате и предварительно засеянных сплошным газоном соответствующей культуры, наносится по одной капле исследуемого бактериофага определенного разведения, соответствующего разведению в аппельмановском ряду. Капли подсушиваются и чашки помещаются в термостат на 18-20часов. Результат учитывается по степени лизиса и обозначается плюсами: четыре плюса (++++) - полный лизис; на месте закапывания бактериофага культура не растет; три плюса (+++) - лизис с наличием единичных колоний культуры; два плюса (++) - лизис в виде сливных участков с островками роста культуры; один плюс (+) - лизис в виде отдельных стерильных пятен на сплошном газоне культуры; минус (-) - сплошной рост культуры, не обнаруживается ни одного стерильного пятна. За титр бактериофага при определении методом Аппельмана принимают то наибольшее разведение его, которое вызывает полное растворение соответствующих микробов. Бактериофаги выпускают, с определенными титрами, не ниже установленных, по инструкции. Так, титр брюшнотифозного бактериофага со всеми штаммами, входящими в титрование, должен быть не ниже 10-7 для штаммов, находящихся в Vi-форме, и не ниже 10-6 для штаммов, находящихся в 0-форме. После проведения контролей бактериофаг разливается во флаконы нейтрального стекла (по 25, 50 и 100 мл), которые должны быть укупорены резиновой пробкой соответствующего размера и залиты смолкой. Условия хранения бактериофага такие же, как и других препаратов. Срок годности брюшнотифозного, холерного; гангренозного, стафилококкового и стрептококкового бактериофагов - один год, а дизентерийного - два года. Помимо жидких препаратов бактериофага могут изготавливаться также сухие. Для получения их, действующее начало жидкого фаголизата осаждается сернокислым аммонием. Выпавший осадок отделяется от жидкой части, к сырой массе добавляется в качестве стабилизатора глюконат кальция (9%), смесь тщательно растирается, замораживается при - 30°С и высушивается под вакуумом. Выпускается сухой фаг в виде таблеток, которые содержат стабилизированную субстанцию фаголизата, обычно применяемую таблеточную смесь (глюкозу, глюконат кальция, тальк, стеарин) и покрыты защитной кислотоустойчивой оболочкой из ацетилцеллюлозы. Одна таблетка cyxогo бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого. В отношении стерильности и безвредности к сухим бактериофагам предъявляются те же требования, что и к жидким. Титр сухих бактериофагов устанавливается в соответствии с их лизирующей активностью, по отношению к разным видам и типам микробов. Применяются они в тех же случаях, что и жидкие бактериофаги. Срок годности сухих фагов – 1 год. Бактериальные препараты, нормализующие микрофлору. Колибактерин. Сухой колибактерин представляет собой лиофилизированную живую культуру кишечной палочки Escherihia coli штамма M-17, расфасованную в ампулы, флаконы или таблетированную. Действующее начало колибактерина — живые клетки названного штамма, обладающие антагонистической активностью в отношения широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Основные этапы технологического процесса производства колибактерина складываются из работы со штаммом; в начале производственного цикла его восстанавливают из состояния анабиоза путем пассажей на жидких и твердых питательных средах. Для накопления биомассы применяют казеиновые питательные среды с содержанием аминного азота в пределах 200— 270 мг%, с добавлением 1,25—2,0% пищевого желатина. Накопление биомассы ведут в реакторах при 370C1 в условиях перемешивания и аэрации. Оптимальные значения pH среды в зависимости от используемого режима питания находятся в пределах 7,2—8,0. Продолжительность процесса выращивания культур составляет 6—7 ч. Получаемая культура содержит 35— 40 млрд. живых бактерий в 1 мл. Суспензию перед замораживанием разливают в стеклянные ампулы или замораживают без предварительной фасовки (для изготовления таблеток). При лиофилизации колибактерина к суспензии бактерий перед замораживанием добавляют 10% сахарозы. Обезвоживание замороженного субстрата производят в сублимационных камерных установках, обеспечивающих высокий вакуум (до 5 -10~~3 мм рт. ст.) и остаточную влажность конечного продукта на уровне 2—4%. Для таблетирования и приготовления других неампулирован-ных форм к сухому полуфабрикату добавляют лактозу (2%), тальк медицинский (до 2 %), стеарат кальция или магния (до 1 %). Колибактерин в таблетках или других готовых лекарственных формах фасуют в стеклянные флаконы или иную упаковку, обеспечивающую сохраняемость препарата без доступа воздуха и влаги. Доза сухого колибактерина должна содержать не менее 10 млрд. живых микробных клеток. Контроль колибактерина осуществляют поэтапно, в процессе производства полуфабриката и готовой продукции. Поскольку действующим началом колибактерина являются живые бактерии, основу контроля качества препарата составляют определение числа живых клеток в расчете на дозу и учет антагонистической активности к тест-штаммам возбудителей дизентерии Флекснера и Зонне, кроме этого в схему контроля входит определение остаточной влажности (не более 4—5%), агглютинабельности культуры специфической антисывороткой, определение безвредности на лабораторных животных, контроль на отсутствие постоянных микроорганизмов. Колибактерин применяют per os для лечения ряда кишечных заболеваний: 1) хронических колитов различной этиологии, в том числе постдизентерийных; 2) неспецифических язвенных колитов; 3) дисбактериозов, возникших в результате применения антибиотиков и сульфаниламидных препаратов. Кроме того, препарат применяется для санации реконвалесцентов при кишечных инфекциях. Ряд авторов оценивают колибактерин как эффективное профилактическое средство. Противопоказаний для применения колибактерина нет. Лактобактерин и бифидобактерин. В последнее время встает вопрос о необходимости расширения бактериотерапии не только применением препаратов из сапрофитных колиформ, но и молочнокислых бактерий. Последние имеют ряд существенных преимуществ. Во-первых, бифидобактерии и лактобактерии — симбионты макроорганизма с первых дней жизни. Это дает возможность использовать их для лечения и профилактики у детей в самом раннем возрасте. Во-вторых, молочнокислые бактерии относятся к кислоторезистентным организмам. Это обеспечивает их лучшую выживаемость при оральном применении. Бифидумбактерин и лактобактерии представляют собой лио-филизированные культуры соответствующих молочнокислых бактерий, расфасованные в ампулы, флаконы или таблетиро-ванные. Технология приготовления препаратов бифидо- и лактобактерина в принципе аналогична технологии приготовления колибактерина. Различия относятся к составу питательных сред и условиям культивирования в соответствии с физиологическими особенностями бактерий. Для работы с производственным штаммом бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum) и накопления биомассы используют питательные среды на основе печеночного бульона с добавлением хлорида натрия, пептона и лактозы. Для лиофилизации препарата применяют сахарозо-желатиновую смесь с добавлением обезжиренного молока (30—40%). Доза сухого бифидумбактерина при выпуске содержит 10й—10 живых клеток бактерий. Флаконы с сухим бифидумбактерином содержат 5 доз. Контроль готового препарата проводится на содержание живых микробных клеток, на отсутствие посторонних микроорганизмов, проверяется антагонистическая активность препарата по отношению к дизентерийным тест-штаммам Флекснера и Зонне. Бифидумбактерин назначают детям и взрослым для лечения хронических колитов, кишечных расстройств невыясненной этиологии, дисбактериозов, возникших в результате применения антибиотиков. Особенно рекомендуется бифидумбактерин детям первого полугода жизни. Производственные штаммы молочнокислых бактерий (Lactobacillus fermenti и L. plantarum) обладают высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей дизентерии, патогенных энтеробактерий и условно-патогенных микроорганизмов (гемолитического стафилококка, протея и др.). Антагонистическая активность, по-видимому, в большой степени связана с действием молочной кислоты, накапливающейся при сбраживании бактериями лактозы и других углеводов. Молочная кислота участвует в кальциевом обмене, переводя кальций пищи в усваиваемый макроорганизмом лактат кальция, способствуя профилактике рахита у детей. Молочнокислые бактерии участвуют в образовании витаминов и аминокислот, в том числе так называемых незаменимых, т. е. не синтезируемых организмом человека. Выгодным отличием молочнокислых бактерий является устойчивость к антибиотикам. Это позволяет применять их с профилактической целью параллельно с антибиотикотерапией. Выращиваются молочнокислые бактерии на питательных средах, приготовленных на основе гидролизата молока, солодового экстракта или капустного отвара с добавлением 1,5% желатины глубинным методом с перемешиванием, но без аэрации, при 37° С. Пробы из реактора берут под давлением азота. В процессе культивирования добавляют раствор глюкозы или лактозы. За 8—10 ч культивирования получают микробные взвеси, содержащие 10—15 млрд. живых бактерий в 1 мл. Перед лиофилизацией в суспензию бактерий добавляют в качестве стабилизатора сахарозу, пептон и обрат молока в количестве 5—10%. Ампулы с сухим препаратом запаивают под вакуумом, флаконы укупоривают в атмосфере инертного газа. Одна доза сухого лактобактерина содержит 6—7 млрд. живых клеток бактерий. В ампулах может содержаться 1—3 дозы, во флаконах — до 20 доз. При контроле готового препарата учитывают содержание живых лактобактерий и осуществляют бактериологический контроль его чистоты. Кроме того, препарат должен быть безвреден и иметь остаточную влажность не более 4%. Контролируется также антагонистическая активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Микробные препараты, нормализирующие нормальную микрофлору, в отличие от многих химиотерапевтических средств физиологичны и не дают никаких побочных явлений. Бактериальные средства защиты растений. Технологии производства биопрепаратов, энтомофагов и биологически активных веществ – прогрессивная и наукоемкая отрасль современной биотехнологии. Проблему защиты растений от вредных организмов на современном этапе развития человечества можно решить созданием и применением биологических средств защиты растений (биопрепаратов, энтомофагов и биологически активных веществ), используя методы микробиологии, биохимии и технической энтомологии. Основу биологических средств защиты растений от вредителей, болезней и сорняков составляют существующие в природе микроорганизмы и насекомые, а также вещества, выделяемые ими. Их применение не наносит ущерба окружающей среде. Многолетний опыт применения биологических средств защиты растений, полученных при помощи современных технологий производства, свидетельствует не только о высокой экологической безопасности этих средств, но и экономической эффективности, приближающейся, а иногда и превышающей соответствующие показатели при использовании химических пестицидов. В биологической защите растений используются биопрепараты, производство которых осуществляется биотехнологическими методами в условиях крупных и мелкотоннажных производств. Так, препараты против вредителей сельскохозяйственных (овощных, плодовых, лесных) культур создаются на основе энтомопатогенов, являющихся элементами природного биоценоза. В зависимости от природы их разделяют на вирусные, микроспоридиальные, бактериальные, грибные и др. Основой вирусных энтомопатогенных препаратов ( |
Похожие:
 |
Учебно-методический комплекс дисциплины «Микробиология» Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Морская микробиология» Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
 |
Учебно-методический комплекс дисциплины «организационное поведение» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Торговое оборудование» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Русский язык и культура речи» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Системное программное обеспечение» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины обсужден на заседании кафедры... Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины архитектура ЭВМ 090104. 65... Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «коммерческое право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Таможенное право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «римское право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «иностранный язык по специальности» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Технология формирования имиджа» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «защита прав потребителей» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |